甲狀腺乳頭狀癌中BRAFT1799A基因點(diǎn)突變及其與臨床病理特征的關(guān)系分析

劉麗云，胡月明，李巖冰，龔健

（河北省唐山市工人醫(yī)院 1.病理科 2.頭頸外科，河北 唐山 063000；3.河北省唐山市第二醫(yī)院 老年骨科，河北 唐山063000）

甲狀腺癌（thyroid carcinoma，TC）是臨床上最為常見(jiàn)的一種內(nèi)分泌系統(tǒng)惡性腫瘤[1]，甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是其最為常見(jiàn)的一種，約占TC的80%[2]。近年來(lái)，我國(guó)PTC發(fā)病率呈現(xiàn)明顯逐年攀升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響了我國(guó)居民的身體健康及生命安全[3]。目前，PTC發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。有研究[4]表明，BRAF基因突變與PTC患者年齡、腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等特征密切相關(guān)，但國(guó)內(nèi)研究相對(duì)較少，且研究結(jié)果尚缺乏一致性。本研究納入2016年1月—2017年1月期間我院病理科收集的PTC患者的組織為研究對(duì)象，探討PTC組織中BRAFT1799A基因點(diǎn)突變情況，及其與PTC患者臨床病理特征之間的關(guān)系，試圖為開(kāi)展以BRAFT1799A為靶點(diǎn)的PTC分子生物學(xué)治療提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2016年1月—2017年1月期間我院病理科提供的97例PTC組織為研究對(duì)象，所有標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為PTC組織。其中男26例，女71例；年齡16～63歲，平均年齡（46.27±7.65）歲；腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（tumor-node-metastasis，TNM）分期I～I(xiàn)I期者45例，III～I(xiàn)V期者52例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者36例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者61例；隨訪發(fā)現(xiàn)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者30例，無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者67例。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴ 所有標(biāo)本患者均為于我院行甲狀腺全切術(shù)+頸部淋巴結(jié)清掃術(shù)者，且經(jīng)病理學(xué)確診為PTC者；⑵ 臨床資料完整者；⑶ 切除組織前未經(jīng)任何放化療或者內(nèi)分泌治療；⑷ 術(shù)后均在我院行規(guī)范131I清甲治療[5]者；⑸ 患者及家屬了解本研究，并同意簽署知情同意書者。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴ 合并其他惡性腫瘤者；⑵ 腫瘤已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，再次行手術(shù)治療者；⑶ 妊娠期及哺乳期婦女；⑷ 既往垂體疾病等不穩(wěn)定性原發(fā)系統(tǒng)性疾病者；⑸ 伴有肝臟、腎臟、肺臟、心臟等嚴(yán)重疾病者；⑹ 研究依從性差者。選取同期52例癌旁正常組織及49例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織作為對(duì)照，52例取癌旁正常組織的PTC患者中，男16例，女36例；年齡17～60歲，平均年齡（45.28±6.94）歲。49例結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者中，男14例，女35例；年齡18～61歲，平均年齡（46.32±7.31）歲。3組年齡、性別等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。

本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行，臨床標(biāo)本采集符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》[6]。

1.2 主要試劑與儀器

DNA FFPE Tissue Kit（56404），購(gòu)自于德國(guó)QIAamp公司；PCR Mastermix，購(gòu)自于BioTeke公司；引物由上海生工生物技術(shù)公司合成；Cycle-Pure Kit 100，購(gòu)自于美國(guó)Omega公司；3530測(cè)序儀，購(gòu)自于美國(guó)AMI公司。

1.3 方法

采用巢式PCR法檢測(cè)甲狀腺組織中BRAFT1799A基因位點(diǎn)突變情況。應(yīng)用DNA FFPE Tissue Kit（56404）提取甲狀腺組織DNA，測(cè)定所得DNA濃度后保存于-20 ℃冰箱中。BRAF上游引物：5'-GGC CAA AAA TTT AAT CAG TGG A-3'，下游引物：5'-TCA TAA TGC TTG CTC TGA TAG GA-3'。巢式PCR反應(yīng)體系：第1次PCR：PCR Mastermix 12.0 μL，DNA 1 μL，上游引物（25 μM）1 μL，下游引物（25 μM）1 μL，ddH2O 10 μL。第2次PCR：PCR產(chǎn)物DNA 1 μL，PCR Mastermix 12.0 μL，上游引物（25 μM）1 μL，下游引物（25 μM）1 μL，ddH2O 10 μL。按照以下反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增：9 4 ℃預(yù)變性，5 min；94 ℃變性，45 s；56 ℃退火，45 s；72 ℃延伸，45 s；35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。所得PCR產(chǎn)物經(jīng)Cycle-Pure Kit 100純化后，應(yīng)用測(cè)序部分檢測(cè)試劑盒，利用3530測(cè)序儀對(duì)其進(jìn)行測(cè)序操作，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒及儀器使用說(shuō)明進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

利用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0進(jìn)行研究數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)（百分率）[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 不同甲狀腺組織BRAFT1799A位點(diǎn)突變率比較

97例PTC組織中，59例出現(xiàn)BRAFT1799A位點(diǎn)突變（圖1），突變率為60.82%，而癌旁正常組織與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織均未見(jiàn)BRAFT1799A位點(diǎn)突變，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）（表1）。

圖1 BRAFT1799A位點(diǎn)測(cè)序圖（綠色為突變峰；紅色為野生峰）Figure 1 Sequencing of the BRAFT1799A gene (mutation peaks shown in green and wild type peaks shown in red)

表1 不同甲狀腺組織BRAFT1799A位點(diǎn)突變率比較[n（%）]Table 1 Comparison of the BRA FT1799A gene mutations among diff erent thyroid tissues [n (%)]

2.2 BRAFT1799A位點(diǎn)突變與PTC臨床病例特征之間的關(guān)系

BRAFT1799A位點(diǎn)突變與PTC患者性別、年齡、腫瘤大小無(wú)明顯關(guān)系（均P＞0.05），與腫瘤臨床分期、腫瘤多發(fā)灶、包膜外侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、規(guī)范化治療6個(gè)月甲狀腺球蛋白（Tg）值及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有明顯關(guān)系（均P＜0.05）（表2）。

表2 BRAFT1799A位點(diǎn)突變與PTC臨床病例特征之間的關(guān)系[n（%）]Table 2 Relations of BRA FT1799A gene mutation with the clinical characteristics of the PTC patients [n (%)]

2.3 不同PTC組織分型BRAFT1799A位點(diǎn)突變率比較結(jié)果

對(duì)PTC組織進(jìn)行具體亞型分型，結(jié)果顯示，嗜酸細(xì)胞型1例，高細(xì)胞亞型1例，普通型46例中，29例出現(xiàn)BRAFT1799A位點(diǎn)突變，突變率為63.04%，濾泡型49例中，30例出現(xiàn)BRAFT1799A位點(diǎn)突變，突變率為61.22%，普通型與濾泡型突變率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表3）。兩種組織分型HE染色結(jié)果見(jiàn)圖2。

表3 不同分型PTC組織BRAFT1799A位點(diǎn)突變率比較[n（%）]Table 3 Comparison of the BRAFT1799A gene mutations between PTC tissues of different classifications [n (%)]

圖2 PTC亞型分型HE染色結(jié)果（×400） A：普通型；B：濾泡型Figure 2 HE staining for subtype classification of PTC (×400) A: Conventional PTC; B: Follicular variant PTC

3 討 論

PTC是臨床TC中最為常見(jiàn)的一種類型，其主要臨床表現(xiàn)為頸部疼痛、腫塊、吞咽困難、聲音嘶啞以及呼吸困難等[7]，PTC腫瘤生長(zhǎng)緩慢，缺乏早期特征性癥狀，但其惡性程度較高，且具有多中心發(fā)生傾向，因此在其表現(xiàn)出明顯癥狀時(shí)，往往已進(jìn)展為中晚期，此時(shí)治療療效往往不盡人意。目前，臨床治療PTC手段以手術(shù)切除及放射性碘治療為主[8]，但PTC晚期手術(shù)切除較為困難，且對(duì)于放化療敏感性較低，因此，闡明PTC發(fā)病機(jī)制，從基因?qū)用嫔蠈ふ襊TC診斷及治療新靶點(diǎn)[9]，是目前臨床亟待解決的關(guān)鍵性問(wèn)題。近年來(lái)，基因?qū)W改變與PTC發(fā)病機(jī)制的關(guān)系被國(guó)內(nèi)外學(xué)者爭(zhēng)相報(bào)道[10-17]，其中BRAF基因突變與PTC發(fā)病之間的關(guān)系，是目前研究的重要熱點(diǎn)之一[11]。既往研究[12]表明，大多數(shù)PTC發(fā)生是由NTRK1、RET/PTC以及絲氨酸-蘇氨酸激酶致癌信號(hào)通路激活所致。BRAF基因是RAF激酶家族亞型成員之一，位于人類染色體7q34上，是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路下游中信號(hào)最強(qiáng)的激動(dòng)子[17]。BRAF基因?qū)俳z氨酸-蘇氨酸激酶類，其發(fā)生基因突變可激活MAPK信號(hào)通路，在機(jī)體細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分化、凋亡中起重要調(diào)節(jié)作用。BRAF基因位點(diǎn)突變異常激活MAPK信號(hào)通路時(shí)，可導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖分化調(diào)節(jié)失控，誘發(fā)腫瘤發(fā)生。研究[18-19]表明，BRAF基因位點(diǎn)突變主要集中于PTC中，最為常見(jiàn)突變位點(diǎn)為第15外顯子T1799A位點(diǎn)顛換突變，所致編碼產(chǎn)物由纈氨酸變?yōu)楣劝彼幔╒600E），該位點(diǎn)編碼產(chǎn)物異位導(dǎo)致BRAF基因持續(xù)性激活MAPK信號(hào)通路，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[20]。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)BRAF基因T1799A位點(diǎn)突變與PTC臨床病理特征之間的相關(guān)性尚存在一些爭(zhēng)議，可能與不同樣本量、流行病學(xué)因素、初診病情評(píng)估差異等多種因素有關(guān)。

本研究納入2016年1月—2017年1月期間我院病理科97例PTC組織為研究對(duì)象，試圖探討PTC組織中BRAFT1799A基因點(diǎn)突變情況，及其與PTC臨床病理特征之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在97例PTC組織中，59例出現(xiàn)BRAFT1799A位點(diǎn)突變，突變率為60.82%，明顯高于癌旁正常組織及結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組織，說(shuō)明BRAFT1799A位點(diǎn)突變僅在PTC組織中出現(xiàn)，提示BRAFT1799A位點(diǎn)突變可能是PTC發(fā)生的重要因素之一，參與PTC發(fā)生。Ca?adas-Garre等[21]研究結(jié)果顯示，BRAFT1799A位點(diǎn)突變是PTC中最為普遍的遺傳學(xué)改變，其診斷特征性使其成為了提高甲狀腺細(xì)針穿刺活檢診斷準(zhǔn)確性最具潛力的遺傳工具，支持本研究觀點(diǎn)。顏康康等[22]研究結(jié)果顯示，BRAF基因位點(diǎn)突變與PTC臨床病理分期、多灶性、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、疾病復(fù)發(fā)密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，BRAFT1799A位點(diǎn)突變與PTC患者性別、年齡、腫瘤大小無(wú)明顯關(guān)系，與腫瘤臨床分期、腫瘤多發(fā)灶、包膜外侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、規(guī)范化治療6個(gè)月Tg值及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，與上述觀點(diǎn)一致。Tg值、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均是檢測(cè)TC術(shù)后復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的有效臨床指標(biāo)[23]，BRAFT1799A位點(diǎn)突變與PTC患者術(shù)后規(guī)范化治療6個(gè)月Tg值及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示其突變對(duì)于PTC復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移具有一定預(yù)測(cè)作用，故其可作為客觀判斷PTC預(yù)后效果、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移的有效指標(biāo)。因此，臨床上對(duì)于術(shù)前或術(shù)后病檢BRAFT1799A位點(diǎn)突變的患者，應(yīng)在術(shù)后定期復(fù)查并嚴(yán)密監(jiān)測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)的變化情況，以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)病情進(jìn)展。還有研究[24]指出，術(shù)前USFNAB聯(lián)合多分子標(biāo)志物的檢測(cè)可提高其診斷PTC的敏感性及特異性，可見(jiàn)BRAFT1799A位點(diǎn)突變對(duì)于術(shù)前診斷也有臨床價(jià)值。本研究對(duì)PTC組織進(jìn)行具體亞型分型，結(jié)果顯示，嗜酸細(xì)胞型1例，高細(xì)胞亞型1例，普通型46例，濾泡型49例，且普通型與濾泡型突變率比較無(wú)顯著性差異，提示該突變位點(diǎn)不特異性的高發(fā)于PTC普通型或者濾泡型中。

綜上所述，BRAFT1799A位點(diǎn)突變與PTC臨床分期、腫瘤多發(fā)灶、包膜外侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、規(guī)范化治療6個(gè)月Tg值及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切有關(guān)?？梢?jiàn)，術(shù)前檢測(cè)BRAFT1799A位點(diǎn)突變，對(duì)于陽(yáng)性病例給予高度警惕，術(shù)中可通過(guò)擴(kuò)大手術(shù)切除范圍等對(duì)其進(jìn)行更為積極的有效治療，術(shù)后嚴(yán)密追蹤此類患者，督促其復(fù)查，以便及時(shí)發(fā)現(xiàn)病情變化，以期改善預(yù)后，使更多PTC患者受益。盡管本研究進(jìn)一步地證實(shí)了BRAFT1799A位點(diǎn)突變檢測(cè)對(duì)于PTC患者預(yù)后具有積極的作用，但仍存在樣本量較少等缺陷，在后續(xù)研究中將擴(kuò)大樣本量，從BRAFT1799A位點(diǎn)突變對(duì)在術(shù)前診斷、術(shù)中切除范圍、術(shù)后預(yù)后等維度來(lái)充分論證其突變的臨床指導(dǎo)意義，以完善本研究結(jié)果的不足和缺憾，為改善PTC患者的生活質(zhì)量提供大樣本或多中心研究成果，以更好地為臨床診斷、治療PTC患者提供切實(shí)可行的依據(jù)。

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