頭痛寧膠囊對偏頭痛大鼠血清多巴胺、多巴胺-β-羥化酶、去甲腎上腺素水平的影響

，

偏頭痛的發(fā)病機制尚不明確，可能由于其多重混合的癥候學特征(頭痛及神經病學、精神病學和交感神經系統(tǒng)癥狀)很難以一種或多種相關的病理生理學過程解釋，基因突變、基因多態(tài)性、線粒體功能失調、神經遞質代謝及中樞神經系統(tǒng)離子通道是導致偏頭痛發(fā)生的主要生物因素，多因子的生物行為功能失調導致大腦額葉過度興奮，誘發(fā)疼痛通路的反常激活，導致偏頭痛發(fā)生[1]。既往研究發(fā)現(xiàn)，神經遞質的代謝異常在偏頭痛發(fā)病過程中起重要作用，本研究觀察頭痛寧膠囊對偏頭痛大鼠血清多巴胺(DA)、多巴胺-β-羥化酶(Dβ-H)、去甲腎上腺素(NE)水平的影響，探討頭痛寧膠囊治療偏頭痛的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 健康雄性清潔級Wistar大鼠36只，體重250 g～300 g，均由山西醫(yī)科大學動物實驗中心提供，安靜屏蔽環(huán)境下喂養(yǎng)，室溫控制在22 ℃。硝酸甘油注射液，每支5 mg，由北京益民藥業(yè)有限公司生產；頭痛寧膠囊，每粒0.4 g，由陜西步長制藥有限公司生產。使用蒸餾水配制低劑量頭痛寧膠囊懸液(380 mg/kg)和高劑量頭痛寧膠囊懸液(760 mg/kg)。測定DA、Dβ-H、NE的ELISA試劑盒均購自武漢博士德生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 造模與分組 將36只健康雄性Wistar大鼠普通喂養(yǎng)1周后，采用隨機分組法分為將36只健康雄性Wistar大鼠普通喂養(yǎng)1周，隨機分為空白對照組(6只)和偏頭痛模型組(30只)?？瞻讓φ战M給予生理鹽水皮下注射。偏頭痛模型組根據(jù)Tassorelli等[2]研究的方法皮下注射硝酸甘油(NTG)制備大鼠偏頭痛模型，并隨機分為模型對照組，預防高劑量組、預防低劑量組，治療高劑量組、治療低劑量組，每組6只?？瞻讓φ战M給予蒸餾水2 mL/(kg·d)灌胃7 d，第7天灌胃30 min后給予10 mL/kg生理鹽水皮下注射；模型對照組給予蒸餾水2 mL/(kg·d)灌胃7 d，第7天灌胃30 min后再次給予10 mL/kg硝酸甘油皮下注射；治療高劑量組、低劑量組給予蒸餾水2 mL/(kg·d)灌胃7 d，第7天灌胃30 min后再次給予10 mL/kg硝酸甘油皮下注射，造模30 min后分別給予頭痛寧膠囊760 mg/kg和380 mg/kg灌胃；預防高劑量組、低劑量組分別給予頭痛寧膠囊760 mg/kg和380 mg/kg灌胃7 d，第7天灌胃30 min后再次給予10 mL/kg硝酸甘油皮下注射。分別觀察大鼠的癥狀行為學表現(xiàn)。

1.2.2 標本采集 各組末次給藥后，通過大鼠連續(xù)斷尾采血法[3]分別于30 min、60 min和180 min使用血清分離促凝管收集標本，以3 000 r/min離心30 min，收集血清待檢。

1.2.3 DA、Dβ-H、NE水平測定 準備6只小試管，將標準品分別稀釋(DA：600 pg/mL，300 pg/mL，150 pg/mL，75 pg/mL，37.5 pg/mL，0 pg/mL；Dβ-H：160 ng/mL，80 ng/mL，40 ng/mL，20 ng/mL，10 ng/mL，0 ng/mL；NE：800 pg/mL，400 pg/mL，200 pg/mL，100 pg/mL，50 pg/mL，0 pg/mL)；在酶標包被板上分別設標準品孔、空白孔、待測樣品孔，依次加入標準品50 μL、蒸餾水50 μL、樣品40 μL+生物素標記的抗DA(Dβ-H/NE)抗體10 μL，采用封板膜封板后置37 ℃溫育箱30 min；濃縮洗滌液用蒸餾水稀釋20倍，之后揭掉封板膜，棄液，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，重復5次，拍干，除空白孔外，每孔加入酶標試劑50 μL，再次溫育，洗滌，之后每孔加入顯色劑A、B各50 μL，37 ℃避光顯色15 min，之后每孔加終止液50 μL，終止反應。以空白孔凋零，450 nm波長依序測量各孔吸光度(OD值)，以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線，計算樣品濃度。

2 結 果

2.1 行為學觀察 通過觀察各組大鼠末次給藥后不同時間的行為癥狀學(撓頭、咬趾/尾、往返動作、爬籠等)發(fā)現(xiàn)，空白對照組末次給藥30 min內出現(xiàn)爬籠、咬趾/尾動作多于其他組，可能為藥物激惹所致；預防高劑量組、低劑量組偏頭痛相關行為較模型對照組明顯減少；治療高劑量組與模型對照組比較，偏頭痛相關行為減少，治療低劑量組與模型對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2 各組大鼠不同時間DA、Dβ-H、NE水平比較 經過單因素方差分析，6組間DA、Dβ-H、NE含量變化有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。各組進行多重比較，顯示預防高劑量組60 min及180 min血清Dβ-H含量與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；預防高劑量組60 min血清NE含量與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。其余各組兩兩比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表1～表3。

組別n 30 min 60 min 180 min空白對照組6127.98±1.45121.57±3.82132.00±2.03模型對照組6239.00±1.801)227.83±1.871)232.95±1.881)治療高劑量組6197.49±3.571)2)182.92±3.711)2)207.96±5.701)2)治療低劑量組6223.59±7.741)2)3)222.47±3.731)2)3)225.58±3.821)2)3)預防高劑量組6147.94±1.781)2)3)4)143.49±1.421)2)3)4)155.51±2.911)2)3)4)預防低劑量組6166.49±3.871)2)3)4)5)163.99±1.971)2)3)4)5)180.38±3.701)2)3)4)5) 與空白對照組比較,1)P<0.05;與模型對照組比較,2)P<0.05;與治療高劑量組比較,3)P<0.05;與治療低劑量組比較,4)P<0.05;與預防高劑量組比較,5)P<0.05。

組別n 30 min 60 min 180 min空白對照組662.26±3.2663.53±4.4061.43±3.89模型對照組631.74±1.941)36.51±1.521)32.62±1.241)治療高劑量組645.02±1.951)2)49.09±1.751)2)48.07±1.891)2)治療低劑量組639.53±1.551)2)3)46.02±1.971)2)3)40.50±1.401)2)3)預防高劑量組656.53±1.491)2)3)4)63.03±3.492)3)4)60.04±1.152)3)4)預防低劑量組651.87±2.171)2)3)4)5)56.53±1.281)2)3)4)5)54.03±1.661)2)3)4)5) 與空白對照組比較,1)P<0.05;與模型對照組比較,2)P<0.05;與治療高劑量組比較,3)P<0.05;與治療低劑量組比較,4)P<0.05;與預防高劑量組比較,5)P<0.05。

組別n 30 min 60 min 180 min空白對照組6324.92±9.42325.40±9.27325.77±9.68模型對照組6180.51±3.731)201.07±1.831)191.50±1.271)治療高劑量組6238.15±2.031)2)259.58±2.691)2)249.48±2.721)2)治療低劑量組6206.48±2.661)2)3)230.03±2.121)2)3)213.75±3.941)2)3)預防高劑量組6306.82±4.651)2)3)4)325.48±11.842)3)4)308.55±8.621)2)3)4)預防低劑量組6277.03±7.911)2)3)4)5)290.03±10.051)2)3)4)5)290.76±6.151)2)3)4)5) 與空白對照組比較,1)P<0.05;與模型對照組比較,2)P<0.05;與治療高劑量組比較,3)P<0.05;與治療低劑量組比較,4)P<0.05;與預防高劑量組比較,5)P<0.05。

2.3 DA、Dβ-H、NE水平相關性分析 DA與NE存在負相關關系，DA與Dβ-H存在負相關關系，NE與Dβ-H存在正相關關系。詳見表4。

表4 DA、Dβ-H、NE水平相關性分析(r值)

因素DANENE -0.7981)1.000Dβ-H-0.7621) 0.9391) 注:1)P<0.01。

3 討 論

Dβ-H是催化DA合成NE的主要限速酶，位于腎上腺素和NE神經元和神經內分泌細胞的細胞膜內側，腎上腺髓質的嗜鉻顆粒，儲存于交感神經末梢囊泡內，Dβ-H在血管上分布豐富，包括較多交感神經分布的大腦血管，偏頭痛病人血清Dβ-H水平降低，可能與Dβ-H中基因的多態(tài)性及等位基因分布不同相關[4-5]；Gallai等[5]通過比較無先兆偏頭痛病人、緊張性頭痛病人和健康志愿者血清Dβ-H含量，發(fā)現(xiàn)無先兆偏頭痛病人、緊張性頭痛病人血清Dβ-H含量明顯低于健康志愿者，低劑量Dβ-H導致交感神經功能失調從而誘發(fā)偏頭痛。有研究通過對受偏頭痛影響的家庭獨立樣本進行傳遞失衡檢驗分析顯示同一Dβ-H標志物的等位基因傳遞發(fā)生畸變，而對與家庭無關聯(lián)的偏頭痛病例和健康對照者Dβ-H等位基因的分布特征進行檢測，結果顯示表達二核苷酸多態(tài)性的特定等位基因頻率在兩者中存在差異，表明Dβ-H等位基因畸變可能增加偏頭痛病人易感性[6]。Ghosh等[7]為研究在印度北部人群中多巴胺能基因的DNA片段長度、DNA重復序列及單核苷酸多態(tài)性是否與偏頭痛的發(fā)生發(fā)展以及遺傳相關聯(lián)，納入301例偏頭痛病人(其中202例無先兆偏頭痛和99例有先兆偏頭痛病人)和202名健康對照者，將Dβ-H部分基因進行克隆，并使其變性，造成DNA點突變、插入或去除，觀察發(fā)現(xiàn)Dβ-H 19 bp插入缺失多態(tài)性與偏頭痛發(fā)生顯著相關，尤其在女性，DRD2 Ncol基因表達改變未發(fā)現(xiàn)與偏頭痛易感性相關。有研究通過對275例高加索人偏頭痛病人和275名健康對照組檢測分析兩種不同Dβ-H基因多態(tài)性(一種為功能性的增加/缺失啟動子，另一種為編碼區(qū)單個堿基的替換或調換)，發(fā)現(xiàn)單個堿基改變與偏頭痛無顯著相關性，而編碼Dβ-H基因增加/缺失變異體可增加偏頭痛發(fā)生率，特別在視覺、言語、感覺、運動等先兆偏頭痛病人中常見；這種變異型在性別層面分析顯示，存在純合子缺失基因型男性發(fā)生偏頭痛的風險是女性的3倍[8]。

DA是一種兒茶酚胺類神經遞質，在大腦內主要分布于中腦邊緣、中腦皮質、黑質紋狀體和結節(jié)漏斗部，受脊髓灰質后角、下丘腦中部及丘腦中繼核調節(jié)，在丘腦中可通過與D1和D2受體結合促進丘腦神經元細胞膜的去極化和增加丘腦腹后外側核/丘腦腹后內側核感覺神經元的放電，促進先兆偏頭痛的發(fā)生[9]。DA有5種受體，其中DRD1和DRD5通過激活腺苷酸環(huán)化酶發(fā)揮作用；DRD2、DRD3和DRD4抑制腺苷酸環(huán)化酶；DRD3和DRD4多態(tài)性可能與偏頭痛無相關性[4，10]。有研究顯示，先兆偏頭痛病人編碼D2DR的Ncol基因多態(tài)性高于無先兆偏頭痛及健康者，提示Ncol基因突變可能是誘發(fā)偏頭痛發(fā)生的一個病理生理機制[11]。有較多研究未發(fā)現(xiàn)DRD2的Ncol基因多態(tài)性與偏頭痛相關[12-13]。

NE是一種單胺類神經遞質，在周圍神經系統(tǒng)主要由交感神經儲存和釋放，自主神經功能障礙可誘導偏頭痛發(fā)作，偏頭痛發(fā)作時交感神經儲存的NE相對消耗及其他交感神經的共轉運體如DA、三磷酸腺苷和腺苷釋放增加[14]，中樞神經系統(tǒng)主要由幾個小的腦干神經核合成和釋放，在前額葉皮層和海馬區(qū)域具有重要的調節(jié)作用[15]，NE降低可擴張血管，增加血流量，且可通過降低中樞神經系統(tǒng)的痛閾，誘發(fā)偏頭痛[16]。NE對偏頭痛的影響存在爭議，有研究認為NE含量增加有助于疼痛性信號由腦膜傳入硬腦膜和硬腦膜的成纖維細胞，可能是由于NE激活硬腦膜成纖維細胞上的腎上腺素能受體，增加細胞外信號調節(jié)激酶的磷酸化和白介素-6釋放，使偏頭痛進入頭痛期[17]。

近期研究表明，酪氨酸代謝在偏頭痛的發(fā)病機制中起到重要作用，酪氨酸有兩條不同的代謝途徑，第一條途徑通過酪氨酸羥化酶、多巴胺脫羧酶及Dβ-H產生3，4-二羥基苯丙氨酸(DOPA)、DA、NE和腎上腺素(E)，其中Dβ-H通過催化分解DA產生NE；第二條途徑為酪氨酸脫羧酶合成酪胺、章魚胺和脫氧腎上腺素，章魚胺和脫氧腎上腺素的合成需要Dβ-H和苯乙醇胺-N-甲基轉移酶(PNMT)的激活[1]。本實驗主要研究酪氨酸代謝的第一條途徑，有研究認為可能由于偏頭痛病人Dβ-H基因或Dβ-H受體基因的多態(tài)性改變降低Dβ-H的活性，從而增加DA水平，降低NE水平[18]。

本研究通過觀察各組大鼠行為學癥狀改變，發(fā)現(xiàn)預防高劑量組、低劑量組偏頭痛相關行為較模型對照組明顯減少，治療高劑量組與模型對照組相比偏頭痛相關行為減少，治療低劑量組與模型對照組比較偏頭痛相關行為改變差異不明顯，提示頭痛寧膠囊的預防作用大于治療作用。通過對各組大鼠血清DA、Dβ-H、NE含量進行測定、分析，發(fā)現(xiàn)與模型對照組比較，頭痛寧膠囊預防劑量組和治療劑量組DA含量降低，Dβ-H和NE含量升高，60 min及180 min時預防高劑量組Dβ-H含量與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；60 min時預防高劑量組NE含量與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示預防高劑量頭痛寧膠囊對偏頭痛大鼠血清Dβ-H、NE含量影響較大，可使Dβ-H、NE含量升高，接近空白對照組，且預防高劑量組、低劑量組DA、Dβ-H、NE含量與治療高劑量組、低劑量組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。進一步提示頭痛寧膠囊的預防作用大于治療作用；同時，治療高劑量組、低劑量組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；預防高劑量組、低劑量組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，提示不同劑量的頭痛寧膠囊對DA、Dβ-H、NE含量影響不同。

本實驗分析各組間DA、Dβ-H、NE含量的相關性，發(fā)現(xiàn)DA與NE存在負相關關系，DA與Dβ-H存在負相關關系，NE與Dβ-H存在正相關關系，提示頭痛寧膠囊可降低DA水平，升高NE水平、Dβ-H水平，可能通過增加Dβ-H的活性使DA合成NE增加，達到治療及預防偏頭痛目的。

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