大腸桿菌熱穩(wěn)定腸毒素Ⅰ和卵清蛋白融合蛋白的表達及免疫原性分析

王錄軍，段強德，馮麗麗

(1.渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院,陜西 渭南 714026； 2.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)經(jīng)濟與信息研究所，河南 鄭州 450002)

目前，產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(EnterotoxigenicEscherichiacoli,ETEC)仍然是引起人和動物腹瀉的主要細菌性病原[1-2]。ETEC引起的腹瀉每年造成30萬～50萬人死亡，同樣也給全球畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。ETEC引起腹瀉的毒力因子主要包括黏附素和腸毒素。其中，腸毒素包括熱穩(wěn)定腸毒素(Heat-stable toxin，STa)和熱敏腸毒素(Heat-labile enterotoxin，LT)。ETEC菌株首先在粘附素介導(dǎo)下，粘附宿主小腸上皮細胞，定植于宿主小腸表面。然后通過分泌毒素，破壞宿主小腸上皮細胞內(nèi)電解質(zhì)平衡，從而引起腹瀉[3]。疫苗被認為是預(yù)防ETEC引起腹瀉最有效的方法，絕大多數(shù)ETEC疫苗抗原僅僅集中于粘附定植因子或LT，不能起到完全的保護效果。

STa毒素是ETEC產(chǎn)生的一種主要腸毒素，是僅含有18個(豬源)或19個氨基酸(人源)的短肽，對兒童和幼齡動物均具有較強的毒性作用。流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，與腹瀉相關(guān)的ETEC分離株中，超過60%的菌株均攜帶有STa基因[4-5]。因此，有效的ETEC疫苗，除了包含黏附素和LT外，還必須能誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和STa毒性的抗體。但是STa多肽本身免疫原性差，只有與載體蛋白偶聯(lián)，才能夠被機體識別并產(chǎn)生免疫應(yīng)答[6-8]。鑒于此，本研究利用基因工程方法，將人源STa基因與優(yōu)化后的雞ovalbumin基因嵌合后融合表達，以期獲得具有免疫原性的3×STa-ovalbumin融合蛋白，旨在為ETEC疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。

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1 材料和方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及試劑

E.coliDH5α，E.coliBL21(DE3)和pET-28a質(zhì)粒均由渭南職業(yè)技術(shù)學(xué)院微生物實驗室保存。IPTG購于美國Sigma公司，IRDye標記的羊抗兔IgG購于美國NE公司，細菌蛋白質(zhì)提取液購于美國Thermo Fisher公司，蛋白質(zhì)復(fù)性試劑盒購于美國Novagen公司，STa陽性血清(兔源)由美國堪薩斯州立大學(xué)Ronald教授饋贈。

1.2 3×STa-ovalbumin融合基因的構(gòu)建

首先截斷雞ovalbumin基因的內(nèi)含子，然后優(yōu)化其在E.coli中的表達密碼子。3個拷貝的人源STa基因利用重疊延伸PCR技術(shù)(Gene splicing by overlap extension PCR，SOE-PCR)分別嵌合至優(yōu)化后的雞ovalbumin基因的N端、C端和中部。其中，第1個拷貝的STa基因通過GPVD接頭連接于ovalbumin基因的5′端，第2個拷貝的STa基因位于ovalbumin基因的第191～192個氨基酸之間，而第3個拷貝的STa基因通過GPVD接頭連接于ovalbumin基因的3′端(圖1)。

電阻率值為3.64～11.22 Ωm，聲波時差為231.58～302.57 μs/m。從電測曲線解釋成果可以看出視電阻率值有升高現(xiàn)象，同時聲波時差值變小。

1.3 3×STa-ovalbumin的原核表達與鑒定

為驗證3×STa-ovalbumin融合蛋白的免疫原性和結(jié)構(gòu)完整性，將12只8周齡的BALB/c雌性小鼠隨機分為試驗組和對照組。試驗組注射：表達融合蛋白(50 μg)+2 μg 熱敏腸毒素雙突變體(Double mutant heat-labile enterotoxin,dmLT)佐劑；對照組注射：PBS(50 μL)+2 μg dmLT佐劑。采用皮下多點注射方式進行首次免疫。隨后每隔2周用相同的劑量進行第2次免疫和第3次免疫。第3次免疫后14 d，CO2處死小鼠，心臟取血，分離血清，保存于-20 ℃待用。

1.4 小鼠免疫試驗

將3×STa-ovalbumin嵌合基因克隆至表達載體pET-28a，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-3×STa-ovalbumin，然后轉(zhuǎn)入感受態(tài)細胞E.coliBL21(DE3)中，次日挑取單個菌落于37 ℃過夜培養(yǎng)，取2 mL過夜培養(yǎng)的菌液接種于200 mL含卡那霉素的YT培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600 nm達到0.5時，加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG繼續(xù)誘導(dǎo)4 h。收集的菌體根據(jù)細菌蛋白質(zhì)提取液說明書進行提取，蛋白質(zhì)復(fù)性根據(jù)Novagen蛋白質(zhì)復(fù)性試劑盒說明書進行具體操作。純化后的融合蛋白進行12%SDS-PAGE電泳分析；以STa陽性血清(兔源)為一抗(1∶3 000)，IRDye標記的羊抗兔IgG(1∶10 000)為二抗進行Western blot分析。

1.5 免疫血清抗體滴度檢測

3×STa-ovalbumin融合蛋白經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達后，主要以包涵體的形式存在。通過包涵體洗滌的方法對目的蛋白進行純化，得到純度超過90%的融合蛋白。用12%SDS-PAGE電泳分析，目的蛋白分子質(zhì)量約為42 ku，與預(yù)期的大小一致(圖2)。用STa陽性血清通過Western blot檢查融合蛋白的反應(yīng)原性，結(jié)果表明，特異性的目的條帶能夠被STa陽性血清識別(圖2)，說明融合蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

血清體外中和試驗參照Ruan等[9]的方法進行操作。先取免疫組和對照組的血清各30 μL，預(yù)先與2 ng純化的STa毒素于室溫孵育30 min，然后混合加入24孔細胞培養(yǎng)板中已經(jīng)長滿的T-84細胞中，繼續(xù)在CO2細胞培養(yǎng)箱孵育1 h。去除上清，PBS洗滌3次后，細胞用0.1 mol/L HCl+0.05% Triton X-100裂解。離心收集細胞上清，細胞內(nèi)環(huán)磷酸鳥苷(Cyclic guanosine monophosphate，cGMP)濃度根據(jù)EIA cGMP試劑盒(Enzo Life公司，美國)說明書測定。以加入2 ng STa毒素的孔作為陽性對照孔；而只加入細胞培養(yǎng)基的孔作為T-84細胞內(nèi)cGMP的基準濃度孔。

1.6 體外毒素中和試驗

供給側(cè)改革的中心任務(wù)是推進創(chuàng)新以及提高全要素生產(chǎn)率，所以，高校必須充分利用自身科研資源優(yōu)勢，促使各種應(yīng)用性和基礎(chǔ)性研究及其成果集約化，以實現(xiàn)創(chuàng)新驅(qū)動發(fā)展戰(zhàn)略相關(guān)任務(wù)。同時，高校應(yīng)立足于地區(qū)重點行業(yè)企業(yè)以及國家戰(zhàn)略發(fā)展需要，積極打造高校、企業(yè)、科研單位以及政府部門四方合一的產(chǎn)學(xué)研協(xié)同創(chuàng)新機制，以致力于在技術(shù)創(chuàng)新和科研創(chuàng)新等方面獲得巨大突破[4]。

1.7 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，采用Student’st-test軟件進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 3×STa-ovalbumin融合蛋白的SDS-PAGE和Western blot分析結(jié)果

采用間接酶聯(lián)免疫吸附測定方法(ELISA)檢測免疫血清中STa抗體的滴度。以3×STa-ovalbumin化學(xué)偶聯(lián)物作為包被抗原，包被劑量為10 ng/孔；倍比稀釋的待檢血清為一抗，1∶3 300倍稀釋的羊抗鼠HRP-IgG二抗(Sigma公司，美國)為二抗。TMB顯色后，光密度(OD)采用微孔過氧化物酶底物2-C系統(tǒng)(KPL公司，美國)于650 nm波長處測定。以待測血清OD值減去空白對照OD值大于0.3的最高稀釋倍數(shù)(OD×稀釋倍數(shù))計算免疫血清抗體滴度，以lg值表示。同時以對照組血清作為陰性對照。

M.蛋白質(zhì)Marker; 1.SDS-PAGE融合蛋白條帶；2.Western blot融合蛋白條帶

2.2 免疫血清STa抗體滴度檢測

體外毒素中和試驗表明(表1)，來源于免疫組的血清能在體外中和STa毒素的毒性作用。2 ng STa陽性對照組和2 ng STa+對照血清組中cGMP濃度分別為50.05 pmol/mL和45.95 pmol/mL，而2 ng STa+免疫血清組中cGMP濃度顯著降低，為13.76 pmol/mL。

圖3 小鼠血清STa抗體滴度

2.3 STa抗體體外中和作用

采用間接ELISA方法對各組小鼠血清中抗STa特異性IgG抗體水平進行測定，結(jié)果表明，融合蛋白免疫組每只小鼠均能誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的抗STa抗體，抗體滴度平均達到了2.33；而對照組小鼠均無抗STa特異性抗體產(chǎn)生(圖3)。

表1 體外免疫血清對毒素的中和作用

注：**表示與對照組差異極顯著(P<0.01)。

3 結(jié)論與討論

疫苗是預(yù)防ETEC感染最有效和最經(jīng)濟的策略，但是至今仍無有效的商品疫苗。目前，ETEC疫苗的研發(fā)仍面臨著諸多技術(shù)挑戰(zhàn)[10]。首先是不同ETEC菌株表達的毒力因子(黏附素和毒素)的異質(zhì)性，造成相互之間缺乏交叉保護力。其次是由于LT和STa的毒性作用，不能直接作為疫苗抗原。此外，STa毒素本身的免疫原性差，機體不能誘導(dǎo)針對STa毒素的抗體，從而對產(chǎn)生STa毒素的ETEC菌株的感染缺乏有效的保護。STa毒力因子在ETEC分離菌株中普遍存在[4-5]，由此推測，一種具有廣泛保護力且有效的ETEC疫苗必須能誘導(dǎo)產(chǎn)生針對STa毒素的中和抗體。

STa多肽本身免疫原性差，只有與具有強免疫原性的載體蛋白融合或化學(xué)偶聯(lián)后才能獲得免疫原性[6-8]。但是STa的抗原性和毒性在與載體遺傳融合或化學(xué)偶聯(lián)的過程可能發(fā)生改變，而這是誘導(dǎo)產(chǎn)生中和STa毒素毒性作用抗體所需要的。本研究中，將3個拷貝的STa基因和優(yōu)化的雞ovalbumin基因嵌合后表達的融合蛋白免疫小鼠，能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生高水平的抗STa特異性的中和抗體，并且產(chǎn)生的抗STa抗體在體外具有中和STa毒素毒性的效果。這表明當人源的STa毒素與強免疫原性的載體雞ovalbumin蛋白融合后，獲得了免疫原性，并且STa本身的結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)生改變。融合蛋白的穩(wěn)定性以及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等理化性質(zhì)有待進一步的研究。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 運用SPSS 20.0及MedCalc 12.7統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以表示。當數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布時，采用獨立樣本t檢驗。運用受試者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲線分析1H-MRS中各代謝物比值鑒別HIE患兒與對照組新生兒的最佳閾值、靈敏度及特異度。檢驗水準(α)為0.05。

綜上所述，構(gòu)建的3×STa-ovalbumin融合蛋白能夠通過E.coli原核表達系統(tǒng)高效表達，具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性，免疫后能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生高水平的抗STa特異性的中和抗體，可以作為ETEC疫苗的候選抗原進行深入研究。

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