球孢白僵菌對3種蘋果病原真菌的抑制作用

索相敏，馬 斌，郝 婕，劉鐵錚，馮建忠，鄢新民，王獻革，李學營*

(1.河北省農林科學院 石家莊果樹研究所，河北 石家莊 050061； 2.河北農業(yè)大學 植物保護學院，河北 保定 071000)

中國是世界上最大的蘋果生產國，蘋果的種植面積和產量均居世界第一[1]。近幾年我國蘋果種植面積不斷擴大的同時，蘋果樹病害也愈加嚴重，其中蘋果腐爛病、蘋果輪紋病和蘋果斑點落葉病尤為嚴重。蘋果腐爛病俗稱串皮濕、爛皮病或臭皮病，是我國北方果區(qū)危害嚴重的蘋果病害，其危害蘋果樹的枝干，枝干上病疤累累，枝干殘缺不全，甚至全株枯死[2-3]。蘋果輪紋病主要危害枝干和果實，對葉片危害較少，枝干受害，在皮孔上形成圓形或扁圓形的瘤狀物，邊緣龜裂與健康組織形成一道環(huán)溝，嚴重時生病組織翹起如馬鞍狀，許多病斑連在一起，使表皮粗糙；果實感染輪紋病很快形成同心輪紋狀，整個果實軟腐。隨著易感輪紋病蘋果品種富士在我國的大面積推廣，蘋果輪紋病在黃河故道、華北地區(qū)及四川、湖北等省份發(fā)生普遍，已成為我國當前蘋果生產上較為嚴重的病害之一，使蘋果產業(yè)遭受了巨大的經濟損失[4]。蘋果斑點落葉病是我國蘋果產區(qū)的主要病害之一，該病主要危害新生葉片，尤其是展葉20 d內的幼嫩葉片，還可危害葉柄、1 a生枝條和果實[5]。發(fā)病嚴重時，果園病葉率達90%以上，不僅造成果樹大量落葉，而且影響果實的正常膨大和著色，在發(fā)病后期，可以侵染果實，致使品質變劣，嚴重影響產量與經濟效益。

化學農藥是保障我國糧食生產的重要農業(yè)物資，然而，農藥也是一把雙刃劍，在保障人類獲得豐厚農產品的同時，也給環(huán)境和生態(tài)帶來了嚴重的污染與危害[6-7]?；诖耍陙韲姨岢隽嘶?、農藥減施的“雙減”目標，開發(fā)新型農藥迫在眉睫[8]。近年來，昆蟲病原真菌開發(fā)利用的研究越來越受到重視，并已有大量成功應用的典例，如白僵菌屬、綠僵菌屬、擬青霉屬、被毛孢屬、棒孢菌屬、穗霉屬、側孢霉屬、輪枝菌屬等[9-14]。其中，白僵菌昆蟲病原真菌在代謝類型上十分復雜，能產生多種生理功能特異的生物活性物質。這種代謝產物的多樣性，為人類開發(fā)新型生物制劑及在其他領域的利用提供了重要的途徑。為此，研究了球孢白僵菌(Beauveriabassiana)BD-B180以及其孢子懸浮液、發(fā)酵液對蘋果腐爛病菌、蘋果輪紋病菌和蘋果斑點落葉病菌的抑制作用，以期更好地防治蘋果主要病害，為開發(fā)新型生物農藥、減少化學農藥對環(huán)境的污染提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株 球孢白僵菌菌株BD-B180，由河北農業(yè)大學植物保護學院生物防治實驗室提供；蘋果樹皮腐爛病病原菌(ValsamaliMiyabe et Yamada)、蘋果輪紋病病原菌(PhysalosporapiricolaNose)、蘋果斑點落葉病病原菌(AlternariamaliRoberts)由河北農業(yè)大學植物保護學院植物病理教研室提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL。PD液體培養(yǎng)基：配方同 PDA 培養(yǎng)基，不加瓊脂。

1.2 試驗方法

1.2.1 球孢白僵菌BD-B180與蘋果病原菌的平板對峙培養(yǎng) 將保存的球孢白僵菌BD-B180菌株和供試蘋果病原菌菌株分別轉接到PDA平板上，倒置于恒溫光照培養(yǎng)箱中，在25 ℃黑暗條件下恒溫培養(yǎng)3～5 d后，用打孔器(7 mm)沿其菌落邊緣打菌碟。采用平板對峙培養(yǎng)法，將蘋果病原菌菌碟分別接種于PDA平板中央，在蘋果病原菌菌碟周圍等距離接4塊球孢白僵菌菌碟，兩者相距3.5 cm。同時以單獨接種蘋果病原菌的平板為對照(CK)，每個處理重復3次。將以上培養(yǎng)皿倒置于恒溫光照培養(yǎng)箱中，于25 ℃黑暗條件下恒溫培養(yǎng)，每24 h觀察各菌株的生長狀況，并在兩菌株接種點連線上測量病原菌接種點到菌落前緣的距離，每個處理分別從4個不同方向測量4次取平均值[15]，直至單獨培養(yǎng)的蘋果病原菌菌落長滿整個培養(yǎng)皿為止，按照下列公式計算抑制率：

T=(K1-K2)/K1×100%

其中，T為抑制率，K1為單獨培養(yǎng)蘋果病原菌菌落生長半徑平均值，K2為對峙培養(yǎng)蘋果病原菌菌落生長半徑平均值。

1.2.2 球孢白僵菌BD-B180孢子懸浮液對蘋果病原菌的抑制作用測定 刮取用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)30 d的球孢白僵菌BD-B180的分生孢子，放入加有10 mL 0.05%吐溫-80溶液的玻璃勻漿器中進行研磨，研磨至無沉淀后倒入裝有0.05%吐溫-80溶液的錐形瓶中，用血球計數(shù)的方法確定溶液的濃度，并最終將該溶液配成2.49×107cfu/mL的孢子懸浮液母液，隨后用系列稀釋法稀釋成2.49×106、2.49×105、2.49×104、2.49×103cfu/mL等不同濃度的孢子懸浮液。當PDA培養(yǎng)基溫度冷卻至40～45 ℃時，吸取9 mL培養(yǎng)基與1 mL振蕩均勻的孢子懸浮液混勻，制成含有不同濃度分生孢子的PDA平板。待平板凝固后，將25 ℃黑暗條件下恒溫培養(yǎng)3～5 d的供試蘋果病原真菌的菌碟(直徑7 mm)接種于平板中央，同時以9 mL培養(yǎng)基與1 mL無菌水混勻制成的PDA平板并接種菌碟為對照組，每個處理重復3次。將以上培養(yǎng)皿倒置于恒溫光照培養(yǎng)箱中，于25 ℃黑暗條件下恒溫培養(yǎng)，每24 h觀察各菌株的生長狀況，測量記錄菌落直徑，直至對照培養(yǎng)的蘋果病原菌菌落長滿整個培養(yǎng)皿為止，采用十字交叉法測量菌落生長直徑，按照下列公式計算抑制率：

T=(M1-M2)/M1×100%

其中，T為抑制率，M1為無菌水處理平板中蘋果病原菌菌落生長直徑平均值-7 mm，M2為孢子懸浮液處理平板中蘋果病原菌菌落生長直徑平均值-7 mm。

1.2.3 球孢白僵菌BD-B180發(fā)酵液對蘋果病原菌的抑制作用測定

1.2.3.1 球孢白僵菌BD-B180發(fā)酵液的制備 將保存的球孢白僵菌BD-B180菌株轉接到PDA平板上活化5 d后，在無菌的條件下，用打孔器(7 mm)打10個菌碟，轉接到裝有70 mL PD液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，于黑暗條件下120 r/min、25 ℃恒溫搖床上振蕩培養(yǎng)5 d。之后，以2%的接種量接入含有100 mL PD液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，于黑暗條件下120 r/min、25 ℃的搖床上分別振蕩培養(yǎng)5、10、15、20 d。然后用已滅菌的濾紙在無菌條件下進行過濾，濾去菌絲。濾液經5 000 r/min離心15 min去除沉淀[16-17]，收集上清液并倒入已滅菌的旋轉蒸發(fā)儀的收集瓶中進行旋轉蒸發(fā)，將上清液濃縮10倍。最后經孔徑為0.22 μm的細菌過濾器過濾得到球孢白僵菌BD-B180無菌發(fā)酵液，置于冰箱(4 ℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 發(fā)酵液對蘋果病原菌菌絲生長的抑制作用測定 吸取2 mL制備好的發(fā)酵液，加入18 mL的PDA培養(yǎng)基，混勻，制成發(fā)酵液平板，以加入2 mL無菌水的平板作對照。然后接種蘋果病原菌(25 ℃黑暗條件下恒溫培養(yǎng)3～5 d)菌碟于平板中央，置于恒溫光照培養(yǎng)箱中，于25 ℃黑暗條件下恒溫培養(yǎng)，每隔24 h觀察各菌株的生長狀況，測量記錄菌落直徑，直至對照培養(yǎng)的蘋果病原菌菌落長滿整個培養(yǎng)皿為止，采用十字交叉法測量菌落生長直徑，按照下列公式計算抑制率：

T=(C1-C2)/C1×100%

其中，T為抑制率，C1為無菌水處理平板中蘋果病原菌菌落生長直徑平均值，C2為發(fā)酵液處理平板中蘋果病原菌菌落生長直徑平均值[18]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)經DPS軟件統(tǒng)計處理，用Duncan氏新復極差法進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 球孢白僵菌BD-B180對蘋果病原菌的拮抗作用

球孢白僵菌BD-B180對蘋果斑點落葉病菌、蘋果腐爛病菌和蘋果輪紋病菌均有一定的拮抗作用，其中，對蘋果斑點落葉病菌的抑制效果最好，最高抑制率為45.08%，其對蘋果輪紋病菌和蘋果腐爛病菌的最高抑制率分別為41.35%和39.74%(表1—3)。當球孢白僵菌BD-B180與蘋果斑點落葉病菌對峙培養(yǎng)11 d、與蘋果腐爛病菌對峙培養(yǎng)6 d和與蘋果輪紋病菌對峙培養(yǎng)4 d時，能夠觀察到球孢白僵菌BD-B180對這3種蘋果病原菌菌絲生長有明顯的抑制作用(圖1)，且在球孢白僵菌BD-B180菌株與蘋果病原菌菌株沿接種點連線方向的菌絲生長極其緩慢，甚至停止生長。當蘋果斑點落葉病菌對峙培養(yǎng)29 d、蘋果腐爛病菌對峙培養(yǎng)25 d時，球孢白僵菌BD-B180與這2種病原菌菌株對峙培養(yǎng)處形成明顯隔離帶，而蘋果輪紋病菌對峙培養(yǎng)到29 d時仍不明顯(圖1)。

表1 球孢白僵菌BD-B180平板對峙培養(yǎng)對蘋果斑點落葉病菌生長的抑制作用

注：同列不同大、小寫字母表示經Duncan氏新復極差法測驗分別在0.01、0.05水平上差異顯著，下同。

表2 球孢白僵菌BD-B180平板對峙培養(yǎng)對蘋果腐爛病菌生長的抑制作用

表3 球孢白僵菌BD-B180平板對峙培養(yǎng)對蘋果輪紋病菌生長的抑制作用

1.球孢白僵菌BD-B180與蘋果斑點落葉病菌對峙培養(yǎng)11 d；2.球孢白僵菌BD-B180與蘋果腐爛病菌對峙培養(yǎng)6 d；3.球孢白僵菌BD-B180與蘋果輪紋病菌對峙培養(yǎng)4 d；4.球孢白僵菌BD-B180與蘋果斑點落葉病菌對峙培養(yǎng)29 d(反面)；5.球孢白僵菌BD-B180與蘋果腐爛病菌對峙培養(yǎng)25 d(反面)；6.球孢白僵菌BD-B180與蘋果輪紋病菌對峙培養(yǎng)29 d(反面)圖1 球孢白僵菌BD-B180與蘋果病原菌的對峙培養(yǎng)結果

2.2 球孢白僵菌BD-B180孢子懸浮液對蘋果病原菌的抑制作用

從表4可以看出，球孢白僵菌BD-B180孢子懸浮液對3種蘋果病原菌均有不同程度的抑制作用。隨著孢子懸浮液濃度的增加，對3種蘋果病原菌的抑制程度也相應增強。濃度為2.49×107cfu/mL的孢子懸浮液對蘋果輪紋病菌的抑制效果最佳，最高抑制率達90.81%，其對蘋果斑點落葉病菌和蘋果腐爛病菌的最高抑制率分別為77.14%和52.78%，并且在培養(yǎng)3 d時對3種蘋果病原菌的抑制率均大于50%。觀察發(fā)現(xiàn)，在濃度為2.49×107cfu/mL的孢子懸浮液制成的平板上，3種蘋果病原菌菌落均被白僵菌包圍，且菌落表現(xiàn)出與對照菌落不同的生長狀況，蘋果腐爛病菌菌落呈微黃色，蘋果輪紋病菌菌落和蘋果斑點落葉病菌菌落呈黑色，并且在平板上均產生不同大小的抑菌圈(圖2)。這可能是病原菌與白僵菌對峙過程中雙方的分泌物接觸后所表現(xiàn)出的結果，與平板對峙培養(yǎng)時所表現(xiàn)出的對峙狀態(tài)一致，是兩者對空間和營養(yǎng)競爭的結果。

表4 球孢白僵菌BD-B180孢子懸浮液對3種蘋果病原菌菌絲生長的抑制作用

1.孢子懸浮液濃度為2.49×107cfu/mL平板上的蘋果腐爛病菌(反面)；2.孢子懸浮液濃度為2.49×107cfu/mL平板上的蘋果斑點落葉病菌(反面)；3.孢子懸浮液濃度為2.49×107cfu/mL平板上的蘋果輪紋病菌(反面)圖2 球孢白僵菌BD-B180孢子懸浮液對蘋果病原菌的抑制效果

2.3 球孢白僵菌BD-B180發(fā)酵液對蘋果病原菌生長的影響

2.3.1 發(fā)酵液對蘋果病原菌菌絲生長的抑制作用 從表5—7可以看出，球孢白僵菌BD-B180發(fā)酵液對蘋果腐爛病菌、蘋果輪紋病菌和蘋果斑點落葉病菌均有不同程度的抑制作用，且隨著振蕩培養(yǎng)時間的增加，對3種蘋果病原菌的抑制效果也明顯增加。振蕩培養(yǎng)20 d的球孢白僵菌BD-B180發(fā)酵液抑菌效果最好，其對蘋果腐爛病菌的抑菌效果最明顯，最高抑制率達68.33%，對蘋果斑點落葉病菌和蘋果輪紋病菌的最高抑制率分別為66.42%和59.76%。振蕩培養(yǎng)5 d的球孢白僵菌BD-B180發(fā)酵液抑菌效果最差，對蘋果斑點落葉病菌的最高抑制率僅為11.28%，對蘋果輪紋病菌的最高抑制率為12.16%，對蘋果腐爛病菌的抑菌效果較好，最高抑制率為40.00%。

2.3.2 發(fā)酵液對蘋果病原菌菌落的影響 由圖3可以看出，在培養(yǎng)相同時間的情況下，加入振蕩培養(yǎng)20 d的球孢白僵菌BD-B180發(fā)酵液平板上的3種蘋果病原菌菌落與對照平板上的菌落有明顯的差異。蘋果斑點落葉病菌對照菌落生長均勻且黑白相間，而加入發(fā)酵液平板上的菌落則較大面積為深綠色且生長不均勻；蘋果輪紋病菌對照菌落生長均勻，而加入發(fā)酵液平板上的菌落則生長極其不規(guī)則，菌絲顏色也相對較深；蘋果腐爛病菌對照菌落生長均勻，而加入發(fā)酵液平板上的菌落生長相對不均勻，甚至菌碟表面也長滿病原菌菌絲。表明振蕩培養(yǎng)20 d的球孢白僵菌BD-B180發(fā)酵液對3種蘋果病原菌菌落均產生了明顯的抑制作用，使得這3種蘋果病原菌菌絲顏色、生長方式等都發(fā)生了明顯變化。

表5 球孢白僵菌BD-B180發(fā)酵液對蘋果斑點落葉病菌菌絲生長的抑制作用

表6 球孢白僵菌BD-B180發(fā)酵液對蘋果輪紋病菌菌絲生長的抑制作用

表7 球孢白僵菌BD-B180發(fā)酵液對蘋果腐爛病菌菌絲生長的抑制作用

1—2.蘋果斑點落葉病菌(1為對照，2為加入振蕩培養(yǎng)20 d的球孢白僵菌BD-B180發(fā)酵液)；3—4.蘋果輪紋病菌(3為對照，4為加入振蕩培養(yǎng)20 d的球孢白僵菌BD-B180發(fā)酵液)；5—6.蘋果腐爛病菌(5為對照，6為加入振蕩培養(yǎng)20 d的球孢白僵菌BD-B180發(fā)酵液)

3 結論與討論

蟲生真菌種類繁多、分布廣泛，是一種寶貴的生防資源，國外已經有大量成功應用的典例，但主要集中在害蟲生防方面[9]。從20世紀90年代開始國外有關于利用金龜子綠僵菌和球孢白僵菌防治甜菜黑脛病的研究報道，但國內有關蟲生真菌對植物病原真菌生防作用的報道較少，且主要針對蔬菜和大田作物，如：張勝利等[15]報道，球孢白僵菌對棉花枯萎病菌和棉花紅腐病菌的抑制作用明顯；齊永霞等[17]報道，金龜子綠僵菌3個不同菌株對小麥紋枯病菌均有較好的抑制作用；何超[19]研究表明，布氏白僵菌Bbr12、Bbr14和Bbr17對水稻稻瘟病菌、油菜菌核病菌、小麥紋枯病菌和玉米小斑病菌具有一定的拮抗作用。然而關于防治果樹病害的研究未見報道。

由于綠僵菌和白僵菌具有真菌殺菌劑的諸多優(yōu)點，目前被普遍認為是最有開發(fā)潛力的微生物殺菌劑，已經受到了植物病理學家的青睞。本研究測定已有的白僵菌菌株對3種蘋果病原真菌的室內抑制作用，以期篩選出對果樹病原真菌具有生防價值的蟲生真菌菌株，為蟲生真菌應用于果樹病害生防以及真菌殺菌劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。對峙培養(yǎng)試驗結果表明，球孢白僵菌BD-B180對3種蘋果病原真菌均表現(xiàn)出較好的抑制作用。其中，對蘋果斑點落葉病菌的抑制率最高，其次是蘋果輪紋病菌和蘋果腐爛病菌，最高抑制率分別為45.08%、41.35%和39.74%。生防菌對植物病原菌直接的作用機制主要表現(xiàn)為重寄生和拮抗作用2類，而拮抗作用包括占領、抗生作用、競爭作用等方式[15]。在加入球孢白僵菌BD-B180孢子懸浮液的PDA培養(yǎng)基上接種蘋果病原真菌，3種真菌菌絲生長均受到不同程度的抑制，抑制程度隨孢子濃度增加而增強，當孢子懸浮液濃度為2.49×107cfu/mL時，對蘋果輪紋病菌、蘋果斑點落葉病菌和蘋果腐爛病菌的最高抑制率分別為90.81%、77.14%和52.78%，并且白僵菌生長均對病原菌菌落形成了包圍，有的造成病原菌停止生長，說明白僵菌在生長過程中與病原真菌競爭營養(yǎng)和空間，同時還產生了抗生作用，這與夏龍蓀等[18]的研究結果相同。發(fā)酵液的抑菌效果隨著球孢白僵菌發(fā)酵時間的增加而增強，振蕩培養(yǎng)20 d的發(fā)酵液對蘋果輪紋病菌、蘋果斑點落葉病菌和蘋果腐爛病菌的最高抑制率分別為59.76%、66.42%和68.33%。經過發(fā)酵后的白僵菌對蘋果病原真菌的抑制作用明顯增強，說明發(fā)酵增加了有效抑菌成分的濃度。有文獻報道，一些食用菌發(fā)酵液的有效抑菌成分主要為一些小分子質量的蛋白質、多肽、多糖、酚和有機酸類等物質[15]。至于球孢白僵菌BD-B180發(fā)酵液的有效抑菌成分以及抑菌機制等問題，還有待進一步的深入研究。此外，還可以考慮將蟲生真菌與一些高效、低毒的農藥混用，以提高蟲生真菌對植物病害的防治效果。

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