針刺對胃潰瘍模型大鼠CRH、ACTH的影響

關(guān)翰宇 馬佳佳 李婧婷 付晨露 王旒靖 薛 婷邵一軒 葛東宇 董瑞娟 馬惠芳

（北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029）

機(jī)體受到應(yīng)激性刺激，導(dǎo)致胃、十二指腸出現(xiàn)急性糜爛和潰瘍，稱之為應(yīng)激性胃潰瘍，其發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制尚未完全明了［1]。近年來胃潰瘍的發(fā)病率呈明顯上升趨勢，其發(fā)病的主要原因是人們的飲食習(xí)慣不健康以及生存環(huán)境的改變。由于患者常忽視胃潰瘍的嚴(yán)重性，對該病的治療和醫(yī)囑依從性差，病程纏綿，故常引發(fā)嚴(yán)重疾病如胃癌、上消化道出血等［2]。目前西醫(yī)仍難以完全根治胃潰瘍。有研究表明，HPA軸功能亢進(jìn)可以導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)損傷甚至疾病［3]。由于下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸負(fù)反饋機(jī)制失調(diào)使促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）、腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）、不斷升高，胃蛋白酶和胃酸分泌增加、胃黏液分泌減少，胃腸黏膜屏障功能受損，引起機(jī)體胃潰瘍［4]。而針刺在保護(hù)胃黏膜、減少胃出血等方面作用顯著，對治療胃潰瘍有較好療效［5]。本實驗探討針刺對應(yīng)激性胃潰瘍大鼠血清、腦組織中CRH、ACTH的影響，并探討其可能的作用機(jī)制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性清潔級SD大鼠28只，體質(zhì)量（200±20）g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物合格證號：SCXK（京）2009-0017。實驗過程對動物的處置符合《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》的規(guī)定。

1.2 試劑與儀器 ACTH酶聯(lián)免疫試劑盒。CRH酶聯(lián)免疫試劑盒。水合氯醛（沈陽市國藥化學(xué)試劑公司）。奧美拉唑腸溶片（阿斯利康制藥有限公司）。Multiskan MK3標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀（Thermo Scientific）。SKP-02.600電熱恒溫培養(yǎng)箱 （黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司）。DEM-3自動洗板機(jī) （北京拓普分析儀器有限公司）。3K18離心機(jī)（Sigma）。針具（漢醫(yī)牌無菌針灸針）。

1.3 干預(yù)方法 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分為模型組、空白組、針刺組、藥物組，每組7只。造模后第1日進(jìn)行干預(yù)，針刺組針刺中脘、雙側(cè)足三里穴，各組均直刺進(jìn)針，平補平瀉，留針20min，每5分鐘行針30 s，連續(xù)5 d。所有穴位定位參照化學(xué)工業(yè)出版社2010年9月出版的 《實驗針灸學(xué)》（張露芬主編），其中足三里對應(yīng)后三里。后三里位于膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，在脛骨頭下處，直刺7mm。中脘位于臍上約20mm，直刺2mm。藥物組采用每日給奧美拉唑腸溶片溶液2mL灌胃，濃度為0.2mg/kg，連續(xù)5 d。奧美拉唑腸溶片0.2mg/kg，將藥片打碎，用蒸餾水溶解，濃縮成每次2mL用量。

1.4 模型制備 本實驗SU模型造模方法采用RWIS應(yīng)激法［6]的改良辦法復(fù)制。空白組不做造模處理，針刺組、模型組、藥物組大鼠禁食不禁水36 h后造模。將大鼠放入自制固定器（350 mL塑料礦泉水瓶，去瓶蓋，剪開距瓶底5 cm處，將大鼠頭部朝上從瓶底剪開處放入）中，將裝有大鼠的礦泉水瓶直立放入溫度約（20±1）℃的水中，浸泡3 h后取出。各治療組于造模后第1日開始治療，連續(xù)5 d。首次造模后第3日，除空白組外各組重復(fù)上述造模過程再次造模。

1.5 標(biāo)本采集與檢測 首次造模后第5日，于治療結(jié)束后各組用40mg/kg戊巴比妥鈉腹腔注射，待麻醉后快速取血、取胃、取腦。1）胃黏膜損傷程度測量。結(jié)扎幽門和賁門，將10%多聚甲醛固定液10mL注入胃內(nèi)，將胃取下，按組別放入裝有多聚甲醛的帶蓋廣口瓶中。在固定液中放置10 min后，沿胃大彎剪開，使用游標(biāo)卡尺測量潰瘍灶長度及寬度，采用Guth［7]計分法計算胃黏膜損傷程度，用損傷指數(shù)（UI）表示：斑點糜爛計1分；糜爛損傷長度＜1mm計2分；糜爛損傷長度1～2mm計3分；糜爛損傷長度2～3mm計4分；糜爛損傷長度3mm計5分；損傷寬度1mm時分值×2。2）血清中CRH、ACTH水平檢測。腹主動脈取血5mL，靜置30min后以3000 r/min的速度在-4℃離心5 min，離心完畢取血清2mL置于-80℃冰箱冷凍保存。用酶聯(lián)免疫法（ELISA）方法檢測CRH、ACTH水平。3）腦組織中CRH、ACTH水平檢測。大鼠去冠后，迅速取出腦組織，剝離出下丘腦和垂體，稱質(zhì)量，勻漿。待組織勻漿之后，放入離心機(jī)中，以3000 r/min離心15 min取上清液。全血離心取血清，用酶聯(lián)免疫法檢測下丘腦中CRH水平以及垂體中ACTH水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示。組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠胃黏膜潰瘍指數(shù)評分比較 見表1，圖1。正常組大鼠胃黏膜光滑完整，未見損傷性改變，模型組大鼠胃黏膜充血明顯，有大量點狀線狀出血點和糜爛，損傷程度明顯高于正常組，針刺治療組和藥物治療組胃黏膜充血程度較模型組降低，點狀線狀出血點和糜爛變少。與空白組相比，模型組胃黏膜潰瘍指數(shù)顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，針刺組和藥物組胃黏膜潰瘍指數(shù)明顯降低（P＜0.05）；針刺治療組與藥物治療組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組大鼠Guth胃黏膜UI評分比較（分，±s）

表1 各組大鼠Guth胃黏膜UI評分比較（分，±s）

與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。

組 別 n 潰瘍指數(shù)空白組 7模型組 7針刺組 7 0 52.43±19.51 18.00±11.61##藥物組 734.71±9.45#

圖1 各組大鼠胃黏膜損傷程度比較

2.2 各組大鼠血清中ACTH水平比較 見表2。與空白組相比，模型組血清中ACTH水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，針刺組血清中ACTH水平顯著降低（P＜0.01），藥物組水平降低，但無統(tǒng)計學(xué)差異 （P＞0.05）；針刺組與藥物組比較，針刺組血清中ACTH水平較低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠血清及垂體中ACTH水平比較（ng/L，±s）

表2 各組大鼠血清及垂體中ACTH水平比較（ng/L，±s）

與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與藥物組比較，△P＜0.05。 下同。

組 別 n 血清ACTH 垂體ACTH空白組 7模型組 7針刺組 7 30.85±4.86 48.22±8.33 55.92±6.39** 68.75±3.46**34.32±5.45##△ 62.90±6.22#藥物組 750.07±10.34# 62.90±11.09#

2.3 各組大鼠垂體中ACTH水平比較 見表2。與空白組相比，模型組垂體中ACTH顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，針刺組、藥物組垂體中ACTH水平降低，雖無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），但有下降趨勢；針刺組與藥物組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.4 各組大鼠血清中CRH水平比較 見表3。與空白組相比，模型組血清中CRH水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，針刺組血清中CRH水平顯著降低（P＜0.01），藥物組血清中CRH水平降低，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）；針刺組與藥物組比較，針刺組血清中CRH水平較低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組大鼠血清、下丘腦中CRH水平比較（ng/L，±s）

表3 各組大鼠血清、下丘腦中CRH水平比較（ng/L，±s）

組 別 n 血清CRH 下丘腦CRH空白組 7模型組 7針刺組 7 24.05±1.82 35.17±2.73 33.13±4.71** 45.56±1.80**24.88±2.39##△ 38.46±1.78##藥物組 730.89±2.04# 39.01±1.59#

2.5 各組大鼠下丘腦中CRH水平比較 見表3。與空白組相比，模型組下丘腦中CRH水平顯著升高 （P＜0.01）；與模型組相比，針刺組下丘腦中CRH水平顯著降低（P＜0.01），藥物組下丘腦中CRH水平降低（P＜0.05）；針刺組與藥物組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義 （P＞0.05）。

3 討 論

針灸治療胃潰瘍具有遠(yuǎn)期療效好、復(fù)發(fā)率低、副作用小、操作便捷等優(yōu)勢［8]。 有研究表明［9-10]，針刺干預(yù)能夠促進(jìn)大鼠胃潰瘍的愈合。本實驗選取足三里、中脘兩穴。足三里為胃經(jīng)合穴和胃腑的下合穴，有健脾益胃、生化氣血、調(diào)暢氣機(jī)的功效。中脘為胃經(jīng)募穴有疏利氣機(jī)，理氣和胃的功效。兩穴為合募配穴，皆可調(diào)節(jié)脾胃，合用可加強治療效果［11]。針刺足三里可以調(diào)節(jié)胃運動和胃分泌功能，改善胃黏膜損傷，促進(jìn)胃黏膜修復(fù)，從而起到治療胃潰瘍的作用［12]，還可以通過影響神經(jīng)-免疫-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮對胃的調(diào)節(jié)作用［13]。奧美拉唑有抑酸作用，可緩解炎癥反應(yīng)，為典型的質(zhì)子泵抑制劑，且較其他藥物不良反應(yīng)更小，是治療胃潰瘍的常用藥物，故選擇奧美拉唑為本實驗治療藥物［14-15]。

有研究表明，在機(jī)體受到應(yīng)激性刺激后，起到核心作用的是下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸［16]，HPA 軸功能持續(xù)亢進(jìn)，會使機(jī)體對外源性應(yīng)激因子的易感性增加，從而引起胃腸道損傷［17]，而 CRH、ACTH 是構(gòu)成和調(diào)節(jié)HPA軸的重要物質(zhì)。機(jī)體受到的應(yīng)激性刺激經(jīng)中樞整合傳入HPA軸，通過HPA軸對胃腸的調(diào)節(jié)功能，再將調(diào)控信息傳送到腸神經(jīng)或直接作用于胃腸效應(yīng)細(xì)胞，使胃的運動功能受到抑制，胃酸過多分泌，從而使胃黏膜損傷加?。?8]。HPA軸被應(yīng)激性刺激激活的同時，下丘腦中的CRH大量分泌，在CRH的作用下，ACTH水平升高，胃酸、胃酶分泌增加，黏膜屏障的保護(hù)作用受損，胃黏膜表皮細(xì)胞更新受到抑制，最終導(dǎo)致胃黏膜受到損傷繼而產(chǎn)生應(yīng)激性胃潰瘍［19]。應(yīng)激性刺激對通過HPA軸影響胃腸的表現(xiàn)方式為：機(jī)體受到應(yīng)激性刺激后異常激活了HPA軸、導(dǎo)致CRH分泌增加、在CRH的作用下ACTH水平升高、消化系統(tǒng)受到影響、引發(fā)應(yīng)激性胃潰瘍［20]。

本實驗通過束縛-浸水應(yīng)激法復(fù)制大鼠應(yīng)激性潰瘍模型，以胃黏膜損傷指數(shù)（UI）評估大鼠胃黏膜損傷程度，造模后針刺組采用針刺中脘、足三里穴干預(yù)，藥物組采用奧美拉唑藥物干預(yù)，研究針刺對胃潰瘍模型大鼠血清、腦組織中CRH、ACTH的影響。實驗結(jié)果表明模型組大鼠胃黏膜損傷指數(shù)顯著高于正常組；針刺組和藥物組損傷指數(shù)較模型組明顯降低；提示胃黏膜UI與胃黏膜損傷程度呈正相關(guān)。模型組大鼠血清、腦組織中CRH、ACTH水平較空白組均升高（P＜0.05）；提示應(yīng)激性胃潰瘍的發(fā)生可能與CRH、ACTH的升高有關(guān)。與模型組相比針刺組大鼠血清中CRH、ACTH、下丘腦中CRH水平均降低；垂體中ACTH水平有下降趨勢；提示針刺治療可以有效降低CRH、ACTH水平，從而治療胃潰瘍，其機(jī)制可能是通過抑制中樞和外周CRH、ACTH的大量分泌，使HPA軸得到調(diào)節(jié)，降低機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)，減少胃酸分泌，恢復(fù)黏膜屏障保護(hù)作用，從而達(dá)到治療應(yīng)激性胃潰瘍。針刺組、藥物組兩組與模型組相比CRH、ACTH水平均有不同程度降低（P＜0.05），觀察針刺、藥物兩組實驗結(jié)果，針刺組血清中CRH、ACTH水平較藥物組均降低（P＜0.05）；提示針刺治療可能優(yōu)于奧美拉唑治療；腦組織中針刺組與藥物組CRH、ACTH水平無明顯差異，但針刺治療無副作用，故相較之下，針刺為更好的治療方法。本實驗為臨床針刺治療應(yīng)激性胃潰瘍提供了一定的實驗依據(jù)。然而對于針刺與藥物干預(yù)應(yīng)激性胃潰瘍作用于HPA軸的機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

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