ATP及P2X7受體在三伏灸治療支氣管哮喘的作用機(jī)制研究※

陳 銘 康佩芝 董亞琴

（1福建衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)系，福建 福州 350101；2福建省中醫(yī)藥研究院福建省經(jīng)絡(luò)感傳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350003）

支氣管哮喘是常見的慢性疾病之一。我們前期的實(shí)驗(yàn)則表明三伏灸可通過抑制MMP-9的合成，使支氣管哮喘新西蘭兔細(xì)支氣管平滑肌厚度及細(xì)支氣管內(nèi)管壁厚度明顯變薄，從而顯著改善氣道重塑現(xiàn)象而達(dá)到治療效果[1-2]。本文通過進(jìn)一步觀察三伏灸對(duì)ATP和P2X7受體的影響，探討三伏灸治療支氣管哮喘的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭兔18只，雄性，體質(zhì)量 （2.5±0.3）kg，由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK （閩） 2012-0001。

1.1.2 試劑、藥物及儀器 卵白蛋白 (Ovalbumin，OVA)（美國Sigma公司）；氫氧化鋁 (Aluminum hydroxide，AL(OH)3) （西隴化工股份有限公司）；異氟烷 （瑞沃德公司）；甲醇 （色譜純，默克股份兩合公司），磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀 （色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司），ATP、ADP、AMP、ADO （西格瑪奧德里奇上海貿(mào)易有限公司），實(shí)驗(yàn)用水超純水；RNA提取液（武漢谷歌生物科技有限公司）；HyPure TMMolecular Biology Grade Water（HyClone公司）；RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit （Thermo公司）；FastStart U-niversal SYBR Green Master(Rox) （Roche公司）； 引物（武漢谷歌生物科技有限公司）P2RX7上游引物：5’-CCACAGTCTCAATCACCCACAA-3’，下游引物：5’-CCACACATCCTCCCCTATCC-3’，待擴(kuò)增產(chǎn)物長度191bp。GAPDH上游引物：5’-CCGCCCAGAACATCATCCCT-3’，5’-GCACTGTTGAAGTCGCAGGAGA-3’， 待擴(kuò)增產(chǎn)物長度262 bp。

ACQUITY超高效液相色譜儀 （waters公司）；SB-5200DT超聲波清洗機(jī) (寧波新芝生物科技股份有限公司)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 （鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；BP211型電子天平稱 （德國Sartorius公司）；DL-200微型掌上離心機(jī) （北京東林昌盛生物科技有限公司）；ESP-32微透析注射泵 （深圳市瑞沃德生命科技有限公司），瑞沃德呼吸系統(tǒng) （瑞沃德公司）。勻漿儀（康濤科技）；臺(tái)式高速冷凍型微量離心機(jī) （DragonLab公司）；熒光定量PCR儀 （ABI公司）；超凈工作臺(tái) （蘇凈安泰公司）；超微量分光光度計(jì) （Thermo公司）；標(biāo)準(zhǔn)試劑型純水儀 （青島富勒姆科技有限公司）。

1.2.1 動(dòng)物分組、造模及干預(yù)方法 18只新西蘭兔適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為空白組，模型組，治療組，每組6只。除空白組外，其他2組制備成哮喘模型。動(dòng)物模型制造：在第1、8天腹腔注射1 mL OVA (卵白蛋白)/AL(OH)3混合液 (含OVA 10 mg和AL(OH)3200 mg)致敏，第15天開始應(yīng)用超聲霧化器于自制簡易霧化箱中以一定濃度的OVA生理鹽水溶液霧化激發(fā)，每次20 min，隔日1次，持續(xù)30d。激發(fā)濃度分別為前15 d的1%，后15 d的1.5%。空白組在第1、8天給予生理鹽水代替OVA/AL(0H)3混合液腹腔注射，第15天開始以生理鹽水代替OVA超聲霧化吸入， 每次20 min，隔日1次，持續(xù)30 d。

治療組給予三伏天隔姜灸聯(lián)合中藥敷貼 （白芥子、細(xì)辛、甘遂、延胡索等研末，治療前1天用姜汁及凡士林調(diào)成膏狀備用），穴位選擇大椎及雙側(cè)肺俞，置以直徑約0.8 cm、厚約0.3 cm的鮮生姜片，在姜片上放置底面直徑為0.6 cm的圓錐形艾柱 (約為1 g)艾灸，3壯后分別敷貼外敷藥4 h。于致敏后第15天 （初伏）霧化前0.5 h干預(yù)，隔日1次，連續(xù)30 d。

1.3 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.3.1 腧穴ATP含量檢測(cè)

1.3.1.1 實(shí)驗(yàn)樣品收集方法及標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 接好微透析注射泵和微透析管路，選用生理鹽水為灌流液，灌流速度為2 μL/min。使用麻醉劑為異氟烷的麻醉呼吸機(jī)，以5 cc/min×5的量將兔子麻醉誘導(dǎo)，定位大椎穴和肺俞穴，用留置針穿刺皮膚并將留置針的外套管留于皮膚內(nèi)，借助外套管，將已用超純水浸泡過的線性探針的半透膜植入大椎穴和肺俞穴，將線性探針的入口端與微透析泵管路連接，出口端裝入EP管中，進(jìn)行腧穴區(qū)透析液的收集，同時(shí)將麻醉量降至5 cc/min×2.5進(jìn)行麻醉維持。前1 h的透析液不收集，1 h后，每20 min一管，共收集3管，標(biāo)記后放-80℃冰箱保存。高效液相色譜測(cè)定時(shí)，取出解凍后再放入離心機(jī)中離心2 min，用移液槍吸取3管混合打入1個(gè)進(jìn)樣瓶中進(jìn)行測(cè)定。

精密稱取ATP、ADP、AMP、ADO標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，加10 mL生理鹽水配制成1mg/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)液，然后加生理鹽水，配制成系列濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液，濃度從低到高依次為： 0.05、 0.1、 1、 10、 50、 100 μg/mL。 為減小誤差，進(jìn)行平行試驗(yàn)，每次不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液都配制兩管。

1.3.1.2 色譜條件 色譜柱： Waters ACQUITY UPLC C18色譜分析柱 (1.7 μm， 2.1×100 mm)

流動(dòng)相：C相為甲醇，D相為50 mmol/L磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀組成的磷酸鹽緩沖液 (pH=6.8)，采用梯度洗脫，0～0.85 min時(shí)，流速為0.3 mL/min，5%的C相和95%的D相；0.85～0.86 min將流速降至0.1 mL/min；0.86～4.0 min時(shí)，維持0.1 mL/min流速，5%的C相和95%的D相；4.0～4.1 min，將流速升至0.3 mL/min，C相升至20%，D相降至80%；4.1～6.0 min時(shí)，維持0.3 mL/min流速，20%的C相和80%的D相；6.0～6.1 min，將流速維持0.3 mL/min，C相降至5%，D相升至95%；平衡至10 min結(jié)束。

柱溫為25℃，檢測(cè)波長259 nm，進(jìn)樣量5 μL。

1.3.2 肺組織P2X7受體mRNA表達(dá)

1.3.2.1 總RNA的提取 取勻漿管，加入1 mL的Trizol Reagent，置冰上預(yù)冷；取100 mg肺組織，加入到勻漿管中；勻漿儀充分研磨直至無可見組織塊；12000 rpm離心10 min取上清；加入250 μL三氯甲烷，顛倒離心管15 s，充分混勻，靜置3 min；4℃下12000 rpm離心10 min；將上清轉(zhuǎn)移到一新的離心管中，加入0.8倍體積的異丙醇，顛倒混勻；-20℃放置15 min；4℃下12000 rpm離心10 min，管底的白色沉淀即為RNA；吸除液體，加入75%乙醇1.5 mL洗滌沉淀；4℃下12000 rpm離心5 min；將液體吸除干凈，將離心管置于超凈臺(tái)上吹3 min；加入15 μL無RNA酶的水溶解RNA；55℃孵育5 min；使用Nanodrop 2000檢測(cè)RNA濃度及純度：儀器空白調(diào)零后取2.5 μL待測(cè)RNA溶液于檢測(cè)基座上，放下樣品臂，使用電腦上的軟件開始吸光值檢測(cè)；將濃度過高的RNA進(jìn)行適當(dāng)比例的稀釋，使其終濃度為200 ng/μL。

1.3.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反轉(zhuǎn)錄 取一PCR管，加入含2 μg RNA的溶液； 加入1 μL oligo(dT)18； 用無核糖核酸酶的去離子水補(bǔ)足至12 μL；于PCR儀上65℃保溫5 min，迅速置冰上冷卻；依次加入4 μL 5×Reaction Buffer，2 μL 10 mM dNTP Mix，1 μL RiboLock RNAase抑制劑 （20 U/μL) 和1 μL RevertAi M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200 u/μL)，用槍抽吸混勻；于PCR儀上42℃保溫60 min，結(jié)束后70℃保溫5 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶。定量PCR：取0.2 mL PCR管，配制如下反應(yīng)體系，每個(gè)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物配制3管。 2×qPCR Mix 12.5 μL， 7.5 μM基因引物2.0 μL， 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.5 μL，ddH2O 8.0 μL； PCR擴(kuò)增， 預(yù)變性95℃10 min；循環(huán) （40次）95℃，15 s→60℃，60 s；熔解曲線60℃→95℃，每15 s升溫0.3℃。

1.3.2.3 結(jié)果處理方法 △△CT法：每個(gè)標(biāo)本重復(fù)3次，Ct值取平均值；△CT=CT(目的基因，待測(cè)樣本)-CT(內(nèi)標(biāo)基因，待測(cè)樣本)；△△CT=△CT(待測(cè)樣本)-△CT(對(duì)照樣本)； 表達(dá)倍數(shù)=2-△△CT。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 計(jì)量資料用 （）表示，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布，多組比較用單因素方差分析，2組組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布，采用獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大椎穴和肺俞穴ATP濃度檢測(cè) 表1。

表1 新西蘭兔大椎穴和肺俞穴ATP濃度 （，μg/mL）

表1 新西蘭兔大椎穴和肺俞穴ATP濃度 （，μg/mL）

注：與空白組比較，△P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

組別空白組模型組治療組只數(shù)6 6 6大椎穴ATP濃度 肺俞穴ATP濃度0.3950±0.0409 12.4150±1.2662 5.2417±0.9637 0.4650±0.0774 10.2986±0.9360△4.3400±0.9586#

2.2 肺組織P2X7受體mRNA表達(dá) 見表2。

表2 新西蘭兔肺組織P2X7受體mRNA的相對(duì)表達(dá)量 （）

表2 新西蘭兔肺組織P2X7受體mRNA的相對(duì)表達(dá)量 （）

注：與空白組比較，△P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05

相對(duì)表達(dá)量0.1462±0.0785 3.3615±0.0254△1.1713±0.0153#組別空白組模型組治療組只數(shù)6 6 6

3 討論

哮喘是一種慢性氣道性炎性疾病，其發(fā)生與發(fā)展和氣道炎癥反應(yīng)有著密切聯(lián)系。ATP是細(xì)胞不可缺少的能源物質(zhì)，參與了細(xì)胞內(nèi)各種代謝循環(huán)，同時(shí)它可由突觸釋放并作為突觸傳遞重要的神經(jīng)遞質(zhì)；還可由血小板、上皮細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞等釋放出來，通過自分泌到胞外與細(xì)胞表面的特異性受體結(jié)合，參與調(diào)節(jié)了多種細(xì)胞反應(yīng)。研究表明[3-7]：ATP可對(duì)呼吸道產(chǎn)生多重影響，從而影響哮喘的發(fā)生及發(fā)展。ATP參與離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)呼吸道黏膜纖毛清除能力，維護(hù)肺部的宿主防御功能；作為一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)或自分泌/旁分泌信使，不僅可促使呼吸道平滑肌的收縮，還可誘發(fā)呼吸道平滑肌上皮依賴性的舒張，顯示其復(fù)雜的雙重調(diào)節(jié)作用；是呼吸道疾病和炎癥發(fā)生的重要介導(dǎo)者，過量釋放將導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的加劇，對(duì)于哮喘的發(fā)生與發(fā)展起促進(jìn)作用。本次實(shí)驗(yàn)觀察到模型組腧穴區(qū)ATP的濃度顯著高于空白組，也表明ATP參與了支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展過程。

ATP的作用大多是通過激活細(xì)胞表面的特異性受體實(shí)現(xiàn)的，眾多受體中P2X7受體被認(rèn)為是最特殊的受體。P2X7由595個(gè)氨基酸組成，是一種2次跨膜的蛋白，其N端和C端均在細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞膜上可形成3個(gè)或更多個(gè)同源亞基復(fù)合體。它與其他P2X受體的不同在于P2X7位于胞內(nèi)的有239個(gè)氨基酸，顯著多于其他已知ATP受體亞型梭基端氨基酸數(shù)量 （27～129個(gè)），此結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)決定了P2X7功能的特異性。P2X7受體的持續(xù)激活將導(dǎo)致大的膜孔形成，使得相對(duì)分子質(zhì)量為800×103的大分子都可以自由通過，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因此P2X7受體也被稱為P2Z受體，即細(xì)胞死亡受體[8]。大量實(shí)驗(yàn)證明人類P2X7基因調(diào)節(jié)哮喘中氣道對(duì)感染的反應(yīng)，P2X7基因所在的染色體基因位點(diǎn)包括許多和哮喘肺功能相關(guān)的基因。Denlinger等[9]研究表明，ATP的釋放是氣道炎癥反應(yīng)細(xì)胞損傷過程中的一種有害信號(hào)，在人和小鼠過敏原激發(fā)后，氣道ATP水平升高，引發(fā)樹突狀細(xì)胞合成促進(jìn)嗜酸粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞募集的細(xì)胞因子，導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性和氣道炎癥反應(yīng)，而P2X7受體參與了ATP釋放的調(diào)控過程，阻斷P2X7可以減輕OVA激發(fā)的樹突狀細(xì)胞介導(dǎo)的嗜酸粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤。本次實(shí)驗(yàn)觀察到模型組肺組織P2X7表達(dá)顯著高于空白組，表明P2X7受體參與了支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展過程。ATP可能是通過P2X7受體參與了支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展過程。

三伏灸是以 《內(nèi)經(jīng)·四氣調(diào)神大論》提到的 “圣人春夏養(yǎng)陽， 秋冬養(yǎng)陰， 以從其根”[10]為理論依據(jù)的一種治療方法，利用天陽、艾之辛陽之性以及藥物的溫陽、辛散、走竄作用通過穴位的特異性溫補(bǔ)脾腎、溫陽散寒，從而增強(qiáng)患者體質(zhì)，減少支氣管哮喘的發(fā)作次數(shù)。近幾年，三伏灸在南方許多城市流行，在臨床上取得較為顯著的療效，得到了患者及其家人的普遍認(rèn)可。本次實(shí)驗(yàn)觀察到治療組腧穴區(qū)ATP的濃度和P2X7表達(dá)顯著低于模型組，表明：三伏灸可能通過下調(diào)局部穴位ATP的濃度，進(jìn)而下調(diào)肺組織P2X7受體的表達(dá)量，從而改善炎癥反應(yīng)達(dá)到臨床療效。

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