谷子顯性恢復(fù)基因的AFLP分析

范秀麗

【摘 要】赤峰顯性核不育谷子是在谷子中首次發(fā)現(xiàn)的核不育材料，該材料的育性受2對(duì)核顯性基因互作控制，一對(duì)是顯性核不育基因Msch，另一對(duì)是顯性上位育性恢復(fù)基因Rf。兩者共同存在時(shí)顯性上位育性恢復(fù)基因Rf能抑制顯性核不育基因Msch的表達(dá)，從而表現(xiàn)可育。利用已構(gòu)建的不育基因Msch的上位育性恢復(fù)基因Rf的近等基因系（NILs）為材料，通過(guò)對(duì)300對(duì)AFLP引物組合進(jìn)行篩選，找到了與顯性上位育性恢復(fù)基因Rf緊密連鎖的2個(gè)AFLP標(biāo)記（E15/M52和E20/M41），與不育基因的遺傳距離分別是7.0cM和12.7cM，而且位于不育基因的同一側(cè)，標(biāo)記間相距5.7cM

【關(guān)鍵詞】谷子（Setaria italica）;顯性上位育性恢復(fù)基因;AFLP標(biāo)記

雄性不育性在植物界普遍存在，迄今為止，已經(jīng)在600多個(gè)物種及種間雜種中發(fā)現(xiàn)了雄性不育，其中包括玉米、水稻、大麥、谷子、高粱、油菜、棉花等主要農(nóng)作物。細(xì)胞核雄性不育（Nuclear male sterility）是由核基因控制的自然界最常見(jiàn)的雄性不育現(xiàn)象，人們已經(jīng)在玉米、棉花、谷子、水稻、大豆、小麥、油菜和大白菜等許多作物上發(fā)現(xiàn)和誘導(dǎo)出這種雄性不育類(lèi)型。在核不育材料中多數(shù)是由隱性基因控制的，由顯性基因控制的核不育現(xiàn)象較少，國(guó)內(nèi)外曾在棉花、萵苣、紅胡麻草、馬鈴薯、小麥、亞麻等少數(shù)植物中發(fā)現(xiàn)過(guò)。谷子（Setaria italica）核基因互作型雄性不育是胡洪凱等1978年首次從澳大利亞谷×吐魯番谷雜交后代中發(fā)現(xiàn)的，研究證實(shí)該材料的不育性受1對(duì)核顯性基因控制，并定名為赤峰顯性核不育，將該不育基因命名為Msch。進(jìn)一步的研究表明，這份顯性雄性不育材料具有其特殊性，表現(xiàn)在：①它的雜合不育株和純合不育株的花藥內(nèi)有部分正?？捎ǚ?，在北方谷子產(chǎn)區(qū)花藥始終不開(kāi)裂不散粉，自交不結(jié)實(shí);但在特定短日照的生態(tài)條件下（如冬季在低緯度的海南三亞、通什和廣東湛江等地）則花藥部分開(kāi)裂，能產(chǎn)生6.0%～10.0%的自交種子，可以獲得純合的全不育群體;②經(jīng)過(guò)大量的測(cè)配，從它的姊妹系中發(fā)現(xiàn)了恢復(fù)源材料181-5，181-5攜帶的顯性育性恢復(fù)基因Rf可以抑制雜交種中顯性不育基因的表達(dá)，使育性恢復(fù)正常。

一、材料與方法

（一）材料

用于研究的材料有近等基因系msmsrfrf和msmsRfRf及F2的3∶1（Rf∶rfrf）群體。研究材料種植在試驗(yàn)田和溫室，苗期（7葉）隨機(jī)選取近等基因系各5株和3∶1群體300株，以單株為單位分別編號(hào)掛牌，然后按編號(hào)取單株嫩葉提取基因組總DNA。開(kāi)花前各單株分別與同期播種基因型為MsMsrfrf的純合不育系株穗套在一個(gè)袋內(nèi)作測(cè)交，海南種植雜種后代的種子，通過(guò)育性來(lái)判斷各單株是否含有顯性基因Rf。

（二）顯性育性恢復(fù)基因Rf的表型鑒定

由雜合不育株Msmsrfrf與恢復(fù)系181-5（msmsRfRf）雜交獲得F1，F(xiàn)1自交選其不育株再用恢復(fù)系181-5回交，后代再自交。這樣連續(xù)回交5代，最后獲得了恢復(fù)系181-5（msmsRfRf）的近等基因系msmsrfrf。

近等基因系苗期各取5株用于DNA的提取，把含有Rf恢復(fù)基因的5個(gè)單株基因組DNA等量混合構(gòu)成恢復(fù)池，把不含恢復(fù)基因的5個(gè)單株基因組DNA等量混合構(gòu)成不恢池。3∶1群體是由雜合不育系（Mschmsrfrf）與恢復(fù)系181-5（msmsRfRf）雜交獲得的F2群體，該F2群體2008年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院院內(nèi)試驗(yàn)田種植，抽穗期隨機(jī)選取300個(gè)F2單株穗與純合不育系（MschMschrfrf）的株穗套在一個(gè)袋內(nèi)作測(cè)交，同時(shí)取這300個(gè)F2單株的葉片用于DNA提取。

（三）AFLP分析

AFLP分析程序參照Z(yǔ)abeau和Vos發(fā)明的方法。AFLP酶切采用EcoRⅠ和MseⅠ雙酶切組合。內(nèi)切酶和T4連接酶購(gòu)自NEB（New England Biolab）公司，接頭、引物及其他試劑購(gòu)自上海博亞生物技術(shù)公司，Taq DNA聚合酶購(gòu)自Promega公司。選擴(kuò)采用E+2/M+3和E+3/M+3引物組合。擴(kuò)增產(chǎn)物在6%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，銀染顯色觀察。

（四）數(shù)據(jù)分析

結(jié)果記錄有帶計(jì)為1，無(wú)帶計(jì)為0。數(shù)據(jù)處理用Mapmaker EXP Version 3.0軟件進(jìn)行。

二、結(jié)果與分析

（一）顯性恢復(fù)基因Rf的鑒定

2008年冬天在海南種植測(cè)交種，每穗一行，收獲期觀察育性。如果穗行出現(xiàn)育性分離或全可育，表明這個(gè)穗行的父本含有抑制不育基因Msch表達(dá)的顯性恢復(fù)基因Rf，若穗行全不育表明其父本不含有顯性恢復(fù)基因Rf。不難看出Rf∶rfrf的理論比率為3∶1。本試驗(yàn)在試驗(yàn)田里隨機(jī)選取300個(gè)單株穗與純合不育系（MschMschrfrf）的株穗套在一個(gè)袋內(nèi)作測(cè)交，共收獲了241株測(cè)交種，不育株是59株。

（二）與不育基因Msch的恢復(fù)基因Rf連鎖的AFLP標(biāo)記

用近等基因系（msmsRfRf、msmsrfrf）DNA池對(duì)300對(duì)引物組合進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)每個(gè)引物組合均可擴(kuò)增出穩(wěn)定、清晰的條帶，每對(duì)引物約能擴(kuò)出清晰的50條帶，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度50～1 000 bp。

三、討論

雄性不育是雜種優(yōu)勢(shì)利用的基礎(chǔ)，是實(shí)現(xiàn)谷子雜種優(yōu)勢(shì)利用最經(jīng)濟(jì)、有效的途徑之一。谷子核基因互作型雄性不育的不育性受兩對(duì)顯性核基因（不育基因Msch和上位育性恢復(fù)基因Rf）互作控制，恢復(fù)基因通過(guò)顯性上位作用來(lái)抑制不育基因的表達(dá)從而恢復(fù)育性，起到恢復(fù)基因的作用。這種由雙顯性基因互作控制的雄性核不育材料的發(fā)現(xiàn)為谷子雜種優(yōu)勢(shì)利用提供了一條全新的途經(jīng)，但同時(shí)也應(yīng)注意到由于谷子中的雙顯性基因控制的雄性不育性有它自己的特點(diǎn)，若將不育基因轉(zhuǎn)移到不同的優(yōu)良遺傳背景中以及進(jìn)行必要的細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)化，其轉(zhuǎn)育工作十分艱難與緩慢。

眾所周知，對(duì)于由2對(duì)顯性基因控制的雄性不育的機(jī)制，有2種假說(shuō);一是核基因互作假說(shuō)，一是復(fù)等位基因假說(shuō)。核基因互作假說(shuō)認(rèn)為，不育性由2對(duì)核基因控制，顯性核不育基因Ms對(duì)隱性可育基因ms為完全顯性，顯性抑制基因Rf對(duì)非抑制基因rf為完全顯性，不育株有MsMsrfrf和Msmsrfrf 2種基因型，可育株有7種基因型（MsMsRfRf、MsMsRfrf、MsmsRfRf、MsmsRfrf、msmsRfRf、msmsRfrf和msmsrfrf）。

不育株有2種基因型MsMs和Msms，可育株有4種基因型MsfMsf、MsfMs、Msfms和msms。

通過(guò)遺傳學(xué)的分離比例來(lái)確定是否是顯性上位互作或是復(fù)等位基因，赤峰顯性核不育谷子在遺傳學(xué)上已被證明了是顯性上位互作來(lái)控制的雄性不育性。為了提供更加有利、可靠的分子證據(jù)，利用谷子AFLP圖譜，將不育基因Ms和上位恢復(fù)基因Rf定位于染色體上，看它們是被定為在同一位點(diǎn)上還是不同位點(diǎn)，從而來(lái)判斷它們是上位互作基因還是復(fù)等位基因。

赤峰顯性核不育谷子的這種雙顯性基因控制的雄性不育性與萍鄉(xiāng)顯性核不育水稻的育性控制有許多相似之處，可以把這2種機(jī)制合并研究，來(lái)確定植物之間這種控制育性的相同機(jī)理;也可以通過(guò)比較谷子、水稻與其他植物上雙顯性基因控制的不育性的遺傳機(jī)制的異同點(diǎn)，來(lái)確定不同植物之間的不同發(fā)育特性，從而進(jìn)一步完善雙顯性基因控制的不育性的遺傳機(jī)制的理論基礎(chǔ)，將會(huì)更有利于雜種優(yōu)勢(shì)的利用。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉秉華.作物顯性雄性不育基因分類(lèi)與起源的探討[J].遺傳，1993，15（6）：32-34.