TLRs/MyD88與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的相關(guān)性研究

劉靜　謝克琴　曹躍朋　劉正奇　鄧志勇　李賀　孫貴炎

【摘 要】目的：研究Toll樣受體2（TLR2）、Toll樣受體4（TLR4）、髓樣分化因子88（MyD88）與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性。方法：選取120例痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者，其中急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者（急性組）76例，非急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者（非急性組）44例；另選取健康者20例為健康對(duì)照組。記錄所有患者的一般情況、病程、疼痛視覺(jué)模擬評(píng)分法（VAS）評(píng)分，檢查腎功能、C-反應(yīng)蛋白（CRP）、紅細(xì)胞沉降率（ESR），酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）檢測(cè)TLR2、TLR4、MyD88在外周血的濃度，采用SPSS 22.0軟件分析痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者的外周血TLR2、TLR4、MyD88與各指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果：①痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者外周血TLR2、TLR4、MyD88濃度較健康對(duì)照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

義（P < 0.01）；急性組患者外周血TLR2、TLR4、MyD88濃度較非急性組明顯升高（P < 0.01）。②病程< 1年、1～5年、5～10年、> 10年的患者外周血TLR2、TLR4、MyD88比較，病程 < 1年的患者外周血TLR2、TLR4高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；其他病程段的痛風(fēng)患者兩兩比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。急性組患者VAS評(píng)分、ESR、CRP高于非急性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。非急性組患者外周血尿酸高于急性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；2組尿素氮、肌酐、胱抑素C比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。④痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者外周血TLR2、TLR4、MyD88與CRP、ESR呈線性正相關(guān)（P < 0.01或P < 0.05）。結(jié)論：TLR2、TLR4、MyD88參與了痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者的發(fā)生、發(fā)展，尤其在急性期。

【關(guān)鍵詞】 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎；Toll樣受體；髓樣分化因子88；相關(guān)性

【ABSTRACT】Objective：To study the correlation between clinical and laboratory indexes of TLR2， TLR4 and MyD88 in patients with gouty arthritis.Methods：One hundred and twenty cases of gouty arthritis were divided into an acute group（76 cases）and a non-acute group（44 cases），and twenty 20 healthy people were chosen as a control group.The general condition，course of disease，pain visual analogue scale（VAS）scores of all patients were recorded.The renal function，C-reactive protein（CRP）and erythrocyte sedimentation rate（ESR）were checked.The enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）were used to detect the concent-

rations of TLR2，TLR4，MyD88 in peripheral blood，and the software SPSS 22.0 was used to analyze the correlation between TLR2，TLR4 and MyD88 in peripheral blood and all the indexes.Results：①The concentrations of TLR2，

TLR4 and MyD88 in the peripheral blood of patients with gouty arthritis were significantly higher than those in the healthy control group，and the difference was statistically significant（P < 0.01）.The concentrations of TLR2，TLR4 and MyD88 in the peripheral blood of the acute group was significantly higher than those in the non-acute group（P < 0.01）.②Comparison among patients respectively with disease course of less than

1 year，1～5 years，5～10 years and over 10 years，TLR2 and TLR4 of those with less than 1 year of disease course were higher，and the difference was statistically significant（P < 0.05）.There was no statistical significance between patients with the other different disease courses（P > 0.05）.③The VAS score，ESR and CRP in the

acute group were significantly higher than those in the non-acute group，and the difference was statistically significant（P < 0.01）.The peripheral blood uric acid in the non-acute group was higher than that in the acute group，and the difference was statistically significant（P < 0.05）.The differences of urea nitrogen，creatinine and cystatin C in the two groups were not statistically significant（P > 0.05）.④TLR2，TLR4 and MyD88 in peripheral blood of patients with gouty arthritis were positively correlated with CRP and ESR（P < 0.01 or P < 0.05）.Conclusion：TLR2，TLR4 and MyD88 are involved in the occurrence and development of gouty arthritis，especially in acute phase.

【Keywords】 gouty arthritis；Toll-like receptor；MyD88；correlation

痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是單鈉尿酸鹽（MSU）結(jié)晶在關(guān)節(jié)軟骨、滑膜及周圍組織等沉積而引發(fā)非特異性炎癥反應(yīng)，分為急性期和非急性期。MSU結(jié)晶是炎癥的潛在觸發(fā)器，除了痛風(fēng)急性發(fā)作炎癥反應(yīng)較重，痛風(fēng)間歇期、緩解期、慢性痛風(fēng)和痛風(fēng)石也普遍存在低水平的無(wú)菌性炎癥[1]。MSU是一種內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)相關(guān)分子（DAMPs），被機(jī)體識(shí)別后通過(guò)固有免疫引起炎癥和細(xì)胞凋亡[2]。Toll樣受體（TLRs）介導(dǎo)的通路和髓樣分化因子88（MyD88）依賴的白細(xì)胞介素-1（IL-1）受體途徑與MSU結(jié)晶引起的急性炎癥有關(guān)，單核巨噬細(xì)胞的細(xì)胞膜表面存在Toll樣受體2（TLR2）和Toll樣受體4（TLR4）可以識(shí)別細(xì)胞外的MSU晶體，并誘導(dǎo)IL-1β前體的轉(zhuǎn)錄，從而產(chǎn)生一系列炎癥階連反應(yīng)[3]。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2015年12月至2016年10月

在貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科就診的門診或住院痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者120例，所有患者均符合2015年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)（ACR）/歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟（EULAR）制定的痛風(fēng)分類標(biāo)準(zhǔn)[4]。其中急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者（急性組）76例，非急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者（非急性組）44例；男114例，女6例；年齡21～69歲，平均（48.76±9.20）歲。健康對(duì)照組隨機(jī)抽取貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院體檢中心健康者20例，性別、年齡比例與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者相似。記錄患者的具體病程長(zhǎng)短，再進(jìn)行病程分段：< 1年（7例）、1～5年（22例）、5～

10年（35例）、> 10年（56例）。本研究通過(guò)貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院人體試驗(yàn)倫理委員會(huì)審核。所有納入病例簽署知情同意書；排除嚴(yán)重心腦血管疾病、繼發(fā)性痛風(fēng)及合并風(fēng)濕免疫性疾病

患者。

1.2 主要儀器及試劑 三重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；-20 ℃冰箱、4 ℃冰箱（中科美菱）；低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Thermo Forma公司）；超凈工作臺(tái)（蘇潔凈化有限公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）；電熱恒溫水域箱（天津泰斯特儀器有限公司）；微量移液槍（德國(guó)Eppendorf公司）；全自動(dòng)生化分析儀（日本TOSHIBA公司）；血沉儀（越華XC-A3A）；全自動(dòng)血液分析儀（Sysmex XT-2000i）；洗板機(jī)（凱特生物醫(yī)療電子科技有限公司）；TLR2 ELISA試劑盒、TLR4 ELISA試劑盒、MyD88 ELISA試劑盒（上海勁馬生物科技有限

公司）。

1.3 標(biāo)本收集及檢測(cè)方法 所有納入病例均清晨空腹肘部靜脈采血，分別用常規(guī)抗凝管、生化管采集5 mL靜脈血，隨即送往貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，使用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)腎功能及全程C-反應(yīng)蛋白（CRP），血沉儀檢測(cè)紅細(xì)胞沉降率（ESR）。將生化管采集的靜脈血置于離心機(jī)以3000 r·min-1離心10 min，取血清于無(wú)菌EP管內(nèi)，放于-20 ℃冰箱保存，供ELISA檢測(cè)。臨檢測(cè)時(shí)，首先將放于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆玫难迦〕觯旁谑覝亟鈨?，同時(shí)試驗(yàn)開始前把人TLR2、TLR4、MyD88酶聯(lián)免疫法吸附測(cè)定試劑盒取出在室溫中放置30 min，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.4 疼痛視覺(jué)模擬評(píng)分法（VAS）評(píng)分 疼痛

10 cm水平視力對(duì)照表[5]：用一條長(zhǎng)為10 cm可滑動(dòng)游標(biāo)標(biāo)尺，兩端分別為0分和10分?；颊咧赋鲎钅艽硖弁闯潭鹊奈恢?，醫(yī)師記錄評(píng)分。0級(jí)，沒(méi)有疼痛；1～3級(jí)，輕度疼痛，能正?；顒?dòng)；4～

6級(jí)，中度疼痛，生活可自理，但影響工作；7～9級(jí)，較嚴(yán)重的疼痛，生活不能自理；10級(jí)，劇烈疼痛，無(wú)法忍受。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，符合正態(tài)分布，滿足方差齊性，2組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間樣本資料采用單因素方差分析；不符合正態(tài)分布采用非參數(shù)（秩和）檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)和百分比表示，采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析，數(shù)據(jù)呈偏態(tài)分布采用Spearman分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎組與健康對(duì)照組TLR2、TLR4、MyD88比較 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者外周血TLR2、TLR4、MyD88濃度明顯高于健康對(duì)照組，2組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見表1。

2.2 急性組與非急性組TLR2、TLR4、MyD88比較 急性組與非急性組痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者外周血TLR2、TLR4、MyD88濃度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見表2。

2.3 不同病程TLR2、TLR4、MyD88比較 病程 < 1年、1～5年、5～10年、> 10年的患者外周血TLR2、TLR4、MyD88比較，病程< 1年的患者外周血TLR2、TLR4較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

（P < 0.05）；其他各病程段兩兩比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表3。

2.4 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎與VAS評(píng)分、CRP、ESR的關(guān)系 數(shù)據(jù)資料經(jīng)檢驗(yàn)，不符合正態(tài)分布，各組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)（秩和檢驗(yàn)）?；颊咛弁碫AS評(píng)分急性組及非急性組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

（P < 0.01）。痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性組患者外周血CRP、ESR明顯升高，與非急性組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見表4。

2.5 痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎與腎功能各指標(biāo)的關(guān)系 非急性組患者外周血尿酸高于急性組，2組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；2組尿素氮、肌酐、胱抑素C比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表5。

2.6 TLR2、TLR4、MyD88與臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性分析 各指標(biāo)經(jīng)檢驗(yàn)后呈偏態(tài)分布，采用Spearman檢驗(yàn)分析了解其相關(guān)性，結(jié)果提示，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者外周血TLR2、TLR4、MyD88與CRP、ESR呈線性正相關(guān)（P < 0.01或P < 0.05）。見表6。

3 討 論

近年來(lái)對(duì)痛風(fēng)急性發(fā)作的機(jī)理研究顯示，TLRs介導(dǎo)的通路和MyD88依賴的IL-1受體途徑與MSU結(jié)晶引起的急性炎癥有關(guān)[6]。TLRs是Ⅰ型跨膜蛋白受體，包括胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)，胞外區(qū)含有不同長(zhǎng)度的亮氨酸重復(fù)區(qū)域，參與配體的識(shí)別；細(xì)胞內(nèi)羧基末端包含一個(gè)保守部位，與IL-1受體相似，被稱為Toll/IL-1受體結(jié)構(gòu)域（TIR），依賴TIR的嗜同性作用和下游接頭蛋白的TIR結(jié)合來(lái)傳導(dǎo)信號(hào)[7]。TLRs通過(guò)識(shí)別相應(yīng)的配體，然后與這些配體結(jié)合，再通過(guò)MyD88和干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白（TRIF）依賴性途徑（非MyD88依賴性途徑）下傳信號(hào)，激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）和激活蛋白1（AP-1），啟動(dòng)相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄，快速激活致炎因子IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素（IFN）、趨化性細(xì)胞因子、黏附分子、環(huán)氧化酶-2（COX-2）和誘生型一氧化氮合成酶的轉(zhuǎn)錄，這些酶的產(chǎn)物和細(xì)胞因子在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8-15]。IL-β是MSU晶體誘導(dǎo)炎癥的關(guān)鍵因子，而TLR2和TLR4可以識(shí)別細(xì)胞外的MSU晶體，誘導(dǎo)IL-β前體的轉(zhuǎn)錄[16]。TLRs是決定MSU晶體沉積引起痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的主要因素，TLRs/MyD88信號(hào)通路參與了痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)過(guò)程。因此，TLRs/MyD88信號(hào)通路是一個(gè)具有多種調(diào)節(jié)功能的傳導(dǎo)通路，在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)過(guò)程中起重要作用[17]。國(guó)內(nèi)外眾多研究均表明TLR2、TLR4、MyD88與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[18-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，急性組患者疼痛VAS評(píng)分、ESR、CRP高于非急性組，提示痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎急性期炎癥反應(yīng)重，患者主觀感覺(jué)疼痛明顯。ESR、CRP目前被普遍認(rèn)為是炎癥過(guò)程中的急性時(shí)相反應(yīng)物，本研究急性組與非急性組ESR、CRP平均數(shù)值均高于基線值，說(shuō)明不同證型的痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者均存在不同程度的炎癥。非急性組患者外周血尿酸高于急性組，急性組、非急性組中尿素氮、肌酐、胱抑素C沒(méi)有差異，急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者血尿酸往往不高，尿素氮、肌酐、胱抑素C受病程、病情嚴(yán)重程度等影響，與痛風(fēng)是否急性發(fā)作無(wú)相關(guān)性。進(jìn)一步對(duì)痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎臨床、實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)與TLR2、TLR4、MyD88進(jìn)行相關(guān)性分析后發(fā)現(xiàn)，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者外周血TLR2、TLR4、MyD88與ESR、CRP呈正相關(guān)，提示痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展受TLRs/MyD88信號(hào)通路介導(dǎo)，且參與痛風(fēng)的炎癥反應(yīng)，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的不同時(shí)期均存在炎癥，在急性期表現(xiàn)更為

強(qiáng)烈。

本研究結(jié)果提示，TLR2、TLR4、MyD88參與了痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎患者的發(fā)生、發(fā)展，尤其在急性關(guān)節(jié)炎期。總之，痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，眾多信號(hào)通路、細(xì)胞因子參與痛風(fēng)的發(fā)病，研究TLRs/MyD88信號(hào)通路與痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎臨床及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的相關(guān)性，進(jìn)一步闡明了痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制，以期指導(dǎo)預(yù)測(cè)病情、評(píng)估療效。目前我們對(duì)于TLRs/MyD88信號(hào)通路在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎中的研究尚處于初探階段，下一步將通過(guò)不同的方法進(jìn)一步深入研究。

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收稿日期：2017-10-09；修回日期：2017-12-15