交通任督法干預(yù)對血管性癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶功能及海馬AchE活性的影響

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血管性癡呆(vascular dementia，VD)是指由缺血性卒中、出血性卒中和造成記憶、認(rèn)知和行為等腦區(qū)低灌注腦血管疾病所致的嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙綜合征，以記憶、認(rèn)知、言語、情感、性格等方面的能力減退和消失為主要表現(xiàn)，是老年人群的常見病、多發(fā)病，僅次于阿爾茨海默病[1]。西醫(yī)通常以改善腦細(xì)胞代謝、改善腦血液循環(huán)等對癥治療為主，目前無特效的治療方法及藥物[2]。交通任督法具有培元固本、通經(jīng)活絡(luò)、醒腦開竅的作用，臨床證實(shí)對VD病人效果明顯?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)臨床、基礎(chǔ)研究結(jié)果證實(shí)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)膽堿能系統(tǒng)功能損害與VD病人認(rèn)知功能障礙密切相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)觀察交通任督法對VD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能及海馬乙酰膽堿酯酶(AchE)活性的影響，探討其治療機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 成年SD雄性大鼠40只，體重400 g±10 g[動(dòng)物由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證號：SCXK(京)2014-0004]，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物篩選剔除后隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、交通任督法針刺組、西藥對照組，每組10只。

1.2 儀器 Morris水迷宮(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所DMS-2，山西省中醫(yī)藥研究院中心實(shí)驗(yàn)室提供)；YL-3型石蠟切片機(jī)(上海儀表廠)；4號手術(shù)絲線[強(qiáng)生(中國)醫(yī)療器械有限公司]，眼科用手術(shù)剪(上海醫(yī)療器械廠)，眼科用手術(shù)鑷(上海醫(yī)療器械廠)。

1.3 藥品及試劑 水合氯醛(國藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司)，尼莫同(由德國拜耳公司提供)，硝普鈉(北京雙鶴藥業(yè)股份有限責(zé)任公司)，注射用青霉素鈉(華北制藥有限公司)，生理鹽水、乙酰膽堿酯酶測定試劑盒(南京建成生物工程研究所生產(chǎn))。

1.4 針具 “漢醫(yī)牌”一次性針灸針(0.25 mm×25 mm)：北京漢醫(yī)醫(yī)療器械中心。

1.5 造模方法 大鼠進(jìn)行常規(guī)喂養(yǎng)適應(yīng)5 d后，進(jìn)行Morris水迷宮預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選，統(tǒng)計(jì)所有大鼠潛伏期均值，剔除太快及太慢的，將剩余大鼠根據(jù)潛伏期分為3組：0～20 s、20 s～40 s、40 s～60 s，從每組隨機(jī)選出3只或4只大鼠，共10只作為假手術(shù)組(空白組，手術(shù)期間可能存在大鼠死亡)，余為造模組。

采用兩血管阻斷加硝普鈉降壓法復(fù)制VD模型[3-5]：將大鼠用10%的水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，仰臥位固定在手術(shù)臺上，常規(guī)消毒，頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動(dòng)脈；腹腔注射硝普鈉(3.5 mg/kg體重)后，隨即用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，夾閉10 min再通10 min，反復(fù)3次，再通后在手術(shù)處撒適量青霉素粉末，縫合傷口，放回籠中保溫飼養(yǎng)。假手術(shù)組麻醉及手術(shù)過程同上，但不阻斷頸總動(dòng)脈及注射硝普鈉。

1.6 治療方法 術(shù)后第7天切口愈合，存活大鼠再次進(jìn)行Morris水迷宮測試(除假手術(shù)組)，存在顯著學(xué)習(xí)記憶障礙的大鼠為VD大鼠模型(以第1次水迷宮檢測的大鼠逃避潛伏期均值作為參考值，計(jì)算造模后大鼠逃避潛伏期均值和參考值之差與參考值的比值，大于20%為癡呆大鼠)。將第2次水迷宮實(shí)驗(yàn)選出的造模組大鼠隨機(jī)分為交通任督法針刺組、西藥對照組、模型組，每組10只。假手術(shù)組及模型組未予任何治療。

1.6.1 交通任督法針刺組 針刺模型大鼠“風(fēng)府”“百會”“人中”“關(guān)元”穴(取穴參照林文注等編著的《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[6])，深度約0.5寸，平補(bǔ)平瀉，留針30 min，每日1次，連續(xù)15 d。

1.6.2 西藥對照組 模型大鼠給予尼莫同12 mg/kg(尼莫同每片30 mg，10片，先用少量溫水制成混懸液，再加蒸餾水至500 mL，即為0.6 mg/mL的尼莫同混懸液)，按20 mL/kg體重灌胃，每日1次，連續(xù)15 d。

1.7 檢測方法

1.7.1 行為學(xué)觀測 Morris水迷宮定位航行試驗(yàn)：治療結(jié)束后，進(jìn)行水迷宮測試。水迷宮為高50 cm、直徑150 cm的圓形水池，水深30 cm，水溫保持在(20±2)℃。將水池等分為4個(gè)象限，任選一象限作為第一象限，并在其正中離池壁30 cm處放一直徑為9 cm的圓形平臺，平臺頂?shù)陀谒? cm。自動(dòng)攝像系統(tǒng)同步記錄大鼠運(yùn)動(dòng)軌跡，整個(gè)訓(xùn)練期間迷宮外參照物保持不變，避免時(shí)間、光線等外界條件的干擾。將大鼠置于平臺10 s，再將其從平臺對側(cè)象限面對池壁入水，開始自由游動(dòng)，記錄1 min內(nèi)尋找平臺時(shí)間(逃避潛伏期)。若大鼠在1 min內(nèi)找到平臺，記錄其實(shí)際逃避潛伏期及游泳路程；若大鼠在1 min內(nèi)未找到平臺，由測試者將其引上平臺并停留10 s，逃避潛伏期記錄為1 min，觀察3 d，每日2次。以3 d找到平臺的平均逃避潛伏期和平均游泳路程評價(jià)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力[7]。

1.7.2 海馬AchE測定 大鼠斷頭后快速取出全腦，置于冰盒上，分離海馬并稱重。按照重量和體積1︰10的比例，加入生理鹽水冰浴勻漿，4 ℃離心(3 000 r/min，10 min)，取上清液，酶聯(lián)免疫吸附法測定，操作遵照試劑盒說明進(jìn)行。

2 結(jié) 果

2.1 對VD大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響 大鼠逃避潛伏期和游泳路程比較，假手術(shù)組、交通任督法針刺組和西藥對照組均短于模型組(P<0.01)。詳見表1。

組別n逃避潛伏期(s)游泳路程(cm)假手術(shù)組 1010.55±2.131)112.27±20.631) 模型組 1057.07±6.40 938.66±246.83 交通任督法針刺組1019.64±8.651)228.39±106.471)西藥對照組 1018.93±9.031)227.39±105.891) 與模型組比較,1)P<0.01。

2.2 各組大鼠海馬組織AchE活性表達(dá) 大鼠海馬AchE含量比較，假手術(shù)組、交通任督法針刺組、西藥對照組均高于模型組(P<0.01)。詳見表2。

組別 nAchE假手術(shù)組 10500.51±35.651)模型組 10420.05±15.22 交通任督法針刺組10466.87±22.551)西藥對照組 10471.77±18.631) 與模型組比較,1)P<0.01。

3 討 論

交通任督法是指取任督二脈之經(jīng)穴為主 ，施以相應(yīng)的針刺手法，以達(dá)到調(diào)整人身陰陽、通暢經(jīng)絡(luò)氣血、祛除疾病目的。郭耀康老師從事針灸臨床工作40余年，認(rèn)為人體疾病發(fā)生的根本為陰陽失調(diào)，如《素問· 陰陽應(yīng)象大論》曰：“ 陰陽者，天地之道也，萬物之綱紀(jì)，變化之父母，生殺之本始，神明之府也” 。而任督二脈為人身陰陽的總匯，兩者一源而二歧，督則由會陰而行背，任則由會陰而行腹，最后交接于口周。督脈總督一身之陽，任脈總督一身之陰，任督二脈共同構(gòu)成一個(gè)陰陽循環(huán)的體系，故任督二脈經(jīng)氣循環(huán)通暢，對于五臟六腑、十二經(jīng)脈起重要的影響和治療作用[8]。

VD屬于中醫(yī)“癡呆”的范疇，較早有認(rèn)識，《靈樞·海論》曰：“髓海不足，腦轉(zhuǎn)耳鳴，脛酸眩冒，目無所見，懈怠安臥”。《靈樞·調(diào)經(jīng)論》曰：“血并于上，氣并于下，亂而喜忘”；《臨證指南醫(yī)案》指出：“中風(fēng)初起，神呆遺尿。老人厥中顯然”；《雜病源流犀燭·中風(fēng)》更進(jìn)一步指出：“有中風(fēng)后善忘”。其病位在腦，病機(jī)為髓海不足，氣、火、痰、瘀內(nèi)阻于腦。癡呆的發(fā)生與任督二脈密切相關(guān)，從循行分布上看，《難經(jīng)·二十八難》記載：“督脈者……起于下極之腧，并于脊里，上至風(fēng)府，入屬于腦”“任脈者，起于中極之下，以上至毛際，循腹里……入目絡(luò)舌”；又如《素問：骨空論》記載督脈的分支“上額交巔上，入絡(luò)腦”“督脈、任脈和諸陽皆起于頭”。從功能角度上看，腦位于顱內(nèi)，為髓之海，其功能的發(fā)揮依賴任脈的氣血津液濡養(yǎng)；督脈則通髓達(dá)腦。因此，任、督脈對治療腦部疾病有重要意義，運(yùn)用任督二脈的腧穴，可有效調(diào)整人體陰陽平衡[9]。郭耀康老師治療癡呆常選用任督二脈之關(guān)元、中脘、承漿、人中、百會、風(fēng)府。交通任督法的取穴：關(guān)元是人體的強(qiáng)壯要穴，可鼓舞人體正氣；中脘穴為任脈上六腑經(jīng)氣交會之處，可振奮脾胃功能，使人體氣血調(diào)和，經(jīng)脈通暢；承漿穴是任督二脈交會之處，又是足陽明經(jīng)左右交叉之地，可用于“卒中惡死”“偏風(fēng)半身不遂，口眼歪斜，暴暗不能言”等；人中穴為督脈、手足陽明之會穴，可調(diào)節(jié)腦內(nèi)氣血的偏盛偏衰；百會是督脈要穴，針刺可疏通督脈經(jīng)氣；風(fēng)府穴為督脈入屬于腦之處，故腦部疾病常用。以上各穴合用，共奏調(diào)理陰陽、疏通經(jīng)絡(luò)之效[10]。

隨著社會人口老齡化及腦血管病發(fā)病率不斷上升，致使當(dāng)前VD的發(fā)病率、致死率逐年增加[11]。 尤其在世界多數(shù)發(fā)展中國家，VD已成為繼阿爾茨海默病后導(dǎo)致老年性癡呆的第二大原因[12]。由于VD病人除神經(jīng)系統(tǒng)定位損害的癥狀和體征，其還存在不同程度的記憶、計(jì)算、思維、定向和判斷等能力障礙，同時(shí)病人的生活質(zhì)量有不同程度下降，給病人及家庭帶來沉重的心理負(fù)擔(dān)，同時(shí)也加重社會負(fù)擔(dān)，而VD作為目前唯一一種可預(yù)防的癡呆類型，若病人及早發(fā)現(xiàn)、早期診斷明確、及時(shí)干預(yù)治療，VD是可以防治的，是可逆的[5]。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為海馬組織是學(xué)習(xí)記憶的高級活動(dòng)中樞，其膽堿能神經(jīng)元膽堿(Ach)的含量與記憶功能密切相關(guān)，Ach在膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(ChAT)催化下合成，釋放后被AchE迅速水解，ChAT與AchE共同維持Ach的動(dòng)態(tài)平衡，因此通過測量AchE含量可了解Ach的代謝狀況[11-12]。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：VD模型組大鼠AchE含量較假手術(shù)組降低，學(xué)習(xí)記憶能力下降；而針刺組、西藥組大鼠AchE含量較VD模型組大鼠升高，學(xué)習(xí)記憶能力增強(qiáng)。證實(shí)交通任督針法可提高VD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，提高VD大鼠海馬組織AchE的含量，其作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)AchE的代謝有關(guān)。

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