原代腸系膜動脈平滑肌細胞的分離培養(yǎng)

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(南華大學藥物藥理研究所血管生物學實驗室，湖南 衡陽 421001)

動脈平滑肌細胞(ASMC)在不同的動脈或相同血管床的不同部位以及血管壁的不同層次等存在表型異質性。細胞表型異質性表現為細胞形態(tài)學表型差異、平滑肌細胞特異性蛋白的表達差別和不同的生長能力。與骨骼肌和心肌細胞不同，ASMC在分化終末時仍保持高度的可塑性，并能從收縮表型向增殖、分泌的表型轉變[1]，而后者主要導致血管增長和重構，是血管適應動脈粥樣硬化、高血壓時病理生理刺激的基本要素[2]。當血管生長在原代血清培養(yǎng)條件時血管肌細胞發(fā)生相似的表型調節(jié)。因此原代培養(yǎng)的動脈平滑肌細胞能為更大范圍的在細胞和亞細胞水平為研究細胞反應機理提供有效的模型。已有相關研究對腸系膜動脈平滑肌細胞進行分離培養(yǎng)，如用組織塊培養(yǎng)法[3](但分離純化時間較長)，胰蛋白酶消化法[4]或多種酶消化法[5]，本研究采用Ⅰ型膠原酶消化分離腸系膜小動脈平滑肌細胞，為阻力血管相關疾病的研究提供可靠且充裕的細胞來源。

1 材料與方法

1.1試驗動物SPF級雄性Sprague Dawley(SD) 大鼠，體重110～150 g，由南華大學實驗動物學部提供。人主動脈血管平滑肌細胞株(AVSMC)購買于ATCC。

1.2主要試劑DMEM高糖培養(yǎng)基，胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)均為Hyclone、I型膠原酶粉末購自sigma公司；青-鏈霉素(雙抗) 購自碧云天生物技術公司；α-肌動蛋白單克隆抗體(α-actin) 抗體購自Abcam公司；胰蛋白酶購自美國Sigma公司；DAB顯色試劑盒購康購自世紀生物制劑有限公司；MTT試劑購自北京索萊寶；PCNA購自Abcam公司。

1.3主要儀器熒光倒置顯微鏡(日本Olympus)，CO2細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，酶標儀檢測儀(德國Beckman公司)，高性能超凈工作臺(蘇凈基團泰安公司)，5810R低溫高速離心機(德國Eppendorf )，eclipse e100顯微鏡(日本Nikon)。

1.4原代細胞培養(yǎng)取健康SD大鼠(180～220 g)，配制10%水合氯醛溶液，按照100 g注射0.3 mL的水合氯醛麻醉。剃毛、祛皮、處死老鼠(頸動脈放血)。碘酒、酒精消毒解剖板，將大鼠固定在解剖板上(四肢及頭部)，先用碘酒擦拭大鼠，再用酒精擦拭，至碘酒顏色呈淡黃色;無菌操作下，用解剖鑷開腔，迅速分離腸道組織，仔細剝離出次級腸系膜動脈，將其轉移至無菌操作臺中，更換器械，置于裝有D-Hanks的培養(yǎng)皿中，將動脈外模纖維結締組織用眼科鑷輕輕剝離干凈。充分漂洗之后，取出放入盛有正常培養(yǎng)基(為含有20% FBS的DMEM培基，雙抗與培基的比例為1∶100)的剝離培養(yǎng)皿中;用眼科剪沿動脈長軸向剪開腸系膜動脈，平鋪使內膜朝上，沿著內膜用棉簽來回輕刮數遍并漂洗。 然后將血管反復剪成碎小組織塊，最后將碎塊移入預先盛有含0.1%的I型膠原酶的離心管中(酶的體積為組織塊體積的10～15倍)；將此離心管置于CO2培養(yǎng)箱中，每15～20 min輕微搖動一次，密切觀察其消化狀態(tài)，待動脈碎塊消化成透明絮狀物時(消化時間大約需2～3 h)，1 000 rpm離心5 min，棄上清液； 向其加入5 mL含有20%FBS的DMEM培基，充分吹打混勻后轉移入25 cm2的培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)3天后開始觀察，6天后可見細胞呈梭形，并呈“谷-峰狀”，9天后MASMC長滿瓶底的90%，即可行傳代培養(yǎng)。

1.5傳代培養(yǎng)當細胞生長至培養(yǎng)瓶80%～90%左右融合時，往培養(yǎng)瓶內加入0．25%胰蛋白酶1 mL消化細胞，顯微鏡下觀察細胞，待細胞發(fā)生皺縮變圓，細胞間隙增大時，棄掉胰酶消化液，停止消化，消化時間大約為2～3 min，再加入5 mL含20%胎牛血清的DMEM培基，多次反復輕柔吹打培養(yǎng)瓶壁，顯微鏡觀察貼壁細胞的漂浮情況，將適宜密度的細胞懸液分置于1～2個培養(yǎng)瓶，加適量20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。細胞傳代至第3～11代時可用于細胞實驗。

1.6培養(yǎng)細胞的鑒定應用倒置相差顯微鏡觀察細胞大小、形態(tài)及生長特點。進一步用α-actin免疫組化染色鑒定:將第4代細胞接種于6孔板細胞爬片，培養(yǎng)12 h后，待細胞60%融合時；PBS漂洗3遍后，用10%的多聚甲醛固定細胞30 min，按照康為世紀兔Streptavidin-HRP試劑盒(DAB)說明書進行操作，用Anti-alpha smooth muscle Actin抗體定性檢測α-actin。

1.7增殖檢測以第3-4代MASMC為研究對象，并與人主動脈血管平滑肌細胞株(AVSMC)作對照；MTT法測定細胞活力，Western blot法測定PCNA蛋白表達，比較兩種來源細胞的增殖活力。

2 結 果

2.1 MASMC的生長情況消化分離的原代MASMC呈圓形，懸浮在DMEM培養(yǎng)液中，于培養(yǎng)后2天呈分散狀貼壁生長；培養(yǎng)至第三代后顯微鏡下觀察貼壁的原代MASMC生長旺盛(圖1)，細胞形狀大致一致，成梭型，胞質伸展，聚集成團狀生長，平滑肌細胞特有的“峰-谷”狀明顯；酶消化后原代MASMC生長快速，基本融合成單層，成叢的緊密排列鏡下透明度及遮光性強。

2.2第4代大鼠MASMC與人AVSMC免疫組化染色比較單層細胞爬片中觀察到大鼠原代MASMC胞漿內肌動蛋白表達較人AVSMC更為明顯，而細胞形態(tài)較人AVSMC更為不規(guī)則，可能是MASMC在傳代過程中表型轉變所至，MASMC處于相對人AVSMC細胞系更為不穩(wěn)定的狀態(tài)，隨著傳代的次數增多，MASMC的表型從收縮型向分泌型轉變，肌動蛋白表達相對較少，形態(tài)表現趨于穩(wěn)定。見圖2。

2.3兩種平滑肌細胞的AngⅡ促增殖比較人AVSMC作為制備成熟的細胞系，具有生長穩(wěn)定、增殖迅速的特點；而大鼠MASMC作為原代細胞在傳至10代的過程中仍然處于表型轉變中，其增殖速度隨傳代次數遞增，但仍需在較高血清濃度的培養(yǎng)基中才能穩(wěn)定生長，增殖速度相對緩慢。見圖3、圖4。

3 討 論

血管平滑肌細胞從分離的腸系膜動脈遷移到動脈外周并生長至密度達到60%需要7～10天，繼續(xù)生長達到飽和密度另需7天。開始傳代后1～2天，腸系膜動脈平滑肌細胞從最初呈現的月牙形逐漸向不穩(wěn)定的形態(tài)學轉變。酶消化的平滑肌細胞中起初含有少量內皮細胞，隨著傳至2～3代后消失。腸系膜動脈平滑肌細胞在接種之后較主動脈平滑肌細胞需要更長的周期達到較高密度，在多次傳代中腸系膜動脈平滑肌細胞較主動脈平滑肌細胞表現顯著緩慢的生長速度。經過數代純化后分離的腸系膜細胞呈現典型的“峰-谷”狀生長，且a-Actin抗體免疫組化鑒定人主動脈平滑肌細胞系和大鼠原代腸系膜動脈平滑肌細胞90%以上呈陽性。

圖1 大鼠原代MASMC第三代形態(tài)為梭形或長梭形,細胞呈放射狀或旋渦狀排列，呈現典型的“峰-谷”狀生長A： 40× B：100× C：200× D：400×

圖3 MTT檢測AngⅡ對大鼠MASMC和人AVSMC的增殖影響比較與control組比較*P<0.05，##P<0.01

圖4 AngⅡ對大鼠MASMC和人AVSMC的PCNA蛋白表達比較與control組比較，*P<0.05，##P<0.01

用10%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人主動脈平滑肌細胞在傳代24 h后，生長至95%左右相當于4×105cell/mL；而用20%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)大鼠原代腸系膜動脈平滑肌細胞在傳代72 h后生長至95%左右相當于5×104cell/mL。人主動脈平滑肌細胞系較大鼠原代腸系膜動脈平滑肌細胞增長迅速。在血管緊張素Ⅱ處理24 h后，MTT分析法顯示人主動脈平滑肌細胞系仍較大鼠原代腸系膜動脈平滑肌細胞增長迅速，WB定量測定PCNA表達也得到相似的結果。

本研究描述了有效可靠的分離培養(yǎng)大鼠腸系膜次級小動脈的方法。已有文獻報道用膠原蛋白酶Ⅱ型或Ⅲ型與彈性蛋白酶合用消化血管組織分離腸系膜動脈平滑肌細胞[5-6]。本實驗研究只使用了膠原蛋白酶Ⅰ型，較復合酶消化法更為經濟、方便。因此，通過本研究，發(fā)現單一膠原酶消化法具有操作簡單、分離過程短、細胞存活率高等多種優(yōu)點。鑒于以上結果，本實驗研究成功建立了I型膠原酶消化法來培養(yǎng)大鼠原代腸系膜動脈平滑肌細胞的方法。

大鼠原代腸系膜動脈平滑肌細胞在低密度時呈多角形，個體較大，且肌質網明顯。短期原代培養(yǎng)的該細胞保留正常腸系膜動脈平滑肌細胞的生理學活性，可用于相關生理研究。在血清中培養(yǎng)的細胞仍經歷了表型的轉變，以至于進一步改變細胞的離子通道、轉運體、膜受體和收縮蛋白的正常功能，最終導致該分化型細胞至關重要的特性丟失，比如收縮性。

盡管如此，該細胞的培養(yǎng)為研究動脈平滑肌細胞增殖的機制提供了很好的模型。

血管平滑肌細胞都具有共同的特征，比如肌動蛋白、肌球蛋白的表達。而生長特征，細胞增殖模式提示兩種平滑肌細胞的本質差異。電鏡顯示平滑肌細胞是血管中膜唯一的細胞類型，其具有既收縮又舒張且含代償作用的雙重功能，為同時滿足這些功能，血管平滑肌細胞保持不同程度的細胞外基質合成和細胞分裂的間質性基礎，從多能性狀態(tài)向特定功能狀態(tài)分化轉變。所以，不同平滑肌細胞表達的表型和形態(tài)上差異很大。組胚學上來看，主動脈和腸系膜平滑肌細胞都是從間葉細胞發(fā)育而來的[7]。但是在血管中存在著廣泛的功能異質性，主動脈作為具有彈性的非特異功能性導管輸送血液，而肌性小動脈比如腸系膜動脈在血壓調節(jié)中發(fā)揮十分重要的作用。為發(fā)揮特異的血壓調節(jié)作用，腸系膜動脈平滑肌細胞演化成收縮性表型。在體內時大多數平滑肌細胞表現為收縮性表型，而轉換后的相對表型通常作為體外細胞培養(yǎng)的主要形式。

在兩種平滑肌細胞中觀察到的表型異質性是怎樣形成的？可能是：(1)分化程度較少的平滑肌細胞特殊亞群在整個細胞階段持續(xù)分化；(2)區(qū)域特異性的平滑肌細胞表型異質性是已分化細胞暫時可逆的調節(jié)變化。特定區(qū)域的平滑肌細胞表型異質性與血管斑塊形成、器官灌注的血管調節(jié)是怎樣聯系的？在高血壓中小動脈平滑肌細胞表現為增生而不是肥大；大血管平滑肌細胞表現為肥大而不是增生[8]。動脈粥樣硬化斑塊更多的觀察發(fā)生在大動脈中而不是小動脈。這種表型異質性對平滑肌細胞在血管高壓，動脈粥樣硬化形成和器官灌流的血管功能中起著重要的作用。小動脈水平的血流調節(jié)與容量性血管的不同，在冠狀動脈分支中，小于100 μm的動脈直徑和心外膜大血管以區(qū)域特異性的促進器官灌注和對血管活性物質響應。

大血管對血管活性物質如AngⅡ的做出響應時并不是起被動的導管功能而是積極的血管調節(jié)功能，尤其是大血管中血管壁中腎素-血管緊張素的局部存在，AngⅡ調節(jié)血管功能可能是獨立于血液循環(huán)之外，用血管緊張素轉化酶抑制劑阻滯AngⅡ的生成促進了大血管的順應性。在小血管中，由內皮源性超極化因子介導的，Ach引起的內皮依賴性超極化在SHR患者的腸系膜動脈中減弱，內皮依賴性的舒張受損。當小動脈內皮受到剪切應激影響時，促血管新生蛋白因子-2表達受到抑制，在腸系膜微小血管新生過程中ANG2相關蛋白增加[9]。

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(本文編輯：蔣湘蓮)