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    甲狀腺乳頭狀癌中BRAFT1799A基因點(diǎn)突變及其與臨床病理特征的關(guān)系分析

    2018-06-05 03:46:13劉麗云胡月明李巖冰龔健
    中國(guó)普通外科雜志 2018年5期
    關(guān)鍵詞:研究

    劉麗云,胡月明,李巖冰,龔健

    (河北省唐山市工人醫(yī)院 1.病理科 2.頭頸外科,河北 唐山 063000;3.河北省唐山市第二醫(yī)院 老年骨科,河北 唐山063000)

    甲狀腺癌(thyroid carcinoma,TC)是臨床上最為常見(jiàn)的一種內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤[1],甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)是其最為常見(jiàn)的一種,約占TC的80%[2]。近年來(lái),我國(guó)PTC發(fā)病率呈現(xiàn)明顯逐年攀升趨勢(shì),嚴(yán)重影響了我國(guó)居民的身體健康及生命安全[3]。目前,PTC發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。有研究[4]表明,BRAF基因突變與PTC患者年齡、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等特征密切相關(guān),但國(guó)內(nèi)研究相對(duì)較少,且研究結(jié)果尚缺乏一致性。本研究納入2016年1月—2017年1月期間我院病理科收集的PTC患者的組織為研究對(duì)象,探討PTC組織中BRAFT1799A基因點(diǎn)突變情況,及其與PTC患者臨床病理特征之間的關(guān)系,試圖為開(kāi)展以BRAFT1799A為靶點(diǎn)的PTC分子生物學(xué)治療提供一定的理論依據(jù)。

    1 資料與方法

    1.1 研究對(duì)象

    選取2016年1月—2017年1月期間我院病理科提供的97例PTC組織為研究對(duì)象,所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為PTC組織。其中男26例,女71例;年齡16~63歲,平均年齡(46.27±7.65)歲;腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移(tumor-node-metastasis,TNM)分期I~I(xiàn)I期者45例,III~I(xiàn)V期者52例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者36例,無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者61例;隨訪發(fā)現(xiàn)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者30例,無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者67例。納入標(biāo)準(zhǔn):⑴ 所有標(biāo)本患者均為于我院行甲狀腺全切術(shù)+頸部淋巴結(jié)清掃術(shù)者,且經(jīng)病理學(xué)確診為PTC者;⑵ 臨床資料完整者;⑶ 切除組織前未經(jīng)任何放化療或者內(nèi)分泌治療;⑷ 術(shù)后均在我院行規(guī)范131I清甲治療[5]者;⑸ 患者及家屬了解本研究,并同意簽署知情同意書者。排除標(biāo)準(zhǔn):⑴ 合并其他惡性腫瘤者;⑵ 腫瘤已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,再次行手術(shù)治療者;⑶ 妊娠期及哺乳期婦女;⑷ 既往垂體疾病等不穩(wěn)定性原發(fā)系統(tǒng)性疾病者;⑸ 伴有肝臟、腎臟、肺臟、心臟等嚴(yán)重疾病者;⑹ 研究依從性差者。選取同期52例癌旁正常組織及49例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織作為對(duì)照,52例取癌旁正常組織的PTC患者中,男16例,女36例;年齡17~60歲,平均年齡(45.28±6.94)歲。49例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者中,男14例,女35例;年齡18~61歲,平均年齡(46.32±7.31)歲。3組年齡、性別等一般資料比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

    本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行,臨床標(biāo)本采集符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》[6]。

    1.2 主要試劑與儀器

    DNA FFPE Tissue Kit(56404),購(gòu)自于德國(guó)QIAamp公司;PCR Mastermix,購(gòu)自于BioTeke公司;引物由上海生工生物技術(shù)公司合成;Cycle-Pure Kit 100,購(gòu)自于美國(guó)Omega公司;3530測(cè)序儀,購(gòu)自于美國(guó)AMI公司。

    1.3 方法

    采用巢式PCR法檢測(cè)甲狀腺組織中BRAFT1799A基因位點(diǎn)突變情況。應(yīng)用DNA FFPE Tissue Kit(56404)提取甲狀腺組織DNA,測(cè)定所得DNA濃度后保存于-20 ℃冰箱中。BRAF上游引物:5'-GGC CAA AAA TTT AAT CAG TGG A-3',下游引物:5'-TCA TAA TGC TTG CTC TGA TAG GA-3'。巢式PCR反應(yīng)體系:第1次PCR:PCR Mastermix 12.0 μL,DNA 1 μL,上游引物(25 μM)1 μL,下游引物(25 μM)1 μL,ddH2O 10 μL。第2次PCR:PCR產(chǎn)物DNA 1 μL,PCR Mastermix 12.0 μL,上游引物(25 μM)1 μL,下游引物(25 μM)1 μL,ddH2O 10 μL。按照以下反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增:9 4 ℃預(yù)變性,5 min;94 ℃變性,45 s;56 ℃退火,45 s;72 ℃延伸,45 s;35個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min。所得PCR產(chǎn)物經(jīng)Cycle-Pure Kit 100純化后,應(yīng)用測(cè)序部分檢測(cè)試劑盒,利用3530測(cè)序儀對(duì)其進(jìn)行測(cè)序操作,具體操作嚴(yán)格按照試劑盒及儀器使用說(shuō)明進(jìn)行。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0進(jìn)行研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)(百分率)[n(%)]表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn);計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較采用t檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 不同甲狀腺組織BRAFT1799A位點(diǎn)突變率比較

    97例PTC組織中,59例出現(xiàn)BRAFT1799A位點(diǎn)突變(圖1),突變率為60.82%,而癌旁正常組織與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織均未見(jiàn)BRAFT1799A位點(diǎn)突變,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)(表1)。

    圖1 BRAFT1799A位點(diǎn)測(cè)序圖(綠色為突變峰;紅色為野生峰)Figure 1 Sequencing of the BRAFT1799A gene (mutation peaks shown in green and wild type peaks shown in red)

    表1 不同甲狀腺組織BRAFT1799A位點(diǎn)突變率比較[n(%)]Table 1 Comparison of the BRA FT1799A gene mutations among diff erent thyroid tissues [n (%)]

    2.2 BRAFT1799A位點(diǎn)突變與PTC臨床病例特征之間的關(guān)系

    BRAFT1799A位點(diǎn)突變與PTC患者性別、年齡、腫瘤大小無(wú)明顯關(guān)系(均P>0.05),與腫瘤臨床分期、腫瘤多發(fā)灶、包膜外侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、規(guī)范化治療6個(gè)月甲狀腺球蛋白(Tg)值及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有明顯關(guān)系(均P<0.05)(表2)。

    表2 BRAFT1799A位點(diǎn)突變與PTC臨床病例特征之間的關(guān)系[n(%)]Table 2 Relations of BRA FT1799A gene mutation with the clinical characteristics of the PTC patients [n (%)]

    2.3 不同PTC組織分型BRAFT1799A位點(diǎn)突變率比較結(jié)果

    對(duì)PTC組織進(jìn)行具體亞型分型,結(jié)果顯示,嗜酸細(xì)胞型1例,高細(xì)胞亞型1例,普通型46例中,29例出現(xiàn)BRAFT1799A位點(diǎn)突變,突變率為63.04%,濾泡型49例中,30例出現(xiàn)BRAFT1799A位點(diǎn)突變,突變率為61.22%,普通型與濾泡型突變率比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表3)。兩種組織分型HE染色結(jié)果見(jiàn)圖2。

    表3 不同分型PTC組織BRAFT1799A位點(diǎn)突變率比較[n(%)]Table 3 Comparison of the BRAFT1799A gene mutations between PTC tissues of different classifications [n (%)]

    圖2 PTC亞型分型HE染色結(jié)果(×400) A:普通型;B:濾泡型Figure 2 HE staining for subtype classification of PTC (×400) A: Conventional PTC; B: Follicular variant PTC

    3 討 論

    PTC是臨床TC中最為常見(jiàn)的一種類型,其主要臨床表現(xiàn)為頸部疼痛、腫塊、吞咽困難、聲音嘶啞以及呼吸困難等[7],PTC腫瘤生長(zhǎng)緩慢,缺乏早期特征性癥狀,但其惡性程度較高,且具有多中心發(fā)生傾向,因此在其表現(xiàn)出明顯癥狀時(shí),往往已進(jìn)展為中晚期,此時(shí)治療療效往往不盡人意。目前,臨床治療PTC手段以手術(shù)切除及放射性碘治療為主[8],但PTC晚期手術(shù)切除較為困難,且對(duì)于放化療敏感性較低,因此,闡明PTC發(fā)病機(jī)制,從基因?qū)用嫔蠈ふ襊TC診斷及治療新靶點(diǎn)[9],是目前臨床亟待解決的關(guān)鍵性問(wèn)題。近年來(lái),基因?qū)W改變與PTC發(fā)病機(jī)制的關(guān)系被國(guó)內(nèi)外學(xué)者爭(zhēng)相報(bào)道[10-17],其中BRAF基因突變與PTC發(fā)病之間的關(guān)系,是目前研究的重要熱點(diǎn)之一[11]。既往研究[12]表明,大多數(shù)PTC發(fā)生是由NTRK1、RET/PTC以及絲氨酸-蘇氨酸激酶致癌信號(hào)通路激活所致。BRAF基因是RAF激酶家族亞型成員之一,位于人類染色體7q34上,是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路下游中信號(hào)最強(qiáng)的激動(dòng)子[17]。BRAF基因?qū)俳z氨酸-蘇氨酸激酶類,其發(fā)生基因突變可激活MAPK信號(hào)通路,在機(jī)體細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡中起重要調(diào)節(jié)作用。BRAF基因位點(diǎn)突變異常激活MAPK信號(hào)通路時(shí),可導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖分化調(diào)節(jié)失控,誘發(fā)腫瘤發(fā)生。研究[18-19]表明,BRAF基因位點(diǎn)突變主要集中于PTC中,最為常見(jiàn)突變位點(diǎn)為第15外顯子T1799A位點(diǎn)顛換突變,所致編碼產(chǎn)物由纈氨酸變?yōu)楣劝彼幔╒600E),該位點(diǎn)編碼產(chǎn)物異位導(dǎo)致BRAF基因持續(xù)性激活MAPK信號(hào)通路,從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[20]。目前,國(guó)內(nèi)外有關(guān)BRAF基因T1799A位點(diǎn)突變與PTC臨床病理特征之間的相關(guān)性尚存在一些爭(zhēng)議,可能與不同樣本量、流行病學(xué)因素、初診病情評(píng)估差異等多種因素有關(guān)。

    本研究納入2016年1月—2017年1月期間我院病理科97例PTC組織為研究對(duì)象,試圖探討PTC組織中BRAFT1799A基因點(diǎn)突變情況,及其與PTC臨床病理特征之間的關(guān)系,結(jié)果發(fā)現(xiàn),在97例PTC組織中,59例出現(xiàn)BRAFT1799A位點(diǎn)突變,突變率為60.82%,明顯高于癌旁正常組織及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織,說(shuō)明BRAFT1799A位點(diǎn)突變僅在PTC組織中出現(xiàn),提示BRAFT1799A位點(diǎn)突變可能是PTC發(fā)生的重要因素之一,參與PTC發(fā)生。Ca?adas-Garre等[21]研究結(jié)果顯示,BRAFT1799A位點(diǎn)突變是PTC中最為普遍的遺傳學(xué)改變,其診斷特征性使其成為了提高甲狀腺細(xì)針穿刺活檢診斷準(zhǔn)確性最具潛力的遺傳工具,支持本研究觀點(diǎn)。顏康康等[22]研究結(jié)果顯示,BRAF基因位點(diǎn)突變與PTC臨床病理分期、多灶性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、疾病復(fù)發(fā)密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示,BRAFT1799A位點(diǎn)突變與PTC患者性別、年齡、腫瘤大小無(wú)明顯關(guān)系,與腫瘤臨床分期、腫瘤多發(fā)灶、包膜外侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、規(guī)范化治療6個(gè)月Tg值及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān),與上述觀點(diǎn)一致。Tg值、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均是檢測(cè)TC術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的有效臨床指標(biāo)[23],BRAFT1799A位點(diǎn)突變與PTC患者術(shù)后規(guī)范化治療6個(gè)月Tg值及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān),提示其突變對(duì)于PTC復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移具有一定預(yù)測(cè)作用,故其可作為客觀判斷PTC預(yù)后效果、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的有效指標(biāo)。因此,臨床上對(duì)于術(shù)前或術(shù)后病檢BRAFT1799A位點(diǎn)突變的患者,應(yīng)在術(shù)后定期復(fù)查并嚴(yán)密監(jiān)測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)的變化情況,以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)病情進(jìn)展。還有研究[24]指出,術(shù)前USFNAB聯(lián)合多分子標(biāo)志物的檢測(cè)可提高其診斷PTC的敏感性及特異性,可見(jiàn)BRAFT1799A位點(diǎn)突變對(duì)于術(shù)前診斷也有臨床價(jià)值。本研究對(duì)PTC組織進(jìn)行具體亞型分型,結(jié)果顯示,嗜酸細(xì)胞型1例,高細(xì)胞亞型1例,普通型46例,濾泡型49例,且普通型與濾泡型突變率比較無(wú)顯著性差異,提示該突變位點(diǎn)不特異性的高發(fā)于PTC普通型或者濾泡型中。

    綜上所述,BRAFT1799A位點(diǎn)突變與PTC臨床分期、腫瘤多發(fā)灶、包膜外侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、規(guī)范化治療6個(gè)月Tg值及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切有關(guān)??梢?jiàn),術(shù)前檢測(cè)BRAFT1799A位點(diǎn)突變,對(duì)于陽(yáng)性病例給予高度警惕,術(shù)中可通過(guò)擴(kuò)大手術(shù)切除范圍等對(duì)其進(jìn)行更為積極的有效治療,術(shù)后嚴(yán)密追蹤此類患者,督促其復(fù)查,以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)病情變化,以期改善預(yù)后,使更多PTC患者受益。盡管本研究進(jìn)一步地證實(shí)了BRAFT1799A位點(diǎn)突變檢測(cè)對(duì)于PTC患者預(yù)后具有積極的作用,但仍存在樣本量較少等缺陷,在后續(xù)研究中將擴(kuò)大樣本量,從BRAFT1799A位點(diǎn)突變對(duì)在術(shù)前診斷、術(shù)中切除范圍、術(shù)后預(yù)后等維度來(lái)充分論證其突變的臨床指導(dǎo)意義,以完善本研究結(jié)果的不足和缺憾,為改善PTC患者的生活質(zhì)量提供大樣本或多中心研究成果,以更好地為臨床診斷、治療PTC患者提供切實(shí)可行的依據(jù)。

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