T-2毒素完全抗原制備及免疫學檢測方法的建立

郉云瑞，孫亞寧，姚靜靜，王英華，郝慧芳，柴書軍，李俊鵬，胡驍飛*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學院 動物免疫學重點實驗室，河南 鄭州 450002； 2.河南省動物疫病預(yù)防控制中心，河南 鄭州 450008； 3.平頂山農(nóng)業(yè)科學院，河南 平頂山 467000)

T-2毒素是一種倍半萜烯化合物，是單端孢霉 A 型毒素中最主要也是毒性最強的一種，可由多種真菌產(chǎn)生，是污染田間作物、庫存谷物及動物飼料的主要毒素之一[1]。 人和動物誤食被污染的谷物或飼料會引起急性或慢性中毒[2-3]，繼而造成免疫系統(tǒng)[4-5]、神經(jīng)系統(tǒng)[6]、生殖系統(tǒng)[7-8]及消化系統(tǒng)[9-10]等方面的機能障礙。1973年，聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)和世界衛(wèi)生組織(WHO)把T-2毒素同黃曲霉素一樣作為自然存在的最危險的食品污染源。1987年，F(xiàn)AO和WHO對面粉、大米等禾谷類作物中T-2毒素含量做出限量要求，不得超過100 μg/kg。我國食品安全國家標準對食品中T-2毒素限量無明確要求，但GB 21693—2008要求飼料中T-2毒素含量不能超過1 000 μg/kg。

為了減少T-2毒素對動物及人類危害，科研工作者建立了多種T-2毒素的監(jiān)控檢測方法,主要有氣相色譜法(GC)[11-12]、色質(zhì)聯(lián)用法(LC-MS/MS)[13-16]、高效液相色譜法(HPLC)及衍生方法[17-19]。儀器檢測方法盡管靈敏、準確，但對操作者的技術(shù)要求高，且步驟繁瑣、儀器昂貴，不適于現(xiàn)場大批量快速篩查，限制了其使用范圍。免疫學快速檢測方法具有成本低、速度快、靈敏度高等優(yōu)點，越來越受到人們的重視，已經(jīng)在獸藥殘留、農(nóng)藥殘留、霉菌毒素污染領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[20-24]，其中膠體金試紙因具有快速、靈敏、準確等優(yōu)點，且是唯一能實現(xiàn)一步操作的免疫學快速檢測技術(shù)，在現(xiàn)場篩查中應(yīng)用最為廣泛。目前，關(guān)于T-2毒素免疫學檢測方法已有報道，王坤等[25]成功制備出T-2完全抗原，獲得鼠源多克隆抗體，IC50為324 ng/mL；Li等[26]建立在單克隆抗體基礎(chǔ)上檢測水稻中T-2毒素的方法，IC50為22.09 ng/mL；Li等[27]基于單克隆抗體建立檢測T-2毒素的化學發(fā)光免疫分析法，IC50為33.28 ng/mL，但至今未見T-2毒素膠體金檢測試紙的報道。檢測試紙為完全抑制模式，同時檢測時需要對樣品進行有機試劑處理，進行20倍以上的稀釋才可用于檢測，因此，要求抗體具有特別高的靈敏性。為制備高靈敏的T-2毒素抗體，通過分析T-2毒素的分子結(jié)構(gòu)，采用新的方法合成T-2毒素的人工抗原，免疫小鼠，制備出靈敏度高、特異性強的多抗血清，并初步建立了T-2毒素免疫學檢測方法，旨在為靈敏度高、特異性強的T-2毒素單克隆抗體制備及T-2毒素膠體金檢測試紙的研制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 T-2毒素、N,N′-羰基二咪唑(CDI)、伏馬菌素B1(FB1)、黃曲霉毒素B1(AFB1)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)及赭曲霉毒素A(OTA)均為Sigma產(chǎn)品；牛血清蛋白(BSA)和雞卵清蛋白(OVA)均為Pierce產(chǎn)品；羊抗鼠酶標二抗(GaMIgG-HRP)為華美生物工程有限公司產(chǎn)品；其他試劑均為分析純。

稀釋液(PBS)：0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖溶液，pH值為7.4；包被液(CBS)：0.05 mol/L的碳酸鹽緩沖液；洗液(PBST)：含0.05% Tween-20 的PBS混合液；封閉液:豬血清濃度為5%的PBST溶液；顯色液：TMB顯色液；終止液：2 mol/L的硫酸溶液。

1.1.2 供試動物 6～8周齡SPF級BALB/c小鼠，購自鄭州大學醫(yī)學院實驗動物中心，由河南省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室飼養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 T-2毒素完全抗原的合成 稱取2 mg T-2毒素、13 mg CDI溶于500 μL無水四氫呋喃，室溫反應(yīng)1 h，將溶液烘干，取100 μL 二甲基甲酰胺(DMF)將烘干后的產(chǎn)物溶解備用，將此溶液標記為A液。稱取8 mg BSA溶于1mL PBS中。將BSA溶液緩慢滴加到A液，混勻后室溫反應(yīng)4 h。反應(yīng)產(chǎn)物在PBS溶液中透析3 d，5 000 r/min離心5 min，收集上清-20 ℃凍存?zhèn)溆?。合成路線如圖1。采用同樣的方式合成包被原T-2-OVA。

圖1 T-2-BSA合成路線

1.2.2 T-2毒素完全抗原的鑒定

1.2.2.1 SDS-PAGE鑒定 參照文獻[28]制得12%的分離膠和5%的濃縮膠，濃縮膠和分離膠電壓分別為60 V和90 V，加樣20 μL，蛋白質(zhì)含量為2 μg，考馬斯亮藍染色2～3 h，脫色10～12 h，期間每隔1 h換 1次脫色液，脫色完成后掃描拍照。

1.2.2.2 小鼠免疫鑒定 將制備好的完全抗原T-2-BSA免疫6只 6～8周齡的BALB/c 雌性小鼠，免疫4次，每次免疫間隔2周，免疫劑量為200 μL/只，含蛋白質(zhì)30 μg。第4次免疫10 d后斷尾采血，用 PBS稀釋后5 000 r/min 離心 5 min，取上清，棄去沉淀，制備其多克隆抗血清(pAb)。

采用間接ELISA測定pAb效價。操作步驟如下：用CBS將T-2-OVA稀釋1 000倍，混勻后每孔加 50 μL，37 ℃溫箱中放置2 h后用 PBST洗板5～6次，拍干；每孔加入封閉液200 μL，37 ℃溫箱中放置1.5 h，洗板5～6 次，拍干；每孔用50 μL的PBS 鋪底；在第一排每孔加 50 μL多抗血清，依次往下倍比稀釋，設(shè)陰性對照孔,37 ℃溫箱放置 15 min，洗板、拍干；每孔加 50 μL稀釋過的羊抗鼠酶標二抗(用含5%豬血清的 PBST進行 1∶1 000 倍稀釋)，37 ℃溫箱放置30 min，洗板、拍干；每孔加 50 μL顯色液，室溫顯色 10 min；每孔加 50 μL終止液，終止顯色，用酶標儀測OD450值；結(jié)果判定：待測孔OD450/陰性孔OD450≥2.1,則為陽性孔。

采用間接競爭ELISA測定pAb敏感性(IC50)。取包被封閉好的96孔板，每孔用50 μL的PBS 鋪底；每孔加50 μL不同質(zhì)量濃度的T-2毒素標準品溶液(500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8 125、3.90 625、1.953 125 ng/mL)作為抑制劑，每孔再加效價OD450值為1.0 左右的前一孔多抗血清50 μL，后續(xù)步驟同血清效價的測定。

1.2.3 T-2免疫學檢測方法的初步建立

1.2.3.1 T-2-OVA最佳稀釋倍數(shù)和T-2 pAb最佳工作質(zhì)量濃度的確定 采用方陣滴定法：用CBS將包被原稀釋至500、1 000、2 000、4 000、8 000倍，抗體以不同的比例進行稀釋，依照間接ELISA操作步驟測定后，選擇不同包被濃度下OD450值在1.0左右的孔所對應(yīng)的上一個T-2 pAb稀釋倍數(shù)，采用阻斷ELISA測定其敏感性，敏感性較好的一組所對應(yīng)的質(zhì)量濃度即為包被原最佳稀釋倍數(shù)和抗體最佳工作質(zhì)量濃度。

1.2.3.2 標準曲線的繪制 配制不同質(zhì)量濃度的T-2毒素標準品溶液(同小鼠敏感性測定時的標準品質(zhì)量濃度)，用已建立的間接競爭ELISA方法進行測定。以T-2標準品質(zhì)量濃度(ng/mL)的對數(shù)值為橫坐標，B/B0(B0：T-2 標準品質(zhì)量濃度為0時的OD450；B：不同質(zhì)量濃度T-2標準品的 OD450)為縱坐標，繪制標準曲線。計算出試劑盒的IC50和檢測限(以LOD表示)。

1.2.3.3 試劑盒特異性測定 特異性采用交叉反應(yīng)率來表示。選擇FB1、AFB1、DON、ZEN、OTA及載體蛋白BSA和OVA作為競爭物，測定各競爭物的IC50，交叉反應(yīng)率為試劑盒的IC50與各競爭物的IC50的百分比。

2 結(jié)果與分析

2.1 T-2毒素完全抗原的鑒定結(jié)果

由圖2可知，T-2-BSA的泳動速度小于BSA，可見 BSA的分子質(zhì)量小于T-2-BSA，表明 T-2與BSA偶聯(lián)成功。

M.蛋白質(zhì)Marker；1.BSA；2.T-2-BSA

2.2 T-2毒素多抗血清的鑒定結(jié)果

由表1可知，免疫的6只小鼠所產(chǎn)生的抗體效價高達1×104以上，說明偶聯(lián)后的完全抗原具有較好的免疫效果。選擇OD450在1.0左右孔對應(yīng)的上一孔多抗血清稀釋倍數(shù)，采用間接競爭ELISA測定其IC50。由表2可知，免疫的6只小鼠血清均對T-2毒素有抑制作用，除1號小鼠IC50在500 ng/mL以上，其他小鼠IC50均在100 ng/mL以下，且2號和6號小鼠抗體敏感性相對較高，IC50在15 ng/mL左右。由此可見，本試驗所合成的完全抗原T-2-BSA偶聯(lián)成功，且能夠有效刺激動物機體產(chǎn)生抗T-2毒素的特異性抗體。

2.3 T-2毒素免疫學檢測方法的建立

2.3.1 T-2-OVA最佳稀釋倍數(shù)和T-2 pAb最佳工作濃度的確定 采用方陣滴定法測定不同包被原稀釋倍數(shù)下6號小鼠多抗效價,結(jié)果見表3。選擇OD450值在1.0左右時所對應(yīng)的上一孔抗體稀釋度進行間接競爭ELISA檢測，由圖3可知,在包被原為1∶1 000倍稀釋，抗體在1∶1 500 倍稀釋時其IC50最低，敏感性最高，即初步確定包被原稀釋度為1∶1 000，抗體稀釋度為1∶1 500。

表1 間接ELISA測定的多抗血清效價

表2 間接競爭ELISA測定的多抗血清抑制效價

表3 不同包被原稀釋度下的血清效價測定結(jié)果

圖3 不同抗原抗體稀釋度下的IC50變化曲線

2.3.2 T-2毒素間接競爭ELISA檢測試劑盒的標準曲線繪制 根據(jù)已確定的包被濃度和抗體工作濃度確定反應(yīng)體系，初步建立間接競爭ELISA檢測方法。利用所建立的間接競爭ELISA檢測體系繪制標準曲線如圖4所示，標準曲線的線性回歸方程為y=-0.178 6x+0.664 5，R2=0.966 2，根據(jù)回歸方程計算出間接競爭ELISA檢測試劑盒的IC50為 8.34 ng/mL，檢測限為0.048 ng/mL。

圖4 T-2毒素間接競爭ELISA檢測試劑盒標準曲線

2.3.3 間接競爭 ELISA檢測試劑盒特異性鑒定結(jié)果 由表4可知，間接競爭ELISA檢測試劑盒與其他霉菌毒素及載體蛋白BSA和OVA的交叉反應(yīng)率均小于 0.1%，說明其具有良好的特異性。

表4 多抗血清與真菌產(chǎn)物的交叉反應(yīng)

3 結(jié)論與討論

T-2毒素由于分子質(zhì)量小，屬于半抗原范疇，只有與大分子物質(zhì)結(jié)合后，才能刺激動物機體產(chǎn)生特異性抗體。相關(guān)報道[25-27,29]均采用琥珀酸酐法或戊二酸酐法先將T-2毒素分子上的羥基改造成羧基，再利用混合酸干法或碳化二亞胺法將改造后的半抗原與載體蛋白偶聯(lián)。采用以上方法合成T-2毒素完全抗原，制備出的抗原免疫效果較差，且產(chǎn)生的特異性抗體較少。上述方法前期半抗原改造操作比較復(fù)雜，對溫度要求較高，后期與蛋白質(zhì)偶聯(lián)時，混合酸酐法會引入新的活性基團，產(chǎn)生新的抗原決定簇，增加交叉反應(yīng)；碳化二亞胺法雖操作簡單，但其縮合沒有選擇性，易造成蛋白質(zhì)間的自連，降低偶聯(lián)效率。本研究采用CDI一步法合成完全抗原T-2-BSA和包被原T-2-OVA，CDI是一種具有較強反應(yīng)活性的化合物，它可與羧基、氨基、羥基等官能團直接進行反應(yīng)，不需要對半抗原進行其他活性基團的引入，操作簡單，大大減少副反應(yīng)產(chǎn)物的生成，從而提高偶聯(lián)效率，由于CDI易吸收空氣中的水分而變質(zhì)，因此，操作應(yīng)在除濕干燥環(huán)境下進行。本試驗成功制備出T-2毒素完全抗原，并獲得了效價高、敏感性強的多克隆抗體。

關(guān)于包被抗原和抗體稀釋度的確定，相關(guān)報道[30-31]通常采用間接ELISA法的棋盤試驗來確定，這種方法比較適用于只用效價作為評價依據(jù)的大分子的檢測，而小分子物質(zhì)的檢測是以其抗體敏感性作為評價依據(jù)，因此，棋盤法所選取的最佳濃度無法體現(xiàn)出小分子抗體的特性。本試驗采用間接競爭ELISA方法測定抗體在不同包被原濃度下的敏感性，選擇抗體敏感性最好的一組作為最佳反應(yīng)體系濃度，不僅可以最大化地體現(xiàn)出小分子抗體的特性，而且更具有參考意義。

通過細胞融合制備的單克隆抗體靈敏度要比相應(yīng)的多克隆抗體血清的靈敏度提高10倍甚至更高[32-33]。本試驗中通過動物免疫后，多克隆抗體血清的IC50值為8.34 ng/mL，制備的單克隆抗體IC50值應(yīng)該在0.83 ng/mL以下。相對而言，該多克隆抗體血清具有較高的靈敏度，一般認為，單克隆抗體制備時小鼠細胞融合的好壞直接影響試驗結(jié)果，其取決于多抗血清敏感性的高低，本試驗所制備的多抗血清敏感性高，為以后進行細胞融合制備敏感性強的單克隆抗體奠定了良好的基礎(chǔ)。

綜上，成功制備出了T-2毒素完全抗原，通過免疫小鼠獲得了效價高、靈敏度高的多抗血清，并在此基礎(chǔ)上初步建立了T-2毒素間接競爭ELISA檢測方法，該方法靈敏度高、特異性強，為進一步監(jiān)控T-2毒素污染提供了技術(shù)支撐。

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