氯化兩面針堿腸吸收研究

趙 森姜 黎慕楊娜 鄒 明*

（1大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院藥劑科，遼寧 大連 116001；2遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理教研室，遼寧 沈陽 110032）

兩面針?biāo)幬缎?、苦、微溫，小毒，具有祛風(fēng)通絡(luò)、勝濕止痛、消腫解毒等作用。主要成分為生物堿，氯化兩面針堿為兩面針的主要成分，測定不同含量的兩面針提取物在大鼠小腸的吸收情況，采用紫外分光光度法測定腸循環(huán)液中酚紅的含量，標(biāo)定體積，采用高效液相色譜法測定氯化兩面針堿的含量。目前對兩面針的藥動學(xué)研究較少，本實驗在體法預(yù)測氯化兩面針堿的吸收情況。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥 LC6A高效液相色譜儀 （日本島津）；Agilent色譜工作站 （美國）；HH-S11-Z型電恒溫水浴鍋（北京長安科學(xué)儀器廠）；電子天平 （Sartorius，德國）；SHB-3循環(huán)水多用真空泵 （鄭州杜甫儀器廠）；T101-100型蠕動泵 (保定蘭格恒流泵有限公司)；氯化兩面針堿對照品 (上海純優(yōu)科技有限公司，批號：6872-57-7)；酚紅 (上海試劑三廠)；烏拉坦溶液 （自制）；Kerbs-Ringer營養(yǎng)液 （以下簡稱K-R營養(yǎng)液，自制）[1]。

1.2 實驗動物 雌雄Wistar大鼠40只，雌雄各半 （大連醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心）；合格證號SCXK（遼）2008-0002]。

1.3 樣品溶液的測定方法

1.3.1 在體吸收的實驗原理 被動擴(kuò)散是消化吸收的最重要途徑，用Fink方程式可以描述這一過程，方程變換后inX=inX0-式中的X0為初始藥物量；X為吸收后藥物量；t為吸收時間；以時間t對inX作圖應(yīng)為一條直線，斜率Kα為藥物在小腸吸收的速率。

1.3.2 循環(huán)液中酚紅的測定方法

1.3.2.1 空白循環(huán)液 （以下簡稱K-R營養(yǎng)液） 稱取氯化鈉7.8 g，氯化鉀0.35 g，氯化鈣0.37 g，氯化鎂0.02 g，碳酸氫鈉1.37 g，磷酸二氫鈉0.32 g，葡萄糖1.4 g，加純化水溶解定容至1000 mL容量瓶中，即得。

1.3.2.2 酚紅測定波長的選擇 酚紅KR營養(yǎng)液、對照品儲備液、對照品酚紅KR營養(yǎng)液，于700～200 nm范圍掃描，結(jié)果在558 nm處KR營養(yǎng)液、氯化兩面針堿對酚紅無干擾。

1.3.2.3 酚紅測定方法 按照大鼠小腸吸收實驗方法，在腸循環(huán)液中加入定量的酚紅。

精密配制濃度為10 μg/mL、25 μg/mL、 50 μg/mL酚紅K-R營養(yǎng)液，置潔凈試管中，加入0.2 mol/L的NaOH溶液5 mL，搖勻，按紫外-可見分光光度法在558 nm波長處測定吸光度。

1.3.2.4 酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密量取酚紅儲備液適量，稀 釋 成 濃 度 為 5.0 μg/mL、 10.0 μg/mL、 25.0 μg/mL、50.0 μg/mL、 100.0 μg/mL酚紅溶液， 按酚紅測定方法操作，測定吸光度。得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：A=0.0172C+0.0212， r=0.9999。 （n=6） 酚紅在5 μg～100 μg/mL范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好。

1.3.2.5 精密度考察 取低、中、高三種濃度的酚紅儲備液，按酚紅測定方法操作，測定吸光度，RSD=0.3%，結(jié)果表明，精密度良好。

1.3.2.6 穩(wěn)定性考察 分別于0、2、4、6、8 h取樣，按酚紅測定方法操作，測定吸光度，RSD=0.3%，結(jié)果表明，穩(wěn)定性良好。

1.3.2.7 重復(fù)性考察 取同一樣品5份，按酚紅測定方法操作，測定吸光度，RSD=0.4%，結(jié)果表明，重復(fù)性良好。

1.3.2.8 加樣回收率考察 取酚紅適量 （含酚紅1 mg、2.5 mg、5 mg），分別置具塞錐形瓶中，分別加入濃度為10 μg/mL、 25 μg/mL、 50 μg/mL的酚紅溶液50 mL。平均RSD為1.1%，結(jié)果表明，方法回收率良好。

1.3.3 循環(huán)液中氯化兩面針堿HPLC測定方法

1.3.3.1 色譜條件 Diamonsil XDB-C18（150×4.6 mm，5.0 μm）； 磷酸鹽緩沖液-乙腈 (55∶45)， pH=3.5； 流速：1.0 mL·min-1；檢測波長：328 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量： 10 μL。

1.3.3.2 干擾項考察 以上述色譜條件，取K-R營養(yǎng)液、氯化兩面針堿K-R營養(yǎng)液、酚紅溶液各10 μL進(jìn)樣。

氯化兩面針堿的保留時間為12.466 min，K-R營養(yǎng)液、酚紅溶液的保留時間均在5 min以內(nèi)，通過實驗表明K-R營養(yǎng)液及酚紅中組分對氯化兩面針堿無干擾。

1.3.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密吸取濃度為9.792 μg/mL的氯化兩面針堿對照品溶液，分別進(jìn)樣5.0 μL、8.0 μL、10.0 μL、 15.0 μL、 20.0 μL， 回歸方程為y=8.5089x+90.361， r=0.9994， 表明進(jìn)樣量在0.049～0.1958 μg線性關(guān)系良好。

1.3.3.4 精密度試驗 連續(xù)進(jìn)樣5次，每次10 μL，測定其峰面積，RSD=1.4%，結(jié)果表明，試驗方法精密度良好。

1.3.3.5 穩(wěn)定性試驗 分別在0、2、4、6、8、10 h，進(jìn)樣，測定氯化兩面針堿的色譜峰面積，RSD=0.4%，結(jié)果表明，試驗方法穩(wěn)定性良好。

1.3.3.6 重復(fù)性試驗 取樣品5份，按照擬定的色譜條件，分別精密量取上述供試品溶液10 μL， 注入液相色譜儀，測定峰面積，RSD小于3，結(jié)果表明，實驗方法重復(fù)性符合有關(guān)規(guī)定。

1.3.3.7 加樣回收率試驗 按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，取已知氯化兩面針堿含量 （20.22 mg/g）的樣品適量，精密稱定，共5份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入濃度為0.2448 mg/mL的氯化兩面針堿對照品溶液4 mL，精密吸10 μL，注入液相色譜儀，計算回收率，氯化兩面針堿低、中、高濃度平均回收率為（100.81%±1.1）%、 （99.87%±1.2）%、 （101.3%±1.1）%。本方法回收率良好。

1.4 動物實驗設(shè)計 取Wistar大鼠15只，隨機(jī)分成高、中、低3個劑量組，將實驗前禁食 （自由飲水）12 h的大鼠稱重后，以0.6 mL/100g的20%的烏拉坦溶液腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后的大鼠固定在手術(shù)臺板上，保持體溫37℃，沿腹中線切開約3 cm，以直徑為0.5 cm的玻璃管做胃腸道插管，與循環(huán)泵的膠管連接組成回路，先用37℃的鹽水5 mL/min沖洗腸道，約10 min，直至腸道沖洗干凈，然后用K-R營養(yǎng)液平衡5 min，將樣品溶液200 mL連入循環(huán)裝置中，以2.0 mL/min循環(huán)3 h，自實驗開始后0 min、 15 min、 30 min、 60 min、 90 min、120 min、150 min、180 min分別取回流液1 mL，并補(bǔ)充等量的酚紅儲備液，以酚紅標(biāo)定體積，測定濃度分別為3.31 μg/mL、 6.62 μg/mL、 33.11 μg/mL氯化兩面針堿的吸收率。

2 結(jié)果

將大鼠隨機(jī)分成3組，按照實驗方法，定時取樣并測定，計算各時間點的剩余藥量X，以剩余藥量對數(shù)和時間作圖，利用公式inX=inX0Kα·t計算出Ka，吸收半衰期T1/2，結(jié)果見表1～3。

表1 氯化兩面針堿在大鼠小腸剩余藥量-時間

表2 氯化兩面針堿在體小腸吸收的藥代動力學(xué)參數(shù)

表3 低、中、高濃度氯化兩面針堿吸收百分率 （x±sD，n=5）

在大鼠小腸吸收百分率經(jīng)t檢驗分析 (P＞0.05)，無顯著差別，高、中、低、三種濃度的吸收百分率基本相似，吸收百分率與藥物濃度無關(guān)，結(jié)果表明氯化兩面針堿在3.31～33.11 μg/mL濃度范圍內(nèi)吸收為被動擴(kuò)散。

3 討論

在堿性溶液中，酚紅的最大吸收為558 nm，而不是550 nm，離子型酚紅被認(rèn)為在小腸中無吸收，但有文獻(xiàn)報道酚紅在大鼠小腸段也有吸收[10]，在實驗中用酚紅標(biāo)示回流液體積變化，定容后計算回流液中的氯化兩面針堿吸收量更準(zhǔn)確，克服了標(biāo)定體積造成的誤差。

大鼠在體循環(huán)接近體內(nèi)環(huán)境，實驗設(shè)備簡便。

實驗結(jié)果可以看出，氯化兩面針堿在大鼠體內(nèi)的吸收情況與藥物濃度相關(guān)性不大，低、中、高濃度的藥物吸收百分率無顯著差別，半衰期約為0.6h，氯化兩面針堿的吸收較好，方法簡便可行，為中藥制劑的研制提供參考。

氯化兩面針堿為兩面針主要成分，兩面針在鎮(zhèn)痛方面的文獻(xiàn)被廣泛報道，本文采用大鼠在體腸吸收模型研究氯化兩面針堿在大鼠小腸的吸收為被動擴(kuò)散，實驗設(shè)備簡單，接近體內(nèi)環(huán)境，對高、中、低濃度的氯化兩面針堿吸收良好，為中藥制劑研發(fā)提供參考。

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[10]江敏，張恩娟.原兒茶醛大鼠小腸吸收機(jī)理的研究 [J].中國藥房，2003，14(9):528-530.