撲草凈在文蛤體內(nèi)的生物富集與消除規(guī)律研究

張 望，范廣宇，陳秀開(kāi)

( 連云港出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇 連云港 222042 )

撲草凈是我國(guó)使用較為廣泛的除草劑品種，因其穩(wěn)定性較高，撲草凈可通過(guò)地表徑流和滲透作用污染水體，進(jìn)入食物鏈，引起動(dòng)物和人體的免疫系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)異常[1-2]。

我國(guó)曾允許撲草凈用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。由于魚(yú)類(lèi)對(duì)撲草凈的代謝規(guī)律不明確，無(wú)法評(píng)價(jià)其食品安全性，農(nóng)業(yè)部于2010年發(fā)布1435號(hào)公告，明確將撲草凈列入《獸藥試行標(biāo)準(zhǔn)廢止目錄》[3]，但我國(guó)尚未對(duì)水產(chǎn)品中撲草凈的殘留限量作出要求[4]。目前歐盟禁止銷(xiāo)售和使用撲草凈，美、日兩國(guó)允許將撲草凈作為除草劑使用，但未將其用于水產(chǎn)養(yǎng)殖。日本2006年起實(shí)施“食品中殘留農(nóng)業(yè)化學(xué)品肯定列表制度”，文蛤(Meretrixmeretrix)等貝類(lèi)中撲草凈限量執(zhí)行“一律標(biāo)準(zhǔn)”，即0.01 mg/kg[5]。

文蛤是我國(guó)沿海常見(jiàn)的經(jīng)濟(jì)貝類(lèi)，通常生長(zhǎng)在河流入?？诟浇募?xì)沙質(zhì)灘涂和內(nèi)灣區(qū)域，生長(zhǎng)位置相對(duì)固定[6]，受撲草凈污染的風(fēng)險(xiǎn)較大。日本厚生勞動(dòng)省分別在2012年8月[5]和2015年3月[7]通報(bào)檢出中國(guó)產(chǎn)文蛤體內(nèi)撲草凈殘留超標(biāo)，并發(fā)布命令檢查通報(bào)。目前多見(jiàn)文蛤?qū)χ亟饘俚母患?yīng)研究[8-10]，未見(jiàn)關(guān)于文蛤?qū)洳輧舻绒r(nóng)藥的富集和消退規(guī)律研究的報(bào)道。筆者在半靜態(tài)條件下研究了文蛤?qū)洳輧舻母患拖艘?guī)律，以期為文蛤的凈化暫養(yǎng)提供支撐，為貝類(lèi)安全養(yǎng)殖和海洋環(huán)境保護(hù)提供數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(QTRAP 4500，AB SCIEX，美國(guó))；超聲波清洗器(KH800-KDB，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；氮吹儀(N-EVAP，Organomation，美國(guó))；旋轉(zhuǎn)式蒸發(fā)器(R-215，BUCHI，瑞士)。乙腈(色譜純，Merck)；甲醇(色譜純，Merck)；甲苯(優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥)；氯化鈉(分析純，國(guó)藥)；無(wú)水硫酸鈉(分析純，國(guó)藥)；氨基柱(500 mg/3 mL，天津天興達(dá))。撲草凈標(biāo)準(zhǔn)品由Dr．Ehrenstorfer提供，純度>98.0%。試驗(yàn)用水為超純水。標(biāo)準(zhǔn)溶液配制方法：用甲醇將定量稱(chēng)取的撲草凈標(biāo)準(zhǔn)品溶解并定容至100 mg/L，使用時(shí)根據(jù)所需用量用乙腈進(jìn)行稀釋。

1.2 富集和消除試驗(yàn)

試驗(yàn)用文蛤取自江蘇省連云港市贛榆區(qū)海岸潮間帶，殼長(zhǎng)2.5～3.0 cm。試驗(yàn)前在試驗(yàn)條件下暫養(yǎng)7 d，日換水1次，定時(shí)投喂螺旋藻(哈爾濱市潔寶水族用品有限公司)1次。試驗(yàn)容器為800 mm×600 mm×230 mm的長(zhǎng)方形塑料水槽。試驗(yàn)用水為深井水自配海水，鹽度23，pH 7.8～8.0[11]，連續(xù)充氧、加溫，保持水溫為(12±1) ℃，水中溶解氧>5.0 mg/L。經(jīng)檢測(cè)，試驗(yàn)用文蛤、螺旋藻和試驗(yàn)用水均不含撲草凈。

選擇活力良好的健康個(gè)體進(jìn)行試驗(yàn)，隨機(jī)分為7組，每組約400枚文蛤，設(shè)1、10、100 μg/L 3個(gè)質(zhì)量濃度組和1個(gè)空白對(duì)照組。每個(gè)質(zhì)量濃度組在相同的試驗(yàn)條件下設(shè)置2個(gè)重復(fù)組，將2組測(cè)定的平均值作為最終結(jié)果。富集和消除試驗(yàn)在半靜態(tài)條件下進(jìn)行，日換藥液1次，同時(shí)投喂螺旋藻。富集試驗(yàn)開(kāi)始后分別于暴露后24 h(1 d)、48 h(2 d)、96 h(4 d)、144 h(6 d)、240 h(10 d)、336 h(14 d)、432 h(18 d)、528 h(22 d)、624 h(26 d)采樣，每次采樣隨機(jī)從各組取出18枚文蛤，分別放入標(biāo)記清楚的自封口塑料袋中密封，-18 ℃冷凍保存。富集試驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行消除試驗(yàn)，每12 h將所有試驗(yàn)容器內(nèi)的水換成清潔自配海水，分別在試驗(yàn)開(kāi)始后的第24 h(1 d)、48 h(2 d)、96 h(4 d)、192 h(8 d)、336 h(14 d)、432 h(18 d)、和528 h(22 d)進(jìn)行采樣。投喂、采樣方法同富集試驗(yàn)。試驗(yàn)過(guò)程中及時(shí)撈出死亡的文蛤。

1.3 撲草凈含量的測(cè)定

用濾紙將所取文蛤殼表面擦干，剖開(kāi)取出所有可食部分，用均質(zhì)機(jī)制成勻漿，稱(chēng)取勻漿后的樣品5.00 g于50 mL塑料離心管中。樣品預(yù)處理和儀器測(cè)定條件均參照文獻(xiàn)[12]的方法進(jìn)行，檢出限為1.0 μg/kg。

1.4 數(shù)據(jù)處理方法

每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的測(cè)定值取重復(fù)組的平均值。

富集系數(shù)即生物體內(nèi)污染物的質(zhì)量濃度與其生存環(huán)境中該污染物質(zhì)量濃度的比值，用公式表示為：

BCF=Ct/C0

式中，BCF為富集系數(shù)，Ct表示文蛤體內(nèi)撲草凈含量(μg/kg)，C0表示試驗(yàn)水體中撲草凈含量(μg/kg)。

消除速率是污染物在單位時(shí)間內(nèi)從生物體內(nèi)的從體內(nèi)的消除量，公式表示為：

v=Δc/Δt

式中，v為消除速率[μg/(kg·d)]，Δt表示消除試驗(yàn)所用的時(shí)間(d)，Δc表示消除試驗(yàn)所用時(shí)間內(nèi)，文蛤體內(nèi)撲草凈的消除量(μg/kg)。

采用PKSolver 2.0藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算程序，在計(jì)算機(jī)上處理文蛤的撲草凈含量—時(shí)間數(shù)據(jù)，計(jì)算出有關(guān)藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 文蛤?qū)Σ煌|(zhì)量濃度撲草凈的富集規(guī)律

分別做1、10、100 μg/L 3個(gè)暴露質(zhì)量濃度下文蛤體內(nèi)撲草凈含量隨時(shí)間變化的富集含量—時(shí)間圖(圖1)。撲草凈在文蛤體內(nèi)的富集含量呈先增后降的趨勢(shì)，而后分別在不同水平(17.5、70.2、391.5 μg/kg)波動(dòng)。富集含量達(dá)到最大值所需時(shí)間分別為10、14 d和18 d，最大含量分別為22.9、82.6、431.1 μg/kg，分別為水體中撲草凈質(zhì)量濃度的22.9倍、8.3倍和4.3倍。富集試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，在1、10、100 μg/L暴露質(zhì)量濃度下的文蛤體內(nèi)撲草凈含量分別為18.0、69.3、395.9 μg/kg，分別為暴露質(zhì)量濃度的18.0倍、7.0倍和4.0倍。

圖1 不同暴露質(zhì)量濃度下文蛤體內(nèi)撲草凈含量—時(shí)間曲線

以撲草凈暴露質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，文蛤體內(nèi)撲草凈的含量為縱坐標(biāo)，分別對(duì)24、48、96、144、240、336、432、528、624 h的暴露質(zhì)量濃度—富集含量關(guān)系做線性回歸分析(表1)。對(duì)回歸方程進(jìn)行t檢驗(yàn)，相關(guān)系數(shù)r2均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。在相同的暴露時(shí)間，文蛤體內(nèi)撲草凈的含量隨著暴露質(zhì)量濃度的增加逐漸增加，二者呈顯著的正相關(guān)關(guān)系。

在1、10、100 μg/L 3個(gè)暴露質(zhì)量濃度下，文蛤?qū)洳輧舻母患禂?shù)變化趨勢(shì)相同，表現(xiàn)為先升后降，至某一水平維持波動(dòng)狀態(tài)(圖2)。文蛤?qū)洳輧舻母患禂?shù)最高值分別達(dá)22.9、8.3和4.3。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)文蛤?qū)洳輧舻母患禂?shù)均隨暴露質(zhì)量濃度的升高而下降，表明隨著暴露質(zhì)量濃度的升高，文蛤?qū)洳輧舻母患手鸩较陆怠?/p>

表1 暴露質(zhì)量濃度—富集含量關(guān)系線性回歸

圖2 文蛤暴露在不同質(zhì)量濃度的撲草凈中的富集系數(shù)—時(shí)間曲線

2.2 文蛤?qū)洳輧舻南?guī)律

在22 d的消除試驗(yàn)過(guò)程中，1、10、100 μg/L 3個(gè)試驗(yàn)組文蛤體內(nèi)撲草凈含量均明顯下降(圖3)。在消除試驗(yàn)第4 d，撲草凈含量均降至消除試驗(yàn)開(kāi)始前的50%以上；在消除試驗(yàn)第22 d，1、10、100 μg/L 3個(gè)試驗(yàn)組文蛤體內(nèi)撲草凈含量分別降至1.6、2.9、10.4 μg/kg，分別為消除試驗(yàn)開(kāi)始時(shí)的8.7%、5.6%和2.6%。1、10、100 μg/L 3個(gè)試驗(yàn)組文蛤?qū)洳輧舻钠骄怂俾史謩e為0.745、2.973、17.522 μg/(kg·d)。消退速率隨著暴露質(zhì)量濃度的升高而升高。結(jié)果說(shuō)明，脫離暴露環(huán)境一定時(shí)間可降低文蛤體內(nèi)撲草凈的含量。

圖3 文蛤體內(nèi)撲草凈含量隨時(shí)間的消除變化曲線

2.3 富集動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定結(jié)果

采用PKSolver 2.0藥物代謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)計(jì)算程序，處理曝污后文蛤體內(nèi)的撲草凈含量—時(shí)間數(shù)據(jù)，計(jì)算有關(guān)撲草凈在文蛤體內(nèi)的動(dòng)力學(xué)參數(shù)(表2)。

表2 文蛤?qū)洳輧舻乃幬锎x動(dòng)力學(xué)參數(shù)

注：t1/2β：藥物的消除半衰期(h)；Tlag：時(shí)滯(h)；AUC：藥時(shí)曲線下面積[μg/(L·h)]；Cmax：富集達(dá)到平衡后，體內(nèi)氨基脲含量(μg/kg)；Tmax：富集達(dá)到平衡的時(shí)間(h)；CL/F：總體清除率[L/(h·kg)].

2.4 藥時(shí)曲線下面積

藥時(shí)曲線下面積是指生物體內(nèi)藥物濃度曲線對(duì)時(shí)間軸所包圍的面積，反映藥物進(jìn)入體循環(huán)的相對(duì)量，代表藥物被生物體吸收利用的程度。在1、10、100 μg/L暴露質(zhì)量濃度下，文蛤藥時(shí)曲線下面積依次為13093.366 μg/(L·h)(1 μg/L)< 49937.208 μg/(L·h)(10 μg/L)< 262958.232 μg/(L·h)(100 μg/L)。說(shuō)明不同的暴露質(zhì)量濃度下，文蛤?qū)洳輧舻母患芰τ休^大差別。

2.5 藥物消除半衰期

藥物消除半衰期是指藥物質(zhì)量濃度下降一半所需要的時(shí)間。其長(zhǎng)短可反映生物體內(nèi)的藥物消除速度。在1、10、100 μg/L暴露質(zhì)量濃度下，文蛤的藥物消除半衰期依次為220.241 h(1 μg/L)>128.065 h(10 μg/L)> 108.780 h(100 μg/L)。說(shuō)明文蛤體內(nèi)撲草凈含量越高，消除速率越快。

3 討 論

3.1 文蛤?qū)洳輧舻母患?/h3>

在本試驗(yàn)中，隨著暴露質(zhì)量濃度的增加，文蛤?qū)洳輧舻母患禂?shù)降低，說(shuō)明在低暴露質(zhì)量濃度的情況下，文蛤?qū)洳輧舻母患饔酶鼜?qiáng)。這種富集系數(shù)隨暴露質(zhì)量濃度增加而減小的現(xiàn)象與文蛤[8-10]和魁蚶(Scapharcabroughtonii)[13]對(duì)重金屬銅和鉛、汞、砷富集規(guī)律，以及仿刺參(Apostichopusjaponicus)[14]和菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)[15]對(duì)撲草凈的富集規(guī)律研究結(jié)論類(lèi)似。生物體對(duì)污染物的吸收主要取決于生物體體內(nèi)脂肪與水體中有機(jī)物的分配[16]。在脂溶相分配平衡過(guò)程中，高暴露質(zhì)量濃度組文蛤體內(nèi)撲草凈質(zhì)量濃度相對(duì)增加較快，體內(nèi)脂肪與撲草凈結(jié)合更易達(dá)到飽和，導(dǎo)致隨著撲草凈暴露質(zhì)量濃度的增加，文蛤?qū)洳輧舻母患禂?shù)逐漸減小。

在暴露質(zhì)量濃度為1 μg/L和10 μg/L情況下，文蛤?qū)洳輧舻淖畲蟾患禂?shù)分別為22.9和8.3，而仿刺參和菲律賓蛤仔對(duì)相同質(zhì)量濃度撲草凈的最大富集系數(shù)分別為4.70和4.38、40.3和9.54。從文蛤?qū)洳輧舾患臅r(shí)間效應(yīng)來(lái)看，各暴露質(zhì)量濃度下，隨著暴露時(shí)間的增加，文蛤體內(nèi)的撲草凈含量升高至最大值后出現(xiàn)下降，而后富集速率和分解代謝速率維持在一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡中，撲草凈含量保持微小波動(dòng)。在暴露質(zhì)量濃度為1 μg/L和10 μg/L的情況下，文蛤?qū)洳輧舻母患窟_(dá)到最大值所需時(shí)間分別為10 d和14 d，而田秀慧等[14-15]的研究表明，仿刺參和菲律賓蛤仔對(duì)撲草凈的富集含量達(dá)到最大值所需時(shí)間僅為1～3 d。這種差異說(shuō)明，不同品種的水生動(dòng)物對(duì)撲草凈的富集能力可能存在較大差異。不同品種水生動(dòng)物的生理機(jī)能、體脂含量與組成、代謝轉(zhuǎn)化機(jī)制和效率等方面的差異，是導(dǎo)致富集能力差異的重要原因[17]。在適宜貝類(lèi)生存的溫度范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，貝類(lèi)的濾水率和攝食率以冪函數(shù)的形式升高[18-19]，從而影響富集速率。本試驗(yàn)的水溫為(12±1) ℃，低于菲律賓蛤仔(20±1) ℃的試驗(yàn)水溫[15]，可能也是富集速率差異較大的原因之一。

3.2 文蛤?qū)洳輧舻南?/h3>

在22 d的消除試驗(yàn)過(guò)程中，各試驗(yàn)組的文蛤體內(nèi)撲草凈含量下降趨勢(shì)逐漸趨緩，說(shuō)明隨著體內(nèi)撲草凈殘留量的減少，文蛤?qū)洳輧舻拇x效率也逐漸下降。消除試驗(yàn)第4 d，各試驗(yàn)組的文蛤體內(nèi)撲草凈含量均降至消除試驗(yàn)開(kāi)始前的50%以上。而對(duì)菲律賓蛤仔中撲草凈殘留的消除規(guī)律研究發(fā)現(xiàn)，消除試驗(yàn)開(kāi)始后1 d，撲草凈含量約降90%[15]。這種差異說(shuō)明文蛤和菲律賓蛤仔對(duì)撲草凈的代謝能力可能存在較大差異。通常水溫每升高1 ℃，水生動(dòng)物的藥物代謝和消除速率提高10%[20-21]。本試驗(yàn)的水溫為(12±1) ℃，低于菲律賓蛤仔(20±1) ℃的試驗(yàn)水溫[15]，可能也是消除速率差異較大的原因之一。

目前國(guó)內(nèi)對(duì)水產(chǎn)品中撲草凈殘留無(wú)限量要求。日本實(shí)施肯定列表制度，文蛤等貝類(lèi)中撲草凈含量適用于0.01 mg/kg的“一律標(biāo)準(zhǔn)”。對(duì)萊州灣海域表層海水中三嗪類(lèi)除草劑殘留的調(diào)查結(jié)果顯示，該區(qū)域海水中撲草凈質(zhì)量濃度最高達(dá)21.2 ng/L[22]。本課題組在豐水期和枯水期分別對(duì)連云港、南通沿海部分潮間帶海水，以及相關(guān)入海口上游淡水調(diào)查結(jié)果顯示，撲草凈含量均低于100 ng/L。推斷上述海域生長(zhǎng)的文蛤體內(nèi)撲草凈殘留量應(yīng)小于22.904 μg/kg。通常情況下，采捕上岸的文蛤在上市前僅做簡(jiǎn)單清洗，未進(jìn)行一定時(shí)間暫養(yǎng)。根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果推測(cè)，文蛤采捕后，在12 ℃以上的清潔海水中暫養(yǎng)4 d以上，可控制撲草凈殘留超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)。

4 結(jié) 論

試驗(yàn)結(jié)果表明，在1、10、100 μg/L的撲草凈暴露質(zhì)量濃度下，文蛤分別于暴露后10、14、18 d達(dá)到對(duì)撲草凈的最大富集含量，分別為22.9、82.6、431.1 μg/kg。隨著暴露時(shí)間的增加，文蛤體內(nèi)撲草凈含量變化趨勢(shì)為先升后降，而后維持在某一水平波動(dòng)。文蛤?qū)洳輧舻母患禂?shù)隨暴露質(zhì)量濃度的增加而減小。消除試驗(yàn)過(guò)程中，文蛤體內(nèi)撲草凈含量均明顯下降。消除試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，各試驗(yàn)組的文蛤體內(nèi)仍有撲草凈檢出。可見(jiàn)文蛤?qū)洳輧舻母患拖芰^強(qiáng)，但短時(shí)間內(nèi)難以徹底消除。

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