無染色明視野鏡檢法在甲狀腺癌手術(shù)中判定甲狀旁腺的臨床應(yīng)用

萬光俊，方大正，沈豐，吳紅偉，周文波

（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬東風(fēng)醫(yī)院 普通外科，湖北 十堰 442000）

暫時性和永久性甲狀旁腺功能低下是甲狀腺外科的常見并發(fā)癥，有文獻[1-2]報道其發(fā)生率分別為14%～60%和4%～11%。因此,術(shù)中甲狀旁腺的識別與保護尤其重要，除了細致的解剖保護甲狀旁腺及其血供，甲狀旁腺自體移植已越來越多地采用以保留甲狀旁腺功能[3]。在手術(shù)中及自體移植之前必須判定甲狀旁腺組織，以免發(fā)生誤切、錯誤移植和錯誤保留轉(zhuǎn)移癌組織。筆者自2016年1月采用術(shù)中無染色明視野鏡檢法判定甲狀旁腺組織，與傳統(tǒng)術(shù)中冷凍病理檢測比較，旨在評定無染色明視野鏡檢法判定甲狀旁腺組織準確性和臨床應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2016年1月—2017年6月期間，筆者所在醫(yī)療組連續(xù)收治并行手術(shù)治療的357例甲狀腺乳頭狀癌患者，排除術(shù)中已經(jīng)明確甲狀旁腺患者，將術(shù)中需要判定的疑似下甲狀旁腺組織的115例甲狀腺癌患者納入研究對象。其中男28例，女87例；年齡14～68歲，平均年齡（46.3±8.6）歲；TNM分期I期69例，II期17例，III期23例，IV期6例；行甲狀腺全切38例，甲狀腺全切+單側(cè)中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃51例，甲狀腺全切+雙側(cè)中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃20例，甲狀腺全切+雙側(cè)中央?yún)^(qū)淋巴結(jié)清掃+側(cè)頸區(qū)淋巴結(jié)清掃6例。

1.2 方法

手術(shù)由同一組醫(yī)生施行，術(shù)中獲取肉眼判斷115例的疑似下甲狀旁腺組織196枚，對術(shù)中找到疑似甲狀旁腺組織后，由第一助手取疑似甲狀旁腺組織的一小部分約2 mm3，均等分成2份，1份用生理鹽水沖洗，放在載玻片上，以蓋玻片壓碎組織[4]。立即送病理科行400倍鏡明視野鏡檢。記錄從制作玻璃壓片到出病理報告所耗時間。對另1份送術(shù)中冷凍病理，記錄送檢到出病理報告所耗時間。與無染色明視野鏡檢判定結(jié)果進行比較。

每例患者術(shù)前第1天、術(shù)后1、3 0 d均測定血清全段甲狀旁腺激素（intact parathyroid hormone，iPTH）和血清鈣水平,評價術(shù)前術(shù)后的甲狀旁腺功能變化。iPTH采用化學(xué)發(fā)光法測定（貝克曼DX1800生化儀），正常參考值范圍為（12～88）pg/mL。血清鈣采用偶氮砷III法（雅培C16000全自動分析儀），正常參考值范圍為（2.11～2.52）mmol/L。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，無染色明視野鏡檢法與術(shù)中冷凍病理檢查方法的一致性檢驗采用κ檢驗，即κ值（0＜κ≤1）越大，一致性越強，＜0.2，一致性非常弱；0.4≤κ＜0.6，一致性一般：0.6≤κ＜0.8，一致性好；κ＞0.8，一致性非常強，κ=1完全一致。無染色明視野鏡檢法與術(shù)中冷凍病理檢查判定結(jié)果是否有統(tǒng)計學(xué)差異采用配對χ2檢驗（McNemar檢驗）；術(shù)前術(shù)后甲狀旁系腺功能的變化采用配對t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 術(shù)中無染色明視野鏡檢結(jié)果和術(shù)中冷凍結(jié)果

無染色明視野鏡檢法400倍顯微鏡下各種組織特點：甲狀旁腺組織特點是可見特征性的褐色小細胞密集團廣泛分布，透明脂肪細胞散在其中（圖1A）;脂肪組織特點是脂肪細胞密集成團，相互重疊（圖1B）；淋巴結(jié)的特點是脂肪聚集成團，白色小細胞密集團片狀分布，白色小細胞團體積較甲狀旁腺中褐色小細胞密集團大（圖1C）；胸腺組織特點是與脂肪組織相似，除了脂肪細胞密集成團相互重疊外，還有少量白色小細胞散在其中（圖1D）。

196枚疑似甲狀旁腺組織無染色明視野鏡檢法判定結(jié)果見表1。其中無染色明視野鏡檢法判定甲狀旁腺組織為142枚，術(shù)中冷凍病理證實均為甲狀旁腺；無染色明視野鏡檢法判定的29枚脂肪組織中，術(shù)中冷凍病理判定為脂肪有25枚，甲狀旁腺1枚，胸腺1枚，淋巴結(jié)2枚；無染色明視野鏡檢法判定的17枚淋巴組織中，術(shù)中冷凍病理判定淋巴結(jié)有14枚，甲狀旁腺2枚，胸腺1枚；無染色明視野鏡檢法判定的胸腺組織8枚中，術(shù)中冷凍病理判定胸腺有5枚，甲狀旁腺1枚，脂肪2枚。因此，術(shù)中冷凍病理共檢測出甲狀旁腺146枚，脂肪27枚，淋巴結(jié)16枚，胸腺7枚（表1）。甲狀旁腺組織均順利壓片平均耗時為4～6 min，送術(shù)中冷凍耗時約30～40 min，每例手術(shù)中平均送檢1.7枚疑似甲狀旁腺組織。

圖1 疑似下甲狀腺旁腺組織無染色明視野鏡檢圖（×400） A：甲狀旁腺組織；B：脂肪組織；C：淋巴結(jié)組織；D：胸腺組織Figure 1 Images of bright-field microscopy without staining for suspected inferior parathyroid tissue (×400) A: Parathyroid tissue;B: Adipose tissue; C: Lymph node tissue; D: Thymus tissue

表1 196枚可疑下甲狀旁腺組織兩種檢測方法的檢測結(jié)果Table 1 The detection results of the 196 suspected parathyroid tissues by the two methods

2.2 術(shù)中無染色明視野鏡檢與術(shù)中冷凍病理結(jié)果比較

無染色明視野鏡檢判定各類組織的敏感性和特異性均較高，判定甲狀旁腺的敏感性為97.26%、特異性為100.00%，脂肪的敏感性為93.00%、特異性為97.63%，淋巴結(jié)的敏感性為88.00%、特異性為98.33%，胸腺的敏感性為83.00%、特異性為98.42%。兩種判定方法κ值均較高，即無染色明視野鏡檢法判定甲狀旁腺與術(shù)中冷凍病理判定甲狀旁腺具有非常強的一致性。無染色明視野鏡檢法與術(shù)中冷凍病理檢查判定各種類型組織的判定結(jié)果配對χ2檢驗，兩種方法的判定結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05）（表2）。

表2 無染色明視野鏡檢法與術(shù)中冷凍病理檢測方法的比較分析結(jié)果Table 2 Comparative analysis of bright-field microscopy without staining and intraoperative frozen pathological detection

2.3 術(shù)中術(shù)后甲狀旁腺功能比較

115例甲狀腺乳頭狀癌患者術(shù)前與術(shù)后1、30 d的iPTH及血清鈣平均值見表3。術(shù)后1、30 d的iPTH與血清鈣分別與術(shù)前的iPTH及血清鈣進行配對t檢驗。術(shù)后1 d與術(shù)前iPTH相比，iPTH下降有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），血清鈣下降無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；術(shù)前與術(shù)后30 d iPTH及血清鈣變化均無統(tǒng)計差異（均P＞0.05）。

表3 術(shù)前術(shù)后甲狀旁腺功能變化比較分析Table 3 Comparison of parathyroid function parameters before and after operation

3 討 論

甲狀腺癌手術(shù)中，原則上首先是盡最大可能清除病灶，其次是盡可能原位保留甲狀旁腺[5]。原位保留甲狀旁腺，避免和減少術(shù)后甲狀旁腺功能低下的發(fā)生的前提是術(shù)中準確的辨認甲狀旁腺[6]。精細的被膜解剖有利于甲狀旁腺辨識和原位保護，有效地辨認甲狀旁腺和保護其血供是預(yù)防甲狀旁腺功能低下最有效手段[7-10]。精細解剖甲狀旁腺后，多數(shù)因血供在一定程度受損或者其供血血管受刺激后痙攣收縮而使其變?yōu)樽攸S至棕黑色，而脂肪組織和淋巴結(jié)一般不會變色，這時肉眼就可以辨認出甲狀旁腺進行原位保護[11]。上甲狀旁腺因解剖位置恒定，術(shù)中肉眼易辨識，但對于下甲狀旁腺因位置不固定，常常需與淋巴結(jié)、脂肪組織、胸腺組織相互鑒別，僅僅靠肉眼依據(jù)顏色和形狀來辨識存在困難。因此，下甲狀旁腺誤切幾率高。特別是甲狀腺癌手術(shù)中，為了保證淋巴結(jié)清掃的徹底性，甲狀旁腺誤切幾率大大增加，從而導(dǎo)致一過性甲狀旁腺功能減退，甚至的永久性甲狀旁腺功能減退發(fā)生率增加。術(shù)后甲狀旁腺功能減退的患者會出現(xiàn)面唇部或手足皮膚針刺樣感覺、麻木強直感、手足抽搐、呼吸困難、全身抽搐甚至昏迷等不同程度的低血清鈣癥狀，需要長期服用藥物改善癥狀，嚴重影響患者生活質(zhì)量。甲狀旁腺誤切的補救辦法是優(yōu)先選擇甲狀旁腺自體移植，甲狀旁腺自體移植能有效減少術(shù)后永久性甲狀旁腺功能減退的發(fā)生[12-13]，但前提是移植物必須確認是誤切的甲狀旁腺組織。若將癌轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)誤判為甲狀旁腺組織行自體移植，最終導(dǎo)致腫瘤種植擴散的嚴重后果。因此，提高術(shù)中甲狀旁腺的辨識率，避免或減少術(shù)后甲狀旁腺功能減退是甲狀腺外科醫(yī)師面臨的重要課題。

目前術(shù)中除肉眼辨認外，術(shù)中判定甲狀旁腺的常用的方法包括靜脈注射亞甲藍甲狀旁腺正顯影、納米炭甲狀旁腺負顯影、術(shù)中光學(xué)相干層析成像系統(tǒng)識別技術(shù)、術(shù)中冷凍快速病理檢查等。早在1971年，Dudley等[14]報道術(shù)前靜脈注射亞甲藍用于甲狀旁腺正顯影判定甲狀旁腺。后來認識到病理性甲狀旁腺組織易被亞甲藍染色[1,15]，而正常甲狀旁腺組織染色率很低，褪色較快[1,16]，亞甲藍還能使淋巴結(jié)染色[17]。亞甲藍雖然價格較為便宜，但其甲狀旁腺正顯影的敏感性較低，而且有神經(jīng)系統(tǒng)的毒副反應(yīng)[15]，目前甲狀腺癌手術(shù)中不推薦其用于正常甲狀旁腺的辨認[1]。與其他示蹤劑相比，納米炭具有黑染率高、示蹤速度快、持續(xù)時間長、淋巴趨向性強的特點。因此在術(shù)中納米炭對甲狀腺及區(qū)域淋巴結(jié)均有高度識別示蹤作用[18]，可提高術(shù)中淋巴結(jié)及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)清掃數(shù)目[19-20]，更重要的是它能負顯影甲狀旁腺，利于甲狀旁腺的原位保護，降低術(shù)中甲狀旁腺損傷幾率和誤切率[21]。因此它是目前甲狀腺癌手術(shù)辨識甲狀旁腺較為理想的示蹤劑。但是術(shù)中注射納米炭需要掌握有一定的技巧，學(xué)習(xí)曲線較長，若注射不當(dāng)，導(dǎo)致無法辨認甲狀旁腺；納米炭雖然沒有毒性的報道，但是在人體內(nèi)長期殘留，同時納米炭碳價格偏貴，不在醫(yī)保報銷范圍內(nèi)，臨床應(yīng)用大大受限。有學(xué)者[22-23]報道術(shù)中光學(xué)相干層析成像系統(tǒng)（OCT）可以不固定，染色，或組織切除用以術(shù)中判定頸部甲狀腺，脂肪，肌肉，淋巴結(jié)，甲狀旁腺組織準確率達98.42%，但費用昂貴。這些判定方法，因術(shù)者的經(jīng)驗、患者的個體差異及經(jīng)濟效益的不同存在一定局限性，術(shù)中冷凍病理切片是誤切的甲狀旁腺自體移植前的確認甲狀旁腺組織最常用的方法，它是術(shù)中確認甲狀旁腺的金標準。本研究中就是以術(shù)中冷凍病理片為對照，探討無染色明視野鏡檢法辨認甲狀旁腺的敏感性和特異性，是否具有替代術(shù)中冷凍病理確認甲狀旁腺的潛力。

活體組織壓片后無染色明視野鏡檢法在甲狀腺癌術(shù)中辨認甲狀旁腺國內(nèi)由1994年李泮泉等[24]報道。它的操作方法是：術(shù)中取可疑甲狀旁腺組織的1 mm3大小，用生理鹽水沖洗，放在載玻片上，以蓋玻片壓碎組織。立即行100倍顯微鏡下明視野鏡檢。該方法鏡檢甲狀旁腺組織的特點是：鏡下可見許多褐色小細胞密集團,可見體積較大透明脂肪細胞散在分布其中，部分脂肪細胞重疊。鏡下較容易與脂肪、淋巴結(jié)及胸腺組織區(qū)分開來。

本研究中采用無染色明視野鏡檢法采用400倍視野顯微鏡鏡下辨認甲狀旁腺組織，鑒別要點主要是依據(jù)脂肪細胞的含量和小細胞的含量、密度、顏色、大小、分布特點不同來鑒定。需要區(qū)分的四種組織的共同特點是均含有脂肪細胞。脂肪組織和胸腺組織含有脂肪細胞最多，基本都是由脂肪細胞組成，脂肪組織和胸腺組織主要區(qū)別在于胸腺中脂肪細胞相對小些，而且小細胞集團散在其中；淋巴組織含脂肪細胞次于脂肪和胸腺，脂肪細胞片狀分布其中；甲狀旁腺組織最少，脂肪細胞散在分布其中。甲狀旁腺組織可見特征性褐色小細胞密集團，而淋巴結(jié)的小細胞密集團較甲狀旁腺大，而且顏色是白色，很容易與淋巴組織鑒別。本研究顯示無染色明視野鏡檢法具有很高的敏感性（97.26%）和特異性（100%）。同樣該法辨認脂肪，淋巴結(jié)及胸腺組織均有很高的敏感性和特異性。

本研究中以術(shù)中冷凍病理檢測為金標準，采用κ檢驗測定無染色明視野鏡檢法與術(shù)中冷凍病理檢測這兩種方法判定各類組織的一致性，兩種方法判定甲狀旁腺、脂肪、淋巴結(jié)的各自一致性κ檢驗κ均大于0.8，一致性非常強，僅判定胸腺的κ值在0.6到0.8之間，一致性仍好。因此，兩種判定方法一致性非常強。表明無染色明視野鏡檢法的準確性很接近術(shù)中冷凍病理檢測，在很大程度可以替代術(shù)中冷凍病理用于判定甲狀旁腺。另外，本研究中采用配對χ2檢驗測定兩種方法判定各類組織的判定結(jié)果無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），側(cè)面進一步說明術(shù)中無染色明視野鏡檢法能較為準確的鑒別甲狀旁腺、脂肪、淋巴結(jié)、胸腺組織，判定甲狀旁腺的可靠性接近術(shù)中冷凍病理檢測結(jié)果。比較術(shù)前術(shù)后術(shù)后iPTH及血清鈣水平發(fā)現(xiàn)，術(shù)后1 d與術(shù)前iPTH相比，iPTH下降有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），而血清鈣下降無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；術(shù)前與術(shù)后30 d iPTH及血清鈣變化均無統(tǒng)計差異（P＞0.05）。表明術(shù)后有一過性甲狀旁腺功能減退，術(shù)后1個月左右甲狀旁腺功能基本恢復(fù)到術(shù)前水平。通過對比術(shù)前術(shù)后甲狀腺功能的變化，進一步說明本研究中無染色明視野鏡檢法在甲狀腺癌手術(shù)中判定甲狀旁腺可靠性高，利于甲狀旁腺的保護和功能的保留。

無染色明視野鏡檢法無需術(shù)中注射顯影劑，無毒副反應(yīng)，僅需要切?。? mm3疑似組織，切取的組織塊體積越小細胞越不容易重疊，也就越容易鑒別。而文獻[25-26]報道甲狀旁腺長5～7 mm，寬3～4 mm，厚2 mm，所以切取＜1 mm3對于原位保護或者自體移植后甲狀旁腺功能影響不大，因此認為該方法安全性較好。相對術(shù)中冷凍病理檢測,它少了冷凍切片、快速染色以及固定等操作步驟，操作過程簡便，耗時短，平均耗費時間約為4～5 min，比術(shù)中冷凍病理學(xué)檢查耗時縮短近25 min?？s短手術(shù)時間，相應(yīng)也降低了手術(shù)麻醉費用。按照60 kg體質(zhì)量全麻麻醉維持費800～1 000元/h的標準計算，縮短25 min可降低約450元左右的麻醉費用。對于誤切的甲狀旁腺組織，避免了較長時間的體外暴露，增加移植的成活率，降低甲狀旁腺功能低下的發(fā)生率。另外，無染色明視野鏡檢法病理檢測費用也比術(shù)中冷凍病理低，因此，其時間經(jīng)濟效益優(yōu)勢明顯，符合衛(wèi)生經(jīng)濟學(xué)原則，值得臨床應(yīng)用推廣。

綜上所述，甲狀腺癌手術(shù)中，無染色明視野鏡檢法辨認甲狀旁腺的具有很高的敏感性和特異性，術(shù)中能準確分辨出甲狀旁腺組織、脂肪組織、淋巴結(jié)組織、 胸腺組織。準確性接近術(shù)中冷凍病理，從而減少甲狀旁腺誤切和錯誤自體移植；同時具有操作簡便、耗時短，費用低廉等優(yōu)點，很大程度上可替代術(shù)中冷凍病理判定甲狀旁腺，值得臨床應(yīng)用推廣。

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