Oct-4、SOX2和KPNA2在三陰性乳腺癌中的表達(dá)及其臨床意義

趙士鋒，王數(shù)，馮林，李蔚然，姚佳奇，陶雅軍

（大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院 病理學(xué)教研室，遼寧 大連 116622）

乳腺癌是一類在分子水平上具有高度異質(zhì)性的疾病。2000年，Perou等[1]對(duì)乳腺癌的基因表達(dá)進(jìn)行研究，將乳腺癌分成luminal A型（ER+Her-2-）、luminal B型（ER+Her-2+）、ER-/Her-2+型、basal-like型（ER-Her-2-）及normal breast-like型等。在basal-like型乳腺癌中ER-PR-及Her-2無(wú)過(guò)表達(dá)亞型被稱為三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC），約占全部乳腺癌的20%左右[2]，其侵襲性強(qiáng)，轉(zhuǎn)移早、復(fù)發(fā)率高、耐藥且患者預(yù)后較差等生物學(xué)特點(diǎn)與癌癥干細(xì)胞性腫瘤相符，且有研究發(fā)現(xiàn)在TNBC組織中活化的癌癥干細(xì)胞數(shù)量明顯增高，故被稱為干細(xì)胞性乳腺癌[3]，但在TNBC中癌癥干細(xì)胞活化的機(jī)制迄今還不清楚。

Oct-4（octamer-binding transcription factor 4）和SOX2（sex determining region Y-box 2）均為核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎干細(xì)胞和多能性細(xì)胞中均高表達(dá)，兩者可形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體精確調(diào)控細(xì)胞的多潛能狀態(tài)[4]。隨著細(xì)胞分化Oct-4和SOX2的表達(dá)明顯下降，但在腫瘤細(xì)胞中兩者的表達(dá)均升高并與多種腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移以及化療后的復(fù)發(fā)密切相關(guān)[5-6]。KPNA2（karyopherin A2，又名Importin α1）是核運(yùn)輸信號(hào)超家族中的一員，該家族分子作為運(yùn)載工具幫助mRNA、DNA和RNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄因子等進(jìn)出細(xì)胞核，從而在細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育、凋亡、遷移及DNA損傷應(yīng)答等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7]。本研究擬通過(guò)了解在TNBC組織中Oct-4、SOX2和KPNA2的表達(dá)及與TNBC臨床病理因素的關(guān)系，探討TNBC的惡性進(jìn)展機(jī)制，為尋求有效抑制TNBC細(xì)胞生長(zhǎng)的治療靶點(diǎn)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床標(biāo)本 30例TNBC和30例非TNBC組織石蠟標(biāo)本均采集自2008年5月—2014年12月大連市中心醫(yī)院病理科存檔標(biāo)本，患者術(shù)前均未接受放療、化療、激素或免疫治療，病理類型均為浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌。收集患者年齡、腫塊體積、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無(wú)脈管內(nèi)癌栓、臨床分期、生存期等臨床病理資料，隨訪方式主要采取電話隨訪，30例TNBC患者的中位隨訪時(shí)間為37（12～62）個(gè)月。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 Oct4（ab19857）、SOX2（ab97959）和KPNA2（ab84440）兔抗人多克隆抗體均購(gòu)自Abcam公司，工作濃度均為1:100。SP廣譜超敏試劑盒、DAB酶底物顯色劑等均購(gòu)于福建邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學(xué)方法 免疫組化SP法及DAB顯色操作步驟均按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。以已知陽(yáng)性的大腸癌組織切片作為Oct-4和SOX2的陽(yáng)性對(duì)照，子宮內(nèi)膜癌組織切片作為KPNA2的陽(yáng)性對(duì)照，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.2.2 結(jié)果判定 組織免疫組化染色結(jié)果由2名具有高級(jí)職稱的病理醫(yī)師獨(dú)立進(jìn)行等級(jí)評(píng)定，采用半定量法[8-9]，根據(jù)染色密度（陰性=0，弱陽(yáng)性=1，中度陽(yáng)性=2，強(qiáng)陽(yáng)性=3）和陽(yáng)性細(xì)胞百分比（0： 陰性，1：＜25%，2：25%～50%，3：51%～75%，4：＞75%）的乘積計(jì)算 5個(gè)高倍視野的免疫反應(yīng)評(píng)分（immuno-reactive score，IRS）。最后結(jié)果：陰性（IRS=0）：（-），弱陽(yáng)性（IRS=1～4）：（+），中度陽(yáng)性（IRS=5～8）：（++），強(qiáng)陽(yáng)性（IRS=9～12）：（+++）；≥1分為陽(yáng)性，0分為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn) ，雙變量Spearman相關(guān)分 析，Kaplan-Meier法繪制生存曲線并經(jīng)Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)。生存時(shí)間以月計(jì)算，自手術(shù)當(dāng)天起開(kāi)始計(jì)算生存時(shí)間，患者死亡或失訪定為隨訪結(jié)束點(diǎn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Oct-4、SOX2和KPNA2在TNBC組織中的表達(dá)

O c t-4和S O X 2蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞核，KPNA2蛋白在胞漿與胞核均可見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)（圖1）。在T N B C和非T N B C組織中O c t-4的陽(yáng)性表達(dá)率分別為86.7%（26/30）和73.3%（22/30）（χ2=9.903，P=0.019），SOX2的陽(yáng)性表達(dá)率分別為90.0%（27/30）和73.3%（22/30）（χ2=7.960，P=0.047），組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；KPNA2的表達(dá)在兩種癌組織中無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（χ2=4.190，P=0.242）（表1）。

2.2 TNBC組織中Oct-4、SOX2和KPNA2表達(dá)的相關(guān)性

Spearman秩相關(guān)分析提示在TNBC中Oct-4和SOX2的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.680，P＜0.0001），Oct-4和KPNA2的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.581，P=0.0008），SOX2和KPNA2的表達(dá)亦呈正相關(guān)（r=0.770，P＜0.0001）（圖2）。

圖1 免疫組化檢測(cè)（×200） A：Oct-4；B：SOX2；C：KPNA2；D：陰性對(duì)照Figure 1 Immunohistochemical staining (×200) A: Oct-4; B: SOX2; C: KPNA2; D: Negative control

表1 Oct-4、SOX2和KPNA2在TNBC和非TNBC組織中的表達(dá)[n=30，n（%）]Table 1 Oct-4,SOX2 and KPNA2 expressions in TNBC and non-TNBC tissues [n=30,n (%)]

圖2 Spearman秩相關(guān)分析Figure 2 Spearman’s rank correlation analysis

2.3 Oct-4、SOX2和 KPNA2的表達(dá)與TNBC臨床病理因素的關(guān)系

病理分期依據(jù)A J C C標(biāo)準(zhǔn)[10]。在T N B C組織中，Oct-4的表達(dá)與患者年齡（χ2=5.411，P=0.02）、組織學(xué)分級(jí)（χ2=6.410，P=0.041）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2=7.577，P=0.006）和TNM分期（χ2=13.986，P=0.007）均有關(guān)，與腫瘤大小、脈管內(nèi)有無(wú)癌栓均無(wú)關(guān)（均P＞0.05）；SOX2的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2=11.877，P=0.001）和TNM分期（χ2=13.293，P=0.01）均有關(guān)，與患者年齡、腫瘤大小、組織學(xué)分級(jí)、脈管內(nèi)有無(wú)癌栓均無(wú)關(guān)（均P＞0.05）；KPNA2的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（χ2=4.460，P=0.035），與其他臨床病理因素均無(wú)關(guān)（均P＞0.05）（表2）。

表2 Oct-4、SOX2和KPNA2 表達(dá)與TNBC患者臨床病理因素的關(guān)系[n（%）]Table 2 Relations of Oct-4,SOX2 and KPNA2 expressions with clinicopathologic variables of TNBC patients [n (%)]

2.4 Oct-4、SOX2和 KPNA2的表達(dá)與TNBC患者術(shù)后生存時(shí)間的關(guān)系

隨訪30例TNBC患者，隨訪時(shí)間12～62個(gè)月。Oct-4陽(yáng)性和陰性患者術(shù)后中位生存時(shí)間分別為27、57個(gè)月，SOX2陽(yáng)性和陰性患者術(shù)后中位生存時(shí)間分別為29、60個(gè)月，KPNA2陽(yáng)性和陰性患者術(shù)后中位生存時(shí)間分別為25、57個(gè)月。Kaplan-Meier生存曲線亦顯示隨著Oct-4、SOX2和KPNA2表達(dá)的增強(qiáng)，患者術(shù)后生存率均明顯下降（χ2=14.12，P=0.0027；χ2=16.16，P=0.0011；χ2=12.29，P=0.0021）（圖3）。

圖3 不同Oct-4、SOX2和KPNA2表達(dá)狀態(tài)TNBC患者的生存曲線Figure 3 The survival curves of TNBC patients with diff erent Oct-4,SOX2 or KPNA2 expression statuses

3 討 論

TNBC作為干細(xì)胞性腫瘤其高復(fù)發(fā)率、耐藥以及易轉(zhuǎn)移的特性是患者預(yù)后差的主要因素，目前臨床上對(duì)于TNBC尚無(wú)有效治療措施。在TNBC組織中癌癥干細(xì)胞的激活機(jī)制尚不清楚，如何靶向抑制TNBC的惡性進(jìn)展成為目前TNBC治療的難題和關(guān)鍵，因此研究TNBC的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移等的相關(guān)分子機(jī)制，具有重要的臨床意義。

Oct-4由Pou5F1基因編碼產(chǎn)生，定位于人類染色體6p21.3。Oct-4分子中的一個(gè)非常保守的DNA結(jié)合域-POU（Pit-Oct-Unc）結(jié)合域具有細(xì)胞特異激活作用，可特異性識(shí)別靶基因增強(qiáng)子或啟動(dòng)子區(qū)域的八聚體基序ATGCAAAT從而調(diào)控下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[11]。Oct-4的表達(dá)與胚胎干細(xì)胞的多能性有關(guān)，是哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)生早期的重要調(diào)控因子。隨著細(xì)胞分化，Oct-4在細(xì)胞中的表達(dá)逐漸下降，但在多種類型的癌癥干細(xì)胞如前列腺癌干細(xì)胞、乳腺癌干細(xì)胞和p53-/-鼠腫瘤模型的腫瘤起始細(xì)胞以及化療后復(fù)發(fā)的腫瘤組織中均見(jiàn)Oct-4的高表達(dá)[12-14]，說(shuō)明Oct-4在癌癥干細(xì)胞的多潛能性維持和自我更新中發(fā)揮重要作用，但機(jī)制不清，可能是在腫瘤干細(xì)胞中基因表達(dá)重新編程的結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)，在TNBC組織中Oct-4的表達(dá)明顯高于非TNBC組織，考慮其可能與TNBC的發(fā)生及組織內(nèi)癌癥干細(xì)胞過(guò)度活化有關(guān)。此外，本研究發(fā)現(xiàn)Oct-4的表達(dá)與患者的年齡、組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期和生存期等臨床病理因素均有關(guān)，提示Oct-4可以視為TNBC惡性進(jìn)展的重要輔助診斷因子。

轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子SOX是維持胚胎內(nèi)穩(wěn)態(tài)和成年體細(xì)胞中干細(xì)胞干性的重要因子。該轉(zhuǎn)錄因子家族有8個(gè)亞群（從A到H）約20個(gè)分子，均含有保守的高遷移率族蛋白DNA結(jié)合區(qū)域，SOX2屬于SOXB1亞群（該亞群成員還有SOX1和SOX3）[15]。研究已證實(shí)SOX2基因擴(kuò)增可誘導(dǎo)癌癥干細(xì)胞的活化和自我更新促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展，SOX2過(guò)表達(dá)可引起食道癌、卵巢癌、肺癌、皮膚癌等惡性腫瘤[5,16-18]，而抑制SOX2的表達(dá)可抑制惡性膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的更新從而降低惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲能力[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，SOX2在TNBC中的表達(dá)明顯高于其在非TNBC中的表達(dá)，提示其亦可能與TNBC的發(fā)生及組織內(nèi)癌癥干細(xì)胞過(guò)度活化有關(guān)。在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的TNBC組織中SOX2的表達(dá)明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的TNBC組織，且其表達(dá)隨著TNM分期的增高而增強(qiáng)，提示SOX2可以促進(jìn)TNBC的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和侵襲，而淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和侵襲能力的增加往往是導(dǎo)致臨床治療失敗的主要原因，SOX2的表達(dá)增強(qiáng)與患者的生存期縮短明顯相關(guān)，這些結(jié)果提示SOX2亦可被視為TNBC惡性進(jìn)展的重要輔助診斷因子。目前認(rèn)為Oct-4和SOX2可形成復(fù)合體，通過(guò)識(shí)別DNA順式作用元件共同啟動(dòng)干細(xì)胞的重新編程從而調(diào)控干細(xì)胞的多潛能性[20]。本研究發(fā)現(xiàn)Oct-4和SOX2的表達(dá)呈正相關(guān)，從組織學(xué)上證實(shí)兩者在TNBC的惡性進(jìn)展過(guò)程中可能發(fā)揮協(xié)同作用。

為確保細(xì)胞準(zhǔn)確行使其各項(xiàng)功能，決定細(xì)胞功能與命運(yùn)的mRNA和轉(zhuǎn)錄因子等大分子物質(zhì)（＞50 kDa）的空間定位需要被精細(xì)調(diào)控。核運(yùn)輸?shù)鞍譏mportins（又名Karyopherin，KPN）通過(guò)識(shí)別這些大分子的核定位信號(hào)（nuclear localization signal，NLS）幫助它們通過(guò)核膜上的核孔復(fù)合體進(jìn)出細(xì)胞核，從而在細(xì)胞增殖、分化等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[21-22]。KPNA是KPN的主要亞型，目前在人類細(xì)胞中已鑒定出7個(gè)KPNA成員（KPNA1-7）[23]。關(guān)于KPNA在細(xì)胞癌變過(guò)程中的作用機(jī)制還不清楚，但目前的研究結(jié)果表明，KPNA家族分子的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化或過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致其運(yùn)輸?shù)呢浳锓肿釉诎嘶虬麧{重新分布。有報(bào)道KPNA2參與多種腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子如E2F1、c-myc和cyclinD1 等的入核轉(zhuǎn)運(yùn)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖[24-26]，KPNA2還可通過(guò)影響p53的核運(yùn)輸及胞漿中的定位，促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)基因的表達(dá)而誘導(dǎo)乳腺癌的發(fā)生[27]。本研究發(fā)現(xiàn)KPNA2的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和生存期均相關(guān)，提示KPNA2的表達(dá)可影響TNBC患者的預(yù)后。此外KPNA2與Oct-4、KPNA2與SOX2的表達(dá)均呈正相關(guān)，推測(cè)KPNA2可能通過(guò)促進(jìn)Oct-4和SOX2的入核轉(zhuǎn)運(yùn)從而促進(jìn)TNBC的惡性發(fā)展，但KPNA2是直接與Oct-4和SOX2相互作用還是通過(guò)其他因子間接與Oct-4和SOX2相互作用還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，Oct-4、SOX2在TNBC組織中的表達(dá)增加，與TNBC的發(fā)展、侵襲密切相關(guān)。Oct-4、SOX2和KPNA2均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和生存期有關(guān)，提示三者可作為TNBC患者預(yù)后的重要參考指標(biāo)。Oct-4、SOX2和KPNA2的表達(dá)彼此相關(guān)，提示TNBC的惡性進(jìn)展可能是三者共同作用的結(jié)果。Oct-4、SOX2和KPNA2可作為抑制TNBC細(xì)胞生長(zhǎng)的治療靶點(diǎn)，但它們精確的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入探索。

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