參麥注射液對急性束縛性應(yīng)激大鼠大腦皮質(zhì)Bcl-2/Bax表達(dá)及炎癥因子的影響*

郟丹赟 王均爐 莫云長 耿武軍 戴勤學(xué)

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 溫州 325000）

參麥注射液具有益氣固脫、養(yǎng)陰生津、生脈等功效，目前已廣泛用于治療心血管、呼吸、神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?-2]。參麥注射液作為一種急診用藥，大量研究表明其對神經(jīng)元損傷和大腦皮質(zhì)具有保護作用［2-3]。急性應(yīng)激是機體在各種危重情況下導(dǎo)致的全身性非特異性適應(yīng)性反應(yīng)，會導(dǎo)致大腦皮質(zhì)炎癥因子分泌的增加［4]。研究表明，急性應(yīng)激會使大腦功能減退，造成神經(jīng)元損害［5]?；蛘{(diào)控的自主性、程序性細(xì)胞死亡過程控制著神經(jīng)細(xì)胞凋亡過程，Bcl-2基因?qū)?xì)胞凋亡發(fā)揮抑制作用，Bax基因則對細(xì)胞凋亡發(fā)揮促進(jìn)作用，二者是一對比較成熟的基因［6]。本實驗通過建立急性束縛性應(yīng)激大鼠模型，觀察參麥注射液預(yù)處理后大鼠大腦皮質(zhì)Bcl-2/Bax和炎癥因子腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）的表達(dá)，探討參麥注射液在急性應(yīng)激方面的作用及其可能機制?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性 SD 大鼠 24只，體質(zhì)量（250±10）g，購于上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，許可證號：SCXK（滬）2007-0005。

1.2 試藥及儀器

參麥注射液（正大青春寶藥業(yè)有限公司，批號：）。束縛器 （ZH-TXQ，杭州雷琪實驗器材有限公司，中國）；大鼠皮質(zhì)酮（CORT）和促腎上腺皮質(zhì)激（ACTH）ELISA試劑盒和大鼠炎癥因子（TNF-α和IL-6）ELISA試劑盒（上海西唐生物科技有限公司）；TRIzol試劑盒（15596，Invitrogen，USA），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（BS-PCR005，Bio-Serve），PCR 擴 增 采 試 劑 盒 （BS-PCR003，Bio-Serve）；10%水合氯醛；酶標(biāo)儀 （DENLEY DRAGON Wellscan MK 3，Thermo，芬蘭）；0.9%氯化鈉注射液；定量PCR儀器 （ABI7500，ABI，USA）； 微量分光光度計（NanoDrop1000，Thermo，USA）。 BCA 蛋白質(zhì)定量試劑盒（p0012，碧云天）。

1.3 分組與造模

SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為正常對照組、參麥對照組、模型組、參麥預(yù)處理組，每組6只。模型組和參麥預(yù)處理組大鼠均行急性束縛應(yīng)激模型制備［7]：采用ZH-TXQ型專業(yè)大白鼠固定器，抓住大鼠尾端，其本能的鉆入束縛器，然后調(diào)節(jié)束縛器的長度使大鼠制動2 h。參麥預(yù)處理組于制模前30 min腹腔注射參麥注射液15mL/kg，模型組與相同時間點腹腔注射0.9%氯化鈉注射液15mL/kg。正常對照組和參麥對照組不制模，僅于相應(yīng)時間點分別注射等量0.9%氯化鈉注射液或參麥注射液［3，8]。本實驗中動物模型建立和處理方法符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 標(biāo)本采集與檢測

1.4.1 激素測定 于制模前和制模后腹腔注射10%水合氯醛3mL/kg麻醉大鼠，取內(nèi)眥靜脈血1mL，收集在冷凍過的肝素化小離心管（EP管）中，4℃下離心15min，取血漿于-20℃保存待測。用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）和皮質(zhì)酮（CORT）水平。

1.4.2 實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）測定Bcl-2、BaxmRNA表達(dá) 于制模后30min麻醉大鼠，活殺取大腦，冰上游離皮質(zhì)組織，快速置于-80℃液氮中保存。用TRIzol法提取皮質(zhì)RNA和甲醛變性，凝膠電泳測試完整性，在波長260 nm和280 nm處測定RNA吸光度（A）值，計算RNA的純度和濃度。反轉(zhuǎn)錄成cDNA，引物由GeneBank使用基因探索者軟件自行設(shè)計，引物序列見表1。反應(yīng)條件：95℃、3min；95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，35～40 個循環(huán)；最后72℃、15 min。以目的基因與內(nèi)參基因3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）的A值比值表示目的基因表達(dá)量。

表1 引物序列

1.4.3 蛋白質(zhì)免疫印跡試驗（Western Blot）測定Bcl-2、Bax蛋白表達(dá) 取大鼠大腦皮質(zhì)組織，提取蛋白質(zhì)，用BCA法定量蛋白質(zhì)，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）、轉(zhuǎn)膜、封閉，抗體孵育，將膜置于反應(yīng)液中，室溫孵育，X線曝光膠片。掃描圖片，用AlphaEaseFC 4.0軟件分析特異條帶的灰度值并數(shù)字化，以Bcl-2或Bax蛋白與內(nèi)參GAPDH的灰度值比值表示目的蛋白表達(dá)量。

1.4.4 炎癥因子測定 于制模后30 min麻醉大鼠，活殺取大腦，冰上游離皮質(zhì)組織，按按照ELISA試劑盒說明書上操作方法檢測大腦皮質(zhì)炎癥因子TNF-α、IL-6水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，制模前后兩組數(shù)據(jù)比較采用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 模型組大鼠造模前后激素水平比較

見表2。大鼠急性束縛應(yīng)激后血漿ACTH和CORT水平均明顯高于應(yīng)激前（均P＜0.01）。

表2 模型組大鼠急性束縛性應(yīng)激前后血漿ACTH和CORT 水平比較（分，±s）

表2 模型組大鼠急性束縛性應(yīng)激前后血漿ACTH和CORT 水平比較（分，±s）

與造模前比較，*P＜0.01。

時 間 n ACTH（pmol/L） CORT（nmol/L）造模前 6 547.397±13.538 2.921±0.490造模后 6 957.697±52.776* 8.982±0.970*

2.2 各組大鼠大腦皮質(zhì)Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)水平比較

見表3。與正常對照組和參麥對照組比較，模型組Bcl-2 mRNA表達(dá)明顯降低，BaxmRNA表達(dá)明顯增高（均P＜0.01）。與模型組比較，參麥預(yù)處理組Bcl-2 mRNA表達(dá)明顯增高，Bax mRNA表達(dá)明顯降低 （均P＜0.01）。參麥對照組與正常對照組Bcl-2、BaxmRNA表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠大腦皮質(zhì)Bcl-2、BaxmRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表3 各組大鼠大腦皮質(zhì)Bcl-2、BaxmRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)水平比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.01；與正常對照組和參麥對照組比較，△P＜0.01。下同。

組 別 mRNA表達(dá)（A值）蛋白表達(dá)（灰度值）正常對照組 Bcl-2 2.48±0.14 0.83±0.04（n＝6） Bax 0.83±0.07 0.89±0.02參麥對照組 Bcl-2 2.79±0.13 0.83±0.03（n＝6） Bax 0.81±0.03 0.85±0.02模型組 Bcl-2 1.76±0.07△ 0.81±0.03（n＝6） Bax 2.72±0.13 1.05±0.04△參麥預(yù)處理組 Bcl-2 2.68±0.06* 0.82±0.03（n＝6） Bax 0.82±0.08* 0.85±0.02*

2.3 各組大鼠大腦皮質(zhì)Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平比較

見表3，圖1。模型組Bax蛋白表達(dá)較正常對照組和參麥對照組明顯增高（均P＜0.01）；而參麥預(yù)處理組Bax蛋白表達(dá)較模型組明顯降低 （P＜0.01）。各組間Bcl-2蛋白表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 蛋白質(zhì)免疫印跡試驗（Western Blot）檢測各組大鼠大腦皮質(zhì)組織Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)

2.4 各組大鼠大腦皮質(zhì)炎癥因子TNF-α、IL-6表達(dá)水平比較

見表4。模型組炎性因子TNF-α、IL-6表達(dá)較正常對照組和參麥對照組明顯增高（均P＜0.01）；而參麥預(yù)處理組炎性因子TNF-α、IL-6表達(dá)較模型組明顯降低（均P＜0.01），與正常組和參麥對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表4 各組大鼠大腦皮質(zhì)炎癥因子TNF-α、IF-6表達(dá)水平比較（pg/mL，±s）

表4 各組大鼠大腦皮質(zhì)炎癥因子TNF-α、IF-6表達(dá)水平比較（pg/mL，±s）

組 別 n TNF-α IF-6正常對照組 6 38.50±0.52* 50.31±1.75*參麥對照組 6 38.48±0.66* 49.62±2.17*模型組 6 84.41±7.44 145.62±7.03參麥預(yù)處理組 6 44.66±2.04* 53.68±2.44*

3 討 論

急性應(yīng)激是現(xiàn)代生活中的社會常態(tài)。應(yīng)激時糖皮質(zhì)激素會增加（人體為皮質(zhì)醇，大鼠為CORT），而激素長期增加會產(chǎn)生一系列生理病理變化［9-10]。應(yīng)激時，應(yīng)激性代謝反應(yīng)會激活下丘腦-垂體軸，這個反應(yīng)過程會使ACTH和CORT的量上升，從而觸發(fā)后續(xù)炎癥、免疫及行為改變［10]。本研究顯示，制模后血漿ACTH和CORT水平明顯高于制模前，表明急性束縛性應(yīng)激動物模型制備成功。

應(yīng)激是多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的危險因素，其可以通過改變大腦的神經(jīng)營養(yǎng)因子，導(dǎo)致神經(jīng)損傷。本研究小組早期用急性束縛性應(yīng)激，發(fā)現(xiàn)大鼠海馬組織里的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）的表達(dá)明顯下降［7]。在神經(jīng)損傷過程中，Bcl-2和Bax家族在調(diào)控細(xì)胞凋亡中占據(jù)重要地位，Bcl-2蛋白是存在于細(xì)胞線粒體、核膜等處的一種膜合蛋白，可中斷減弱凋亡信號的傳遞，具有抑制細(xì)胞凋亡和延長細(xì)胞壽命的作用；Bcl-2的同源蛋白Bax蛋白可以加速細(xì)胞凋亡，并且抑制Bcl-2的效應(yīng)［11-12]。Bcl-2和Bax蛋白微量存在于正常細(xì)胞中，處于一種平衡狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞受到損害時，這種平衡相應(yīng)改變，發(fā)動一系列損害效應(yīng)［6]。本實驗顯示，給予急性束縛性應(yīng)激時，大腦皮質(zhì)組織中Bcl-2mRNA表達(dá)明顯降低，而Bax的mRNA和蛋白表達(dá)明顯增高，Bcl-2蛋白表達(dá)有一定降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，也間接地佐證了急性應(yīng)激對Bcl-2/bax的調(diào)節(jié)作用，表明在急性應(yīng)激情況下細(xì)胞Bcl-2/Bax平衡發(fā)生改變，啟動腦損傷作用。但本實驗為短期急性實驗，因此缺少神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)、損傷和凋亡的觀察，仍有待進(jìn)一步深入研究。

應(yīng)激同時會觸發(fā)炎癥反應(yīng)，大量文獻(xiàn)表明應(yīng)激會使大腦皮質(zhì)中的炎癥因子表達(dá)發(fā)生改變。其中有研究表明炎癥因子TNF-α和IL-6的增加使應(yīng)激所致的病理生理改變的重要因素。本實驗同時研究的大鼠皮質(zhì)的炎癥因子TNF-α和IL-6的改變，實驗發(fā)現(xiàn)急性應(yīng)激會使這兩種炎性因子表達(dá)上升，這也佐證了炎癥因子在應(yīng)激反應(yīng)中的重要性［4]。

參麥注射液有效成分為麥冬皂苷、人參皂苷、麥冬黃酮、麥冬多糖和人參多糖等。人參大補元氣，麥冬養(yǎng)陰，五臟六腑皆賴其充養(yǎng)［13]。現(xiàn)代快步伐的生活狀態(tài)，導(dǎo)致心悸氣短，神疲頭暈，失眠多夢等氣陰兩虛的狀態(tài)，而參麥就有益氣養(yǎng)陰的作用［14]。參附注射液是以溫陽救逆為主，以及丹紅注重于活血化瘀，均與本病不符，故而采用參麥注射液［14]。實驗研究同時顯示，參麥注射液可發(fā)揮多種多樣的生物學(xué)功能，特別是在神經(jīng)保護方面，能有效減輕腦水腫、調(diào)節(jié)興奮性氨基酸遞質(zhì)的釋放、抑制細(xì)胞凋亡、清除自由基［13，15]。 有實驗研究發(fā)現(xiàn)給予腹腔注射參麥注射液15 mg/kg可以起到積極有效的腦保護作用［3，8]。本實驗給予參麥注射液15 mg/kg預(yù)處理后再行急性束縛性應(yīng)激，發(fā)現(xiàn)大鼠大腦皮質(zhì)組織Bcl-2/Bax和炎癥因子TNF-α和IL-6的表達(dá)基本保持平衡，與正常對照組大鼠相一致；而未予以急性束縛性應(yīng)激的大鼠，在單純給予參麥注射液后大腦皮質(zhì)Bcl-2/Bax和炎癥因子TNF-α和IL-6表達(dá)也基本與正常對照組保持一致，這就排除了參麥注射液本身對Bcl-2/Bax和炎癥因子TNF-α和IL-6表達(dá)影響的干擾，同時表明正常機體狀態(tài)下給予參麥注射液對Bcl-2/Bax和炎癥因子TNF-α和IL-6無影響。

參考大量關(guān)于急性束縛性應(yīng)激的實驗研究，目前沒有明確有效的藥物對這類急性應(yīng)激有效。因此本實驗沒有設(shè)立陽性藥物對照組，這使實驗存在略微不足，但對最終的結(jié)果影響不大。后續(xù)研究會進(jìn)一步多角度地研究參麥注射液在急性應(yīng)激的作用。

綜上所述，急性束縛性應(yīng)激可使大鼠大腦皮質(zhì)Bcl-2mRNA表達(dá)明顯下降，BaxmRNA和蛋白表達(dá)明顯增高，炎癥因子TNF-α和IL-6表達(dá)的增加，從而產(chǎn)生腦損害作用。參麥注射液預(yù)處理可通過維持大腦皮質(zhì)Bcl-2/Bax和炎癥因子TNF-α和IL-6的平衡來實現(xiàn)對急性束縛性應(yīng)激大鼠的腦保護效應(yīng)，這為臨床上預(yù)防性使用參麥注射液提供了理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

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