豆粕發(fā)酵產(chǎn)蛋白酶功能菌株的篩選及鑒定

賈笑穎，孫佳琪，高同國*，雷白時，茹雪峰，朱寶成

(1.河北農(nóng)業(yè)大學 生命科學學院，河北 保定 071001; 2.保定市清苑區(qū)第一中學，河北 保定 071100)

豆粕是大豆榨取豆油后的副產(chǎn)物，粗蛋白質(zhì)含量高達30%～50%，并含多種氨基酸，是飼料工業(yè)中應(yīng)用最為廣泛的植物性蛋白質(zhì)原料[1]，常用于家禽配方飼料[2]。未經(jīng)處理的豆粕由于蛋白質(zhì)分子質(zhì)量較大，并且含抗營養(yǎng)因子成分[3]，被消化、分解速率緩慢，極大地影響了動物對豆粕的吸收利用。因此，消除大分子蛋白質(zhì)的不利影響，提高動物對豆粕的消化吸收性能一直是人們關(guān)注的熱點。豆粕經(jīng)微生物發(fā)酵后，大分子蛋白質(zhì)降解為易吸收的小分子蛋白質(zhì)[4-5]，并產(chǎn)生大量具有獨特生理活性功能的活性肽，促進消化、吸收，可調(diào)節(jié)整個消化道對飼料營養(yǎng)物質(zhì)的分解、合成、吸收和利用，進而降低豆粕用量和養(yǎng)殖成本。

優(yōu)良菌株的篩選是豆粕微生物發(fā)酵的關(guān)鍵技術(shù)之一。王偉等[6]篩選到可用于降解豆粕中大分子蛋白質(zhì)的菌株B1，蛋白酶活性達111.8 U/mL。熊濤等[7-8]篩選到2株蛋白酶活性較高的細菌，分別為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌B1和耐酸的枯草芽孢桿菌A-12。劉旭輝等[9]也篩選到1株解淀粉芽孢桿菌，其蛋白酶活性達1 547.49 U/mL。表明以產(chǎn)蛋白酶活性為主要指標，可篩選到能降低豆粕大分子蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的菌株，但目前上述菌株絕大多數(shù)處于實驗室研究階段，缺乏可用于豆粕工業(yè)化大規(guī)模發(fā)酵的菌株。

河北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院微生物實驗室發(fā)酵飼草與飼料研究課題組從事多年飼料原料的微生物發(fā)酵工作，篩選和保存了大量產(chǎn)酸、產(chǎn)蛋白酶的菌株。鑒于此，擬利用現(xiàn)有菌種資源，篩選出適用于豆粕微生物發(fā)酵的高產(chǎn)蛋白酶菌株，并利用該菌株固體發(fā)酵豆粕，以期降解豆粕大分子蛋白質(zhì)，從而提高豆粕飼用價值。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

供試菌株為河北農(nóng)業(yè)大學生命科學學院微生物實驗室保存的30株具有產(chǎn)蛋白酶功能的芽孢桿菌，編號分別為：β-2、β-11、20、57、M4、β-8、46、W-18、β-7、β-6、β-10、Lipro-1、J-4、DB-7-6、ED-3-7、Y-4、N-12、2-27、β-9、M-2、Lipro-2、N-2、β-3、β-4、2709-3、1398、G4、β-1、β-5、M10。

1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(NB)組成：牛肉膏0.5%、蛋白胨1.0%、氯化鈉0.5%，pH值7.0。牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基(NA)：在NB基礎(chǔ)上加入瓊脂2.0%。

脫脂牛奶培養(yǎng)基組成：葡萄糖1.0%、氯化鈉0.5%、瓊脂1.5%，pH值7.2。115 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，冷卻后加入脫脂牛奶(每100 mL加入20 mL脫脂牛奶)，待其凝固后使用。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基組成：豆粕89.0%、玉米粉10.0%、硫酸銨1.0%。

1.3 菌種活化

挑取斜面保存的菌株，采用三區(qū)劃線法接種于NA培養(yǎng)基上，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

1.4 產(chǎn)蛋白酶菌株初篩

以菌株在脫脂牛奶平板上透明圈的大小為指標，篩選具備高產(chǎn)蛋白酶能力的菌株。將活化的30株芽孢桿菌點接到脫脂牛奶平板上，每株芽孢桿菌設(shè)4個重復(fù)。將平板置于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，并分別于24 h和48 h測量透明圈的大小，將從菌落邊緣到透明圈邊緣的距離作為透明圈的半徑。

1.5 產(chǎn)蛋白酶菌株復(fù)篩

以產(chǎn)生的中性蛋白酶和酸性蛋白酶的活性大小為指標，進一步對高產(chǎn)蛋白酶菌株進行篩選。將已活化的單菌落接種于NB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)24 h后，于4 ℃、10 000 r/min離心15 min，取其上清作為粗酶液備用。參照《飼料添加劑酸性、中性蛋白酶活力的測定》[10]中關(guān)于酸性和中性蛋白酶活性的測定方法，測定蛋白酶活性。

1.6 固體發(fā)酵效果試驗

以酸溶蛋白質(zhì)含量為指標，采用豆粕固體發(fā)酵對篩選到菌株的發(fā)酵效果進行測定。將篩選的蛋白酶活性較高的菌株接種于NB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，按6%接種量接種于未滅菌的豆粕固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，含水量50%～60%。以NB培養(yǎng)基代替發(fā)酵液為空白對照。將發(fā)酵料裝入塑料桶中壓實、密封，于室溫下發(fā)酵。參照《飼料原料中酸溶蛋白的測定方法研究》[11]中的方法分別于第15 天和30 天測定酸溶蛋白質(zhì)含量，并按V物料∶V水=1∶5測其pH值。

1.7 菌落、菌體形態(tài)觀察

參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[12]和《微生物學實驗教程》[13]中的方法觀察菌落形態(tài)、大小、邊緣、表面、凹凸度、透明度等特征和經(jīng)革蘭氏染色后的顯微鏡下的菌體形態(tài)。

1.8 16S rDNA擴增

基因組的提取、16S rDNA的擴增及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建參照文獻[14]的方法進行。

1.9 生理生化特性分析

按照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[12]結(jié)合16S rDNA序列比對結(jié)果對細菌進行生理生化特性試驗。試驗中所用試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)蛋白酶菌株初篩結(jié)果

以脫脂牛奶的降解能力作為篩選指標，篩選出透明圈半徑較大的菌株，結(jié)果見圖1。細菌培養(yǎng)48 h的透明圈半徑較大，其中，菌株β-2、β-11、20、57、M4培養(yǎng)24 h后透明圈半徑小于2 mm，48 h小于 4 mm，β-8、46、W-18、β-7、β-6、β-10、Lipro-1、J-4、DB-7-6、ED-3-7、Y-4、N-2、2-27、β-9、M-2、Lipro-2、N-12、β-3、β-4、2709-3、1398、G4、β-1、β-5、M10透明圈半徑在4～10 mm。整體上，β-8、46、W-18、ED-3-7、Y-4、2709-3、N-12、β-1和M10等透明圈半徑較大。

圖1 菌株在脫脂牛奶平板上生長的透明圈半徑大小

2.2 產(chǎn)蛋白酶菌株復(fù)篩結(jié)果

由圖2可知，菌株β-2、Lipro-1未檢測到酸性蛋白酶活性，菌株β-3、β-4、20、β-5、M10和1398的酸性蛋白酶活性小于10 U/mL；菌株β-2、β-9、M-2、β-3、β-4、20、M4、β-5和M10的中性蛋白酶活性較低，小于50 U/mL。

綜合上述結(jié)果，選出9株透明圈半徑大于4 mm、酸性蛋白酶活性大于10 U/mL、中性蛋白酶活性大于50 U/mL的菌株，分別為β-1、ED-3-7、46、N-12、Y-4、2709-3、β-8、G4和W-18，采用豆粕固體發(fā)酵法從上述9株芽孢桿菌中進一步篩選發(fā)酵效果好的菌株。

圖2 菌株酸性蛋白酶和中性蛋白酶活性大小

2.3 菌株固體發(fā)酵效果

采用固體發(fā)酵法對篩選到的9株芽孢桿菌的發(fā)酵效果進行驗證，分別在發(fā)酵的第15天和30天檢測其酸溶蛋白質(zhì)含量的變化，結(jié)果見圖3。發(fā)酵15 d后，酸溶蛋白質(zhì)含量為9.54%～11.94%，發(fā)酵30 d后，酸溶蛋白質(zhì)含量在11%左右，其中N-12菌株最高，達到13.47%，其與對照組和未發(fā)酵豆粕組相比分別提高2.36個百分點和9.81個百分點。根據(jù)中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T 2218—2012中關(guān)于《飼料原料發(fā)酵豆粕》的要求，酸溶蛋白質(zhì)含量應(yīng)大于等于8%，該菌株可用于豆粕大規(guī)模發(fā)酵，其發(fā)酵效果較好。

合適的pH值不僅利于發(fā)酵豆粕的保存，而且可以提高動物采食量和消化吸收能力。本試驗檢測了豆粕發(fā)酵15 d和30 d的pH值，如圖4所示，15 d的pH值為4.5～4.6，而30 d的pH值則更低，為4.3～4.4。

圖3 豆粕接種芽孢桿菌發(fā)酵15 d和30 d后酸溶蛋白質(zhì)含量

圖4 豆粕接種芽孢桿菌發(fā)酵15 d和30 d后pH值變化

2.4 菌株鑒定結(jié)果

使用N-12菌株進行固體發(fā)酵產(chǎn)生的酸溶蛋白質(zhì)含量最高、發(fā)酵效果最好，后續(xù)試驗中通過菌落菌體形態(tài)、16S rDNA序列和菌株生理生化特性對N-12菌株進行種屬鑒定。

2.4.1 菌落、菌體形態(tài)觀察 N-12在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，菌落形態(tài)較小、圓形、表面光滑隆起、白色不透明且具有整齊邊緣。經(jīng)革蘭氏染色后，鏡下可見兩端鈍圓、有芽孢的革蘭氏陽性桿菌。

2.4.2 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 根據(jù)1.8中的方法，以N-12的基因組為模板對其16S rDNA序列進行擴增，并將其PCR產(chǎn)物送深圳華大基因科技有限公司測序，得到1 402 bp的序列。測序結(jié)果提交到NCBI生物信息學網(wǎng)站(基因登錄號：MG066462)，經(jīng)Blast分析后用MEGA 6構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖5)，N-12與BacillussiamensisKCTC 13613T的同源性最高，達99.86%。

圖5 基于16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4.3 菌株生理生化特性 根據(jù)《常見細菌鑒定手冊》對N-12進行生理生化性質(zhì)分析，結(jié)果見表1。N-12的V-P測定、丙二酸利用、檸檬酸利用、糖醇類發(fā)酵、硝酸鹽還原、淀粉水解、產(chǎn)氨試驗、卵磷脂酶、耐鹽(2%NaCl、5%NaCl、7%NaCl、10%NaCl)、運動性檢測、甲基紅反應(yīng)、明膠液化等試驗結(jié)果均顯陽性。熒光色素、吲哚試驗和脲酶試驗為陰性。結(jié)合菌落菌體形態(tài)學觀察、16S rDNA序列、菌株生理生化特性鑒定， N-12菌株為芽孢桿菌(Bacillussiamensis)。

表1 N-12菌株生理生化鑒定結(jié)果

注：+表示陽性；-表示陰性。

3 結(jié)論與討論

豆粕是畜禽重要的植物性蛋白質(zhì)飼料，其蛋白質(zhì)含量高，但大豆蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分子質(zhì)量大，影響其消化吸收利用率。經(jīng)微生物發(fā)酵后的豆粕更利于動物吸收利用，具有更大的應(yīng)用價值[15]。用于豆粕發(fā)酵的微生物通常為產(chǎn)蛋白酶的菌株，對這些菌株的篩選普遍采用酪素平板或脫脂牛奶平板[16]，并已篩選出乳酸菌[17]、曲霉菌[18]、酵母[19]和芽孢桿菌[20]等多種可用于豆粕發(fā)酵的菌株。本試驗中結(jié)合脫脂牛奶平板和蛋白酶活性測定，更直觀反映出菌株產(chǎn)生蛋白酶能力的大小。

豆粕固體發(fā)酵受到菌種、接種量、環(huán)境、發(fā)酵時間等多方面因素的影響[21-24]，并且由于技術(shù)條件限制和成本約束，大規(guī)模豆粕發(fā)酵一般采用生料發(fā)酵。何勇錦等[25-26]分別采用黏紅酵母和乳酸短桿菌KLDS-1發(fā)酵豆粕粉生料，使發(fā)酵豆粕中的小肽含量達到27.00%和26.12%。董偉潔等[27]采用B.methylotrophicusSD48菌株深層發(fā)酵豆粕生料，使酸溶蛋白質(zhì)相對含量達26.24%。本研究中N-12發(fā)酵豆粕后酸溶蛋白質(zhì)含量為13.47%，其發(fā)酵條件還有待于進一步優(yōu)化。

本試驗通過脫脂牛奶平板和蛋白酶活性測定方法，結(jié)合豆粕固體發(fā)酵效果，最終篩選到1株產(chǎn)蛋白酶較高、發(fā)酵效果好的菌株N-12，經(jīng)鑒定該菌株為芽孢桿菌(Bacillussiamensis)，為豆粕發(fā)酵提供了新的菌種資源，為發(fā)酵豆粕的進一步開發(fā)利用提供了理論基礎(chǔ)。

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