下調(diào)星形細(xì)胞上調(diào)基因1表達(dá)對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響

常亮，戶莊，周振宇，付傳恒，馬明德，林旭紅

（河南大學(xué)淮河醫(yī)院 甲狀腺乳腺外科，河南 開封 475000）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一[1]，嚴(yán)重影響女性的身心健康，同時(shí)也給家庭及社會(huì)造成了比較大的危害。乳腺癌的發(fā)病因素很多，其中激素水平、遺傳因素、居民生活習(xí)慣、食物內(nèi)激素含量增加以及相關(guān)體內(nèi)基因的變化與其密切相關(guān)。其主要牽涉到機(jī)體異常細(xì)胞的不可控的增長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，這其中涉及到很多與腫瘤相關(guān)基因的分子水平的變化[2-5]。因而從某程度上來說，尋找新的腫瘤治療的分子靶點(diǎn)及開發(fā)分子靶向藥物顯得極為重要。星形細(xì)胞上調(diào)基因1（astrocyte elevated gene 1，AEG-1）在人類編碼582個(gè)氨基酸，這些氨基酸序列在脊椎動(dòng)物中是高度保守的，在調(diào)控不同的生理、病理過程中發(fā)揮顯著的作用[2]，特別是其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮極其重要的作用。因此本研究通過觀察AEG-1表達(dá)下調(diào)對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡能力的影響，初步了解其在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中所發(fā)揮的作用及相關(guān)分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與細(xì)胞株

AEG-1、caspase-3、caspase-9、β-actin兔抗人多克隆抗體、A E G-1 s i R N A、陰性對(duì)照siRNA、購(gòu)自Santa Cruz公司。脂質(zhì)體購(gòu)自Invitrogen公司。MCF-7細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所細(xì)胞庫(kù)。其他常用劑由河南大學(xué)病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞分組 空白對(duì)照組：未轉(zhuǎn)染的乳腺癌MCF-7細(xì)胞；陰性對(duì)照組：用陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞；AEG-1 siRNA組：利用AEG-1siRNA轉(zhuǎn)染的MCF-7細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與基因轉(zhuǎn)染 將液氮中凍存的MCF-7細(xì)胞加入RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37 ℃，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)進(jìn)行復(fù)蘇后消化。中止消化后將培養(yǎng)瓶置于CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期可以進(jìn)行相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染的前1 d，將一定數(shù)量的MCF-7細(xì)胞接種在RPMI-1640培養(yǎng)基中，當(dāng)細(xì)胞的融合度達(dá)到85%～95%左右時(shí)，進(jìn)行轉(zhuǎn)染。按試劑盒說明制備siRNA和脂質(zhì)體的混合物，并加入培養(yǎng)板中，在培養(yǎng)箱中孵育6 h后更換培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染后48 h進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡 收集轉(zhuǎn)染48 h的3組乳腺癌MCF-7細(xì)胞至10 mL的離心管中，每組的細(xì)胞數(shù)大約為（1～5）×106/mL，然后于1 000r/min的條件下離心、洗滌，于1 000r/min離心5 min，于室溫下避光孵育10～15 min，于1 000r/min離心5 min以沉淀MCF-7細(xì)胞，并采用孵育緩沖液漂洗1次。加入熒光（SA-FLOUS）溶液于4 ℃條件下避光孵育20 min后，進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析檢測(cè)。

1.2.4 Western blot 收集轉(zhuǎn)染后48 h的3組乳腺癌MCF-7細(xì)胞。采用細(xì)胞裂解緩沖液提取總蛋白采用Bradford法測(cè)定蛋白濃度。計(jì)算上樣量后電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉2 h。分別加一抗（AEG-1、caspase-3、caspase-9、β-actin）于含5%脫脂奶粉的洗滌緩沖液中，4 ℃過夜。第2天用洗滌緩沖液洗5 min×3次，分別加合適的二抗作用2 h，洗5 min×3次，然后曝光。將膠片進(jìn)行拍照后，采用Gene Tools軟件進(jìn)行灰度值分析，計(jì)算蛋白的相對(duì)表達(dá)量，公式為：蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白的表達(dá)量/內(nèi)參蛋白的表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有結(jié)果采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩組數(shù)據(jù)間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組數(shù)據(jù)及以上行單因素方差分析（One-way ANOVA）；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 AEG-1 siRNA干擾效果

Western blot檢測(cè)3組乳腺癌MCF-7細(xì)胞中AEG-1蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明，AEG-1 siRNA組中AEG-1蛋白的表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（均P＜0.05），而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組之間相比，AEG-1蛋白的表達(dá)無差異（P＞0.05）（圖1）。提示AEG-1 siRNA能有效下調(diào)乳腺癌MCF-7中AEG-1蛋白的表達(dá)。

圖1 Western blot檢測(cè)AEG-1蛋白表達(dá)Figure 1 Western blot analysis of AEG-1 protein expression

2.2 AEG-1表達(dá)下調(diào)對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡的影響

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)3組乳腺癌MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，結(jié)果顯示，AEG-1 siRNA組中乳腺癌MCF-7細(xì)胞的早期、晚期凋亡率明顯高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（均P＜0.05），而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組之間乳腺癌MCF-7細(xì)胞的早期、晚期凋亡率均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）（圖2）。為了進(jìn)一步分析AEG-1 siRNA引發(fā)的乳腺癌MCF-7細(xì)胞的可能的分子機(jī)制，采用Western blot技術(shù)分析轉(zhuǎn)染AEG-1 siRNA和對(duì)照siRNA前后細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspase-3和caspase-9的表達(dá)。結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，AEG-1 siRNA組中乳腺癌MCF-7細(xì)胞的caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)均明顯上調(diào)（均P＜0.05），而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組之間caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＞0.05）（圖3）。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胞凋亡情況Figure 2 Flow cytometry analysis of cell apoptosis

圖3 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞caspase-3和caspase-9蛋白的表達(dá)Figure 3 Western blot analysis of expressions of caspase-3 and caspase-9

3 討 論

積累的證據(jù)已經(jīng)表明AEG-1在調(diào)控不同的生理、病理過程中發(fā)揮顯著的作用，特別是其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮極其重要的作用；與AEG-1在許多不同的惡性腫瘤中的作用一致，最近在許多腫瘤的臨床研究中將AEG-1與腫瘤的進(jìn)展和臨床較差的預(yù)后密切聯(lián)系在一起，提示AEG-1可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及進(jìn)展中發(fā)揮及其重要的作用[6]。研究顯示，AEG-1在多種不同的腫瘤中表達(dá)上調(diào)，包括：涎腺癌[7]、頭頸部腫瘤[8-9]、膽囊癌[10]、卵巢癌[11-12]、非小細(xì)胞肺癌[13-14]、子宮內(nèi)膜癌[15]、子宮頸癌[16-17]和肝癌[18]等。還有研究[19-22]證明，AEG-1在大多數(shù)正常的人類乳腺組織中低表達(dá)或缺失，但在許多乳腺癌細(xì)胞系或乳腺癌組織中呈現(xiàn)高表達(dá)?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，究竟AEG-1在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中怎樣發(fā)揮作用，其機(jī)制是什么，是否能應(yīng)用于臨床乳腺癌的治療，目前國(guó)內(nèi)研究尚少。當(dāng)前興起的RNA干擾技術(shù)是體內(nèi)外研究基因功能較為理想的技術(shù)手段之一，許多研究[23-24]表明RNA干擾對(duì)于抑制腫瘤細(xì)胞中的癌基因的過度表達(dá)發(fā)揮重要作用，可能成為治療腫瘤的一種新的手段和措施。因此上述研究表明，AEG-1在乳腺癌MCF-7細(xì)胞中高水平表達(dá)。在本研究中，將特異性的AEG-1 siRNA轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7細(xì)胞，采用Western blot技術(shù)研究乳腺癌MCF-7細(xì)胞中AEG-1蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染AEG-1siRNA后乳腺癌MCF-7細(xì)胞中AEG-1蛋白表達(dá)均顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P＜0.05），而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組之間相比，AEG-1蛋白表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），這一結(jié)果提示AEG-1 siRNA能明顯下調(diào)乳腺癌MCF-7細(xì)胞中AEG-1蛋白的表達(dá)。有研究[25]顯示沉默乳腺癌細(xì)胞MCF-7的AEG-1表達(dá)量，可以有效地抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的能力。該研究表明，AEG-1在乳腺癌的腫瘤的生長(zhǎng)、局部擴(kuò)散、組織浸潤(rùn)等過程中都發(fā)揮著重要作用；通過靶向沉默AEG-1，可以有效地抑制原發(fā)灶乳腺癌的生長(zhǎng)和擴(kuò)散。沉默乳腺癌細(xì)胞MCF-7的AEG-1表達(dá)量是否對(duì)乳腺癌細(xì)胞其他生物學(xué)行為同樣存在影響，國(guó)內(nèi)研究較少。

在其它的模型中，AEG-1也被證實(shí)抑制細(xì)胞凋亡，主要通過激活PI3K/AKT信號(hào)途徑上調(diào)凋亡抑制基因的表達(dá)[26]。在正常星形細(xì)胞和纖維組織母細(xì)胞中AEG-1過表達(dá)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[27]。當(dāng)一組信號(hào)通路特異性的抑制劑被用來檢測(cè)AEG-1前生存功能的下游調(diào)節(jié)子時(shí)，僅PI3K抑制劑LY294002、P T E N和顯性負(fù)相A k t在無血清條件下能減弱AEG-1依賴的生存[28]。是否AEG-1表達(dá)下調(diào)能誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞發(fā)生凋亡呢？在本研究中，采用流式細(xì)胞術(shù)分析轉(zhuǎn)染AEG-1 siRNA和對(duì)照siRNA前后乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AEG-1 siRNA組中乳腺癌MCF-7細(xì)胞的凋亡率明顯高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P＜0.05），而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組之間，乳腺癌MCF-7細(xì)胞的凋亡率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），這一結(jié)果表明AEG-1表達(dá)下調(diào)能明顯誘導(dǎo)乳腺癌MCF-7細(xì)胞發(fā)生凋亡。而凋亡效應(yīng)分子caspase-3位于凋亡通路樞紐地位，caspase-3活化能引起細(xì)胞凋亡。caspase-3的活化主要依靠caspase-9的激活，caspase-3和caspase-9與乳腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[27]。為了進(jìn)一步探討其凋亡發(fā)生的可能的分子機(jī)制，本研究采用Western blot檢測(cè)與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)蛋白caspase-3和caspase-9的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)AEG-1 siRNA組中caspase-3和caspase-9蛋白的表達(dá)顯著高于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組（P＜0.05），而空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組之間caspase-3和caspase-9蛋白的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），因而可以初步得出AEG-1表達(dá)下調(diào)引發(fā)的乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡可能與caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)的上調(diào)密切相關(guān)，但是其詳細(xì)的分子機(jī)制尚需要進(jìn)一步探討。

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