百合單萜類物質(zhì)釋放與LhTPS表達(dá)關(guān)聯(lián)性研究

王 婷,樊俊苗,張浩宇,樊瑋鑫,杜 方*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心，山西 太谷 030801)

自古以來，花香就吸引了人們的注意并且滲入到了生活的很多方面，被廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、醫(yī)療等眾多領(lǐng)域。近年來，有關(guān)學(xué)者分別對(duì)玫瑰[1]、桂花[2]、菊花[3]、蘭花[4-5]、梅花[6]和百合[7]等植物的花香進(jìn)行了研究。百合是世界上知名的切花花卉，品種豐富、香型多樣，有墨香、濃香、淡香和無香4種香型[8]，是開展花香研究的優(yōu)良材料。

國內(nèi)外已經(jīng)初步開展了百合花香的研究工作。現(xiàn)已探明百合花瓣是主要的釋香部位[9-10]，其香氣成分隨著百合花的開放程度以及晝夜節(jié)律發(fā)生規(guī)律性的變化[10-12]，單萜類化合物是有香百合花香揮發(fā)物的主要成分，其中月桂烯、羅勒烯和芳樟醇含量較高[11,13]。與有香百合相比，無香百合中單萜類化合物的釋放量很低或檢測(cè)不到[10,13]。

單萜類化合物主要通過4-磷酸-2-甲基赤蘚糖途徑合成，單萜合酶是該生物合成途徑最后一步的關(guān)鍵酶[14-16]，單萜合酶基因的表達(dá)水平是影響單萜化合物含量的主要因素[17-18]?，F(xiàn)今，已從仙女扇[19]、擬南芥[20]、姜花[21]、六出花[22]等中克隆得到羅勒烯、芳樟醇、香葉醇等多個(gè)單萜類合酶基因，發(fā)現(xiàn)這些單萜合酶基因表達(dá)與萜烯產(chǎn)物合成有直接關(guān)系。目前，已從岷江百合、西伯利亞、羅馬廣場(chǎng)和Belladonna花瓣中克隆到LreTPS、Li-mTPS2、LiLiS、LiMyS和LhTPS等單萜合酶基因[9,23-25]。同時(shí)，對(duì)單萜合酶基因的表達(dá)規(guī)律研究表明，百合單萜合酶基因在花被片中表達(dá)量最高，在葉片中也有一定表達(dá)，在雄蕊和柱頭中微量表達(dá)[24]。東方百合西伯利亞芳樟醇合酶基因和月桂烯合酶基因的表達(dá)量高于亞洲百合羅馬廣場(chǎng)，且這2種單萜合成酶基因的表達(dá)規(guī)律隨花朵的開放程度表現(xiàn)出先增加后減少的規(guī)律[23]。

雖然百合花香研究已取得了一些進(jìn)展，但對(duì)百合單萜合酶基因的研究?jī)H局限于少數(shù)種和品種中，且對(duì)于花香揮發(fā)性成分的分析和基因的研究是獨(dú)立進(jìn)行的，尚不清楚主要致香成分與相關(guān)基因的關(guān)聯(lián)性。為此，選取了4種香型百合共13個(gè)品種的花瓣作為試驗(yàn)材料，檢測(cè)每個(gè)品種在花朵發(fā)育的4個(gè)時(shí)期單萜揮發(fā)物的種類和含量；并從中選取不同雜種系的6種材料，研究LhTPS基因在品種間和花朵發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)水平，以確定單萜合酶基因與單萜類揮發(fā)物釋放的關(guān)聯(lián)性，為進(jìn)一步開展百合花香育種研究提供指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 材料

材料選自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝站露地種植的百合共計(jì)13種，包括2種東喇百合(Orienpet hybrids)：羅賓娜(墨香)、木門(墨香)；2種喇叭百合(Trumpet hybrids)：完美(墨香)、橙星(濃香)；4種東方百合(Oriental hybrids)：新娘(濃香)、蒙娜麗莎(濃香)、索邦(濃香)、西伯利亞(濃香)；2種麝亞百合(Longiflorum×Asiatic hybrids)：亮鉆(淡香)、金石(淡香)；1種新鐵炮百合(Liliumformolongi‘Julius’)：朱麗葉(淡香)；2種亞洲百合(Asiatic hybrids)：塞西爾(淡香)、小重瓣(無香)。根據(jù)花被片張開程度將百合花發(fā)育階段分為4個(gè)時(shí)期：顯色期(花被片已充分顯色但未張開)、初開期(花被片略張開，花藥未散粉)、盛開期(花被片完全張開，花藥已散粉)、衰敗期(花被片開始萎蔫，花藥停止散粉)。在17：00—19：00時(shí)間段采集13個(gè)品種、4個(gè)時(shí)期健康植株的花被片，每朵花取一半用于揮發(fā)性成分測(cè)定，另一半用液氮速凍后置于-80 ℃冰箱以備RNA提取。

1.2 頂空固相微萃取

稱取百合花瓣約1.5 g，置于15 mL固相微萃取專用頂空瓶中，用已老化好的萃取頭(Supelco公司，50/30 μm PDMS/DVB/CAR)50 ℃頂空萃取15 min。自動(dòng)進(jìn)樣，在進(jìn)樣口解析5 min。

1.3 GC-MS分析

利用山西農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心共享平臺(tái)的GC-MS分析儀進(jìn)行分析。

GC(Trace ISQ型號(hào)，Thermo公司)工作條件：色譜柱規(guī)格為30 m×0.25 mm×0.25 μm(柱長(zhǎng)×柱內(nèi)徑×柱膜厚)，公司為Thermo，型號(hào)為DB-5MS。載氣為He，流速為1 mL/min。程序升溫過程：起始溫度40 ℃，保持2 min，然后以5 ℃/min的速度升至270 ℃，保持6 min。

MS(Trace ISQ型號(hào)，Thermo公司)工作條件：電離方式為El；電離電壓為70 eV；質(zhì)譜掃描范圍：45～600 amu；離子源溫度為280 ℃；接口溫度為280 ℃。

采用Xcalibur軟件系統(tǒng)，使用NIST譜庫檢索定性。各化合物成分絕對(duì)含量用峰面積表示。

1.4 總RNA提取與反轉(zhuǎn)錄

選擇木門、橙星、索邦、亮鉆、朱麗葉、小重瓣6個(gè)品種提取花瓣總RNA。RNA的提取根據(jù)GenStar公司的TRIGene 總RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量，用NanoDrop 2000C光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度和純度，質(zhì)量合格的RNA保存于-80 ℃超低溫冰箱。

按照GenStar公司的StarScript Ⅱ cDNA 第一鏈合成試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄cDNA，將得到的cDNA溶液稀釋至100 ng/μL，保存于-20 ℃冰箱備用。

1.5 引物的設(shè)計(jì)

以GenBank中LhTPS基因( KR998333 )序列為模板，采用primer 3(http://primer3.ut.ee/)在線設(shè)計(jì)引物(正向引物：5’-AGACTCGCAAGGGTTCAAGG-3’；反向引物：5’-CGTACAAGCTCAGCAGTCCT-3’)，交由生工生物工程有限公司合成。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

以GAPDH為內(nèi)參基因(正向引物：5’-TGATAAGTTTGGGATTGTCGAGGG-3’；反向引物：5’-TTTCTGAGTAGCAGTGATGGCGTG-3’)，利用TaKaRa公司 qRT-PCR試劑盒配置20 μL反應(yīng)體系，包括 SYBR Ⅱ 10 μL、雙蒸水7 μL、cDNA 1 μL、Primer 1.6 μL、ROX 0.4 μL；在7500 Real Time PCR System運(yùn)行qRT-PCR試驗(yàn)，每個(gè)樣本重復(fù)3次。反應(yīng)程序如下：95 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min(熒光)，共40個(gè)循環(huán)；溶解曲線條件為95 ℃ 15 s，54 ℃ 1 min，從54 ℃每30 s上升0.4直到95 ℃，95 ℃ 30 s(熒光)，54 ℃ 15 s。

1.7 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

利用HemI 1.0軟件以單萜化合物檢測(cè)得到的峰面積繪制百合單萜類化合物含量熱圖，采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量，采用SAS和LSD法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及多重比較，利用Origin 6.0軟件繪制斷層圖并進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 百合單萜類物質(zhì)的釋放規(guī)律

13種百合4個(gè)時(shí)期單萜類物質(zhì)的組成和釋放規(guī)律如圖1所示。每種百合檢測(cè)到的單萜化合物種類各不相同，在這13種百合4個(gè)時(shí)期中，共鑒定出34種單萜化合物，含量大于1%的如圖1所示，共18種。萜烯化合物中含量較高的是羅勒烯、芳樟醇和1,8-桉葉素。除無香型小重瓣無羅勒烯釋放外，其他百合花香揮發(fā)物中均含有較多羅勒烯，平均含量為56.2%，芳樟醇次之，含量為18.7%。值得關(guān)注的是，東喇百合和喇叭百合的釋放物中，1,8-桉葉素的含量最高，占單萜總釋放量的93.93%，超過了羅勒烯的含量，推測(cè)這是形成這些百合特殊麝香氣味的重要化合物。無香百合小重瓣僅在初開期檢測(cè)到芳樟醇一種單萜類化合物。由此推測(cè)，可以根據(jù)單萜化合物的成分對(duì)百合的香型進(jìn)行分類。

在有香百合中，單萜類物質(zhì)的釋放與花的發(fā)育時(shí)期之間均表現(xiàn)出一定的相關(guān)性。同一個(gè)品種4個(gè)時(shí)期的百合所檢測(cè)到的單萜化合物種類相近，含量不同。羅賓娜、完美、金石、朱麗葉4個(gè)品種在初開期單萜化合物種類和含量達(dá)到最高，隨著發(fā)育進(jìn)程，在盛開期和衰敗期依次減少；其余的8個(gè)有香百合品種隨發(fā)育進(jìn)程釋放的單萜化合物種類和含量依次增加，在盛開期達(dá)到最高值，隨后釋放量減少?？梢钥闯觯幢闶峭粋€(gè)雜種系，不同品種的百合在發(fā)育過程中單萜類物質(zhì)的成分及含量的變化規(guī)律也可能不同，但整體上單萜類化合物的成分和含量保持著先增加后減少的變化規(guī)律。

1表示顯色期，2表示初開期，3表示盛開期，4表示衰敗期；藍(lán)色表示低水平含量，綠色表示中等水平含量，紅色表示高水平含量。其他表示相對(duì)含量小于1% 的單萜類化合物

2.2 LhTPS基因在花瓣4個(gè)發(fā)育時(shí)期不同品種中的表達(dá)特征

在顯色期和盛開期，LhTPS基因在墨香型百合木門和濃香型百合橙星、索邦中的表達(dá)量皆顯著高于清香型百合亮鉆、朱麗葉和無香型百合小重瓣中LhTPS基因的表達(dá)量(圖2)。在初開期，LhTPS基因在墨香型百合木門和濃香型百合橙星中的表達(dá)量顯著高于其他4種百合中LhTPS基因的表達(dá)量。在衰敗期，墨香型百合木門中LhTPS基因的表達(dá)量顯著高于在其他5種百合中的表達(dá)量。

同一時(shí)期不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

LhTPS基因在木門和橙星中，初開期和盛開期的表達(dá)量都顯著高于顯色期和衰敗期，其中，在木門的盛開期比初開期顯著高表達(dá)，在橙星初開期和盛開期的表達(dá)差異不顯著；在小重瓣的初開期中比其他3個(gè)時(shí)期顯著高表達(dá)；在索邦、亮鉆和朱麗葉中沒有明顯的表達(dá)規(guī)律(圖3)。

同一品種不同小寫字母表示差異顯著 (P<0.05)

2.3 LhTPS基因的表達(dá)水平與單萜化合物含量的相關(guān)性分析

使用Origin 6.0對(duì)5種有香百合中對(duì)LhTPS基因的相對(duì)表達(dá)量與各單萜類物質(zhì)依次進(jìn)行相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，在盛開期時(shí)，LhTPS基因表達(dá)水平與羅勒烯和芳樟醇2種化合物的含量顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.968和0.934，其中LhTPS基因表達(dá)水平與羅勒烯的含量極顯著相關(guān)(圖4)。由此可見，LhTPS基因的表達(dá)對(duì)于羅勒烯和芳樟醇2種化合物的合成具有重要的作用。

圖4 LhTPS基因的表達(dá)水平與羅勒烯和芳樟醇含量的相關(guān)性

3 結(jié)論與討論

通過研究13種百合4個(gè)時(shí)期單萜類物質(zhì)的組成和含量發(fā)現(xiàn)，有香百合釋放的單萜類化合物種類和含量都較無香百合釋放的多，此結(jié)果與Kong等[7,10]、張輝秀等[13]、Hu等[26]從不同香型百合揮發(fā)物的成分所檢測(cè)出的結(jié)果相一致。此外，各個(gè)品種隨其發(fā)育進(jìn)程也表現(xiàn)出了一定的規(guī)律：?jiǎn)屋苹衔锏姆N類和含量隨發(fā)育進(jìn)程先增大后減小，在初開期或盛開期達(dá)到了最高值，這不僅與白天堂百合[11]和西伯利亞百合[12]隨發(fā)育時(shí)期表現(xiàn)出的規(guī)律相一致，在其他植物如水仙[27]和紫藤[28]的不同開花期也發(fā)現(xiàn)了同樣的規(guī)律。同時(shí)，與張輝秀等[13]、Kong等[10]報(bào)道結(jié)果一致的是，本研究發(fā)現(xiàn)在東方百合、麝香百合、新鐵炮百合和有香的亞洲百合中，羅勒烯是百合的關(guān)鍵致香成分，個(gè)別東方百合除羅勒烯外也含有大量的芳樟醇，而東喇百合和喇叭百合則釋放出較多的1,8-桉葉素。不同的揮發(fā)性化合物的含量和種類使得百合成為香味富有變化的芳香植物，提供了百合作為模式花香植物研究的可能性。

不同百合品種其LhTPS基因表達(dá)量不同。從整體上來說，墨香型和濃香型百合的LhTPS基因表達(dá)水平高于淡香型和無香型百合。唐彪等[23]從濃香型的西伯利亞和淡香型的羅馬廣場(chǎng)百合花瓣中克隆得到芳樟醇合酶基因Li-LiS和月桂烯合酶基因Li-MyS，發(fā)現(xiàn)在花蕾、半開、盛開、衰敗4個(gè)花期中，西伯利亞花瓣2個(gè)單萜合成酶基因表達(dá)水平均高于羅馬廣場(chǎng)，這與本研究在顯色期、初開期、盛開期的研究結(jié)果相一致。但在本試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)在衰敗期時(shí)，除墨香型百合木門中LhTPS基因的表達(dá)量顯著高于在其他5種百合中的表達(dá)量外，其余香型百合中LhTPS基因的表達(dá)量并沒有顯著差異，這可能與本試驗(yàn)所采用的百合品種有關(guān)，有待繼續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果。

木門、橙星和小重瓣的單萜合酶基因表達(dá)水平隨發(fā)育進(jìn)程表現(xiàn)出先增加后減少的規(guī)律，這與唐彪等[23]發(fā)現(xiàn)的芳樟醇合酶基因和月桂烯合酶基因這2種單萜合成酶基因的表達(dá)規(guī)律隨花朵的開放程度表現(xiàn)出先增加后減少的規(guī)律相一致。但是，奇怪的是，索邦、亮鉆和朱麗葉的單萜合酶基因表達(dá)水平?jīng)]有明顯的變化規(guī)律，可能與其參與調(diào)控的關(guān)鍵酶和底物供應(yīng)水平有關(guān)。

LhTPS基因的表達(dá)水平與單萜化合物含量的相關(guān)性分析表明，在盛開期時(shí)，LhTPS基因與羅勒烯的合成極顯著相關(guān)，與芳樟醇的合成顯著相關(guān)。羅勒烯在所有有香百合中均被檢測(cè)到，芳樟醇是個(gè)別東方百合花香化合物中主要的致香成分，因此，LhTPS基因在研究百合花香分子育種等方面具有很大的研究?jī)r(jià)值，需要繼續(xù)進(jìn)行基因功能驗(yàn)證。花香代謝調(diào)控復(fù)雜，因此需要繼續(xù)同時(shí)結(jié)合代謝路徑關(guān)聯(lián)性以及調(diào)控分析探索百合花香調(diào)控的機(jī)制。

單萜類物質(zhì)含量的高低，被認(rèn)為是百合香味差異的原因之一。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著百合花朵的開放，其香氣成分中單萜類物質(zhì)的含量表現(xiàn)出先增加后減少的規(guī)律，有香百合的主要單萜類成分為羅勒烯和芳樟醇，但喇叭百合和東喇百合中的單萜類成分主要是1,8-桉葉素和羅勒烯。喇叭百合、東喇百合和東方百合的LhTPS基因表達(dá)水平高于麝香百合和亞洲百合。盛開期時(shí)，LhTPS基因的表達(dá)水平與羅勒烯和芳樟醇2種化合物的合成具有顯著關(guān)聯(lián)性，因此LhTPS基因在研究百合花香分子育種等方面具有很大的研究?jī)r(jià)值，本研究為百合花香育種研究奠定了基礎(chǔ)。

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