多重PCR法在食品中致瀉大腸埃希氏菌質(zhì)控考核中的應(yīng)用

1.引言

大腸埃希氏菌俗稱大腸桿菌，是人類和動物的腸道中重要的正常菌群，為宿主提供一些有營養(yǎng)作用的合成代謝產(chǎn)物。多數(shù)大腸埃希氏菌并不致病，當(dāng)機(jī)體抵抗力下降或侵入腸外組織或器官時，可作為條件致病菌而引起腸道外的感染，引起胃腸炎的大腸埃希氏菌分為五類即腸致病性大腸埃希氏菌(EPEC)、腸產(chǎn)腸毒素大腸埃希氏菌(ETEC)、腸侵襲性大腸埃希氏菌(EⅠEC)、腸出血性大腸埃希氏菌(EHEC)和粘附性腸埃希氏菌(EAEC)[1]。快速檢測和鑒定病原菌是及時有效地控制與預(yù)防傳染病傳播的重要手段。傳統(tǒng)的微生物學(xué)分離與鑒定以及血清學(xué)方法在鑒別與鑒定病原微生物方面日益顯現(xiàn)出不足。PCR法快速、敏感、特異，是對病原菌快速鑒別與分型的重要技術(shù)之一，而多重PCR更以其突出的優(yōu)越性得到了廣泛的應(yīng)用[2]。

2.材料與方法

2.1 樣品

樣品編號為15-1, 15-2，每份考核樣品包含西林瓶1個，西林瓶中裝有白色凍干菌球。本次考核共計2份樣品。

2.2 試劑及儀器

營養(yǎng)肉湯、腸道菌增菌肉湯、麥康凱瓊脂(MAC)、伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB)、三糖鐵(TSⅠ)瓊脂、大腸埃希氏菌生化套盒、無菌雙蒸水，以上試劑均使用北京路橋。五種致瀉大腸埃希氏菌DNA提取試劑盒、多重PCR及實時熒光PCR試劑盒均使用北京卓誠惠生，實時定量PCR儀器（BⅠO-RAD公司），凝膠成像儀（BⅠO-RAD公司），電泳儀。

2.3 試驗方法

按照GB4789.6-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué) 致瀉大腸埃希氏菌檢驗》[2]開始檢測。

2.3.1 樣品前處理與預(yù)增菌

待質(zhì)控樣品恢復(fù)至室溫，無菌開啟瓶蓋，將西林瓶中的白色菌球完全溶解于50mL無菌生理鹽水中,作為樣本。

2.3.2 以無菌操作量取檢樣25mL，加入裝有225mL營養(yǎng)肉湯的無菌袋中，振蕩混勻。將營養(yǎng)肉湯增菌液放置于36℃培養(yǎng)18h（增菌時間延長）。取1mL（加樣量增大）,接種于30mL腸道菌增菌肉湯管內(nèi)，于42℃培養(yǎng)18h。

2.3.3 分離

將增菌液劃線接種MAC和EMB瓊脂平板，于36℃培養(yǎng)24h，觀察菌落特征。

2.3.4 生化鑒定

選取平板上10個可疑菌落,分別接種TSⅠ斜面。同時將這些培養(yǎng)物分別接種蛋白胨水、尿素瓊脂(pH7.2)、KCN肉湯和營養(yǎng)瓊脂平板，于36℃培養(yǎng)24h。

2.3.5 PCR確證試驗

使用1μL接種環(huán)刮取營養(yǎng)瓊脂平板上的菌落，懸浮于200μL滅菌雙蒸水中，充分打散制成菌懸液，13000r/min離心3min，棄掉上清液。加入50μL充分震蕩混勻的核酸提取液，于100℃金屬浴維持10min，13000r/min離心3min，收集上清液，取2μL作為PCR檢測的模板。

3.結(jié)果與分析

3.1 平板分離結(jié)果結(jié)果如下

編號 麥康凱（MAC）培養(yǎng)基 伊紅美藍(lán)（EMB）15-1 桃紅色、濕潤、圓形菌落；淡粉色、濕潤、圓形菌落中心紫黑色帶金屬光澤;部分中心紫黑色不帶金屬光澤15-2 桃紅色、濕潤、圓形菌落；淡粉色、濕潤、圓形菌落中心紫黑色帶金屬光澤;部分中心紫黑色不帶金屬光澤

3.2 可疑菌落生化鑒定結(jié)果如下

注：“-”表示無生長，“+”表示生長。10個可疑菌落生化結(jié)果相同。

3.3 可疑菌落PCR確證試驗結(jié)果如下

注：“-”表示無條帶或曲線，“+”表示有條帶或曲線。

4.討論與分析

本實驗室自2014起，參與國家食品風(fēng)險監(jiān)測項目，并開始使用多重PCR技術(shù)，對五種致瀉大腸埃希氏菌進(jìn)行檢測。GB4789.6-2016自2017年6月23日執(zhí)行以來，也是食品微生物學(xué)檢驗系列國標(biāo)中，首個細(xì)菌使用PCR做確證的標(biāo)準(zhǔn)。河南省疾病預(yù)防控制中心對全省各地市進(jìn)行了質(zhì)控考核，了解各實驗室對該技術(shù)掌握的程度以及實驗室檢測水平。

傳統(tǒng)的血清學(xué)分型，操作繁瑣，技術(shù)人員要求高，且檢驗結(jié)果并不能作為是否有致病能力的依據(jù)，只能說某個血清型可能與致病相關(guān)。血清學(xué)鑒定的137株致瀉大腸中僅有15株（10.9%）為正確鑒定，僅采用血清學(xué)分類是不夠的[3]。與傳統(tǒng)血清試驗相比較而言，用PCR方法進(jìn)行確證，操作簡單，對操作人員要求不高，且提高致病菌檢出率及檢驗的準(zhǔn)確性，同時縮短了致病菌的檢驗時間。隨著快速檢驗方法的發(fā)展，快速檢驗因其優(yōu)點快速發(fā)展，在突發(fā)公共衛(wèi)生事件的處理中，發(fā)揮積極作用，但快速方法也存在其缺點，快速檢驗一般從基因著手，檢測到致病菌并未獲得其菌株，容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果。因此，在面對突發(fā)公共衛(wèi)生事件時，應(yīng)該靈活運用，將快檢方法與傳統(tǒng)方法相結(jié)合，快速準(zhǔn)確地得出實驗室結(jié)果，為相關(guān)部門處理問題提供可靠依據(jù)。該實驗室在此質(zhì)控過程中使用了兩種多重PCR方法來進(jìn)行確證試驗，相互印證結(jié)果，兩種方法實驗結(jié)果一致。實時熒光多重PCR優(yōu)點在于將PCR擴(kuò)增與結(jié)果判定結(jié)合一起，操作簡單，耗時短，污染少。普通PCR試驗后，需要進(jìn)行電泳試驗并用凝膠成像儀觀察結(jié)果，操作繁瑣，試驗過程耗時長，存在污染環(huán)境風(fēng)險[4]。

[1] 李凡, 劉晶星. 醫(yī)學(xué)微生物學(xué)(第七版)[M]. 北京∶人民衛(wèi)生出版社, 2012.

[2] 世界衛(wèi)生組織. 麻疹實況報道. 2017－03.

[3] GB4789.6-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué) 致瀉大腸埃希氏菌菌檢驗》[s].

[4] J Yang ,FJWu, J Mu,L Lin ,et al.Comparison between O Serotyping Method and Multiplex Real-Time PCR To Ⅰdentify Diarrheagenic Escherichia coli inTaiWan [J].《Journal of Clinical Microbiology》, 2007, 45(11) ∶3620-3625