一種顯微鏡自動聚焦算法

梁隆愷 趙晶 何勇軍

摘 要：傳統(tǒng)的自動聚焦算法時間復(fù)雜度高，計算現(xiàn)在的高清圖像速度慢，導(dǎo)致聚焦效率低下。針對這一問題提出了一種新的聚焦方法。該方法在分析灰度值與圖像清晰度之間關(guān)系的基礎(chǔ)上，提出了灰度非零值統(tǒng)計函數(shù)和低灰度值統(tǒng)計函數(shù)來評價聚焦清晰度，具有運(yùn)算量小，評價準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。然后采用兩種評價函數(shù)結(jié)合的方式實(shí)現(xiàn)了一種變步爬山搜索策略。該策略在遠(yuǎn)焦點(diǎn)位置采用灰度零值比較評價函數(shù)和大步長快速粗略搜索焦點(diǎn)，在近焦點(diǎn)位置采用低灰度值統(tǒng)計函數(shù)和小補(bǔ)償精細(xì)搜索焦點(diǎn)。實(shí)驗(yàn)表明，所提出的方法在聚焦效率和清晰度兩個方面都優(yōu)于目前的方法。

關(guān)鍵詞：自動聚焦；自動顯微鏡；變步爬山；灰度非零值統(tǒng)計法；低灰度值統(tǒng)計法

DOI：10.15938/j.jhust.2018.02.009

中圖分類號： TH742

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號： 1007-2683（2018）02-0046-07

Abstract：The traditional autofocus algorithm with high time complexity has slow speed of calculation for the current high-definition images that lead to low efficiency of the focusing. To solve this problem， we improve auto focusing by improving focusing evaluation and focus searching. First， two evaluation functions based on gray change， namely gray zero comparison method and low gray value statistics method， are put forwarded. Then the proposed evaluation functions are applied to realize the variable step climbing search strategy. The experimental results show that the proposed method in two aspects of focusing efficiency and clarity are better than current methods.

Keywords：automatic focusing； automatic microscope； variable step hill-climbing； gray nonzero statistics； low gray value statistics

0 引 言

傳統(tǒng)的人工閱片方法給醫(yī)生帶來了繁重的勞動，而且容易造成誤診。近年來，隨著儀器自動化、智能化的發(fā)展，自動閱片技術(shù)開始出現(xiàn)并迅速發(fā)展。該技術(shù)通過計算機(jī)控制顯微鏡連續(xù)移動并拍攝清晰的鏡下圖像，然后進(jìn)行分析識別后列出異常細(xì)胞。由于引入了自動控制和機(jī)器學(xué)習(xí)，這一技術(shù)能協(xié)助醫(yī)生診斷，有效降低醫(yī)生的工作強(qiáng)度，提高醫(yī)生的診斷精度。

自動閱片的首要任務(wù)是自動獲取顯微鏡下細(xì)胞圖像。包括兩個重要的步驟：掃描和聚焦。掃描的目的在于控制顯微鏡平臺移動，使得鏡頭遍歷玻片上被掃描區(qū)域的各個位置。聚焦的目的在于控制平臺上下移動以拍攝到清晰的圖像。

本文將研究重點(diǎn)放在顯微鏡聚焦上。目前的方法主要可以分為兩大類：第一類主動聚焦方法通過測量鏡頭與被拍攝物體之間距離，然后將鏡頭移動到焦點(diǎn)位置達(dá)到聚焦的目的。這類方法通常要依賴于測距方法，復(fù)雜度高、成本大且難以實(shí)現(xiàn)。第二類被動方法以圖像信號為反饋，通過比較不同位置圖像清晰度的變化趨勢實(shí)現(xiàn)自動聚焦。隨著圖像處理技術(shù)的進(jìn)步，被動聚焦技術(shù)被廣泛應(yīng)用于自動顯微鏡中。

影響顯微鏡聚焦算法的兩個重要因素是清晰度評價函數(shù)[1-6]和焦點(diǎn)位置搜索方法。在清晰度評價函數(shù)方面，目前廣泛使用的評價函數(shù)有絕對方差函數(shù)、灰度差分絕對值之和算子[7-10]、拉普拉斯算子[11]、能量譜方法[12]等評價函數(shù)。由于這些函數(shù)的計算量大，在使用高分辨率攝像頭情況下聚焦的速度太慢，不能滿足應(yīng)用需求。在焦點(diǎn)搜索方法方面，典型的有爬山搜索法和全局搜索法。爬山法從初始位置移動，比較移動前后位置上圖像的清晰度并始終朝著清晰度增加的方向移動，即“爬山”，直到清晰度開始降低停止。清晰度最高的點(diǎn)被視為焦點(diǎn)位置即“山頂”。全局搜索法則以一定的步長在一定的調(diào)焦范圍從一端逐步搜索到另一端，找到圖像清晰度最大的焦點(diǎn)位置。這兩種方法存在的問題在于很難確定一個合理的搜索步長。步長過大，聚焦速度增加但聚焦精度降低，步長過小，聚焦精度較高但聚焦速度降低。事實(shí)上，在遠(yuǎn)焦點(diǎn)位置需要大步接近焦點(diǎn)，在近焦點(diǎn)位置需要小步精細(xì)搜索。

自動閱片系統(tǒng)的焦點(diǎn)范圍寬，且處理的圖片分辨率高，采集圖片量大，因此需要快速的聚焦方法。影響聚焦速度的因素有兩個，第一個因素是清晰度函數(shù)本身的運(yùn)算復(fù)雜度較高，運(yùn)算量較大；第二個因素是相機(jī)在不同時刻采集圖像的圖像有微弱變化（比如光照），導(dǎo)致同一個評價函數(shù)的值出現(xiàn)波動，而在遠(yuǎn)焦點(diǎn)位置，傳統(tǒng)的評價函數(shù)變化緩慢，容易受圖像變化的影響而變得起伏，這將影響爬山的方向，造成在一個位置來回移動，嚴(yán)重影響聚焦速度，甚至導(dǎo)致聚焦失敗。因此，本文首先提出了兩種高效清晰度評價函數(shù)，即灰度非零值統(tǒng)計函數(shù)和低灰度值統(tǒng)計函數(shù)?；叶确橇阒到y(tǒng)計函數(shù)在遠(yuǎn)焦點(diǎn)位置不受圖像采集的影響，而低灰度值統(tǒng)計函數(shù)在近焦點(diǎn)位置具有尖銳的峰形。此外，兩種函數(shù)的時間復(fù)雜度都很低。在此基礎(chǔ)上，提出了一種新的焦點(diǎn)搜索方法。該方法利用了提出的兩種評價函數(shù)的優(yōu)勢，在遠(yuǎn)焦點(diǎn)位置采用灰度零值比較評價函數(shù)并采用較大步長快速向焦點(diǎn)方向移動，避免了圖像采集帶來的影響。在近焦點(diǎn)位置采用低灰度值統(tǒng)計函數(shù)并結(jié)合小步長精細(xì)搜索焦點(diǎn)位置。

1 現(xiàn)有的自動清晰度評價函數(shù)

清晰度評價函數(shù)作為衡量圖像是否聚焦的標(biāo)準(zhǔn)，它的設(shè)計基礎(chǔ)在于：聚焦圖像比離焦圖像包含更多的細(xì)節(jié)信息。然而，要想讓計算機(jī)對圖像清晰度進(jìn)行比較，必須要找到一個直觀比較的數(shù)值，這個數(shù)值能夠反應(yīng)在不同聚焦?fàn)顟B(tài)下圖像質(zhì)量的好壞。傳統(tǒng)的清晰度評價函數(shù)主要分為3類：基于灰度變化、基于邊緣檢測、能量譜法。

1.1 基于灰度變化

在一張圖片中，根據(jù)灰度變化的平均程度，計算出灰度平均值，在計算每個像素點(diǎn)的方差，方差和的值用來衡量照片的清晰度，公式如下

1.2 基于邊緣檢測

聚焦清晰圖像應(yīng)有較銳化的邊緣，由于梯度算子具有各向同性和旋轉(zhuǎn)不變性，可把圖像中各不同走向的邊緣和線條突出，離焦量越小圖像邊緣越銳化，所以圖像灰度梯度可以用來評價圖像的聚焦程度取圖像中每一象素點(diǎn)的梯度值并進(jìn)行匯總。具體有以下幾種

1.2.1 灰度差分絕對值之和算子（SMD）

通過計算每個像素點(diǎn)在包含自身的2×2空間中，該點(diǎn)（x，y）與上方和右方相鄰點(diǎn)差值的和值作為評價標(biāo)準(zhǔn)。

2 新提出的自動清晰度評價函數(shù)

2.1 灰度非零值統(tǒng)計函數(shù)（GZV）

如圖1 （a）、（c）所示模糊的圖像和清晰的圖像時發(fā)現(xiàn)，模糊的圖像細(xì)胞的細(xì)節(jié)都看不到，同時細(xì)胞比較暗淡，而清晰的圖像，細(xì)胞細(xì)節(jié)明顯，顏色比較深。在一張照片中每個像素點(diǎn)的灰度值都是在0～255之間，其灰度直方圖如圖1（b）、（d）所示。

對比模糊和清晰圖像的灰度直方圖可以看出，模糊圖片的灰度值集中在150～220之間，而其它灰度值的像素個數(shù)為零，表明此時圖像中細(xì)胞的灰度值更接近背景的灰度級，清晰圖片的灰度值集中在50～220之間，而其它灰度值的像素個數(shù)為零，此時圖像中觀察到細(xì)胞顏色比較深的地方對應(yīng)著較低的灰度值。

將灰度直方圖中出現(xiàn)的像素個數(shù)不為零的灰度值稱為灰度非零值。從模糊圖像到清晰圖像這種灰度零值的變化是有規(guī)律的，可以直觀的看到在清晰圖像中灰度非零值要多于模糊圖像的灰度非零值。這種變化可以作為評價聚焦清晰的一個標(biāo)準(zhǔn)，其公式為：

利用GZV清晰度評價對連續(xù)40張從離焦到聚焦再到離焦的照片計算GZV函數(shù)后繪制出的聚焦曲線，如圖2所示，圖中橫軸為顯微鏡平臺沿Z軸方向移動的距離，縱軸為灰度非零值在一張照片中出現(xiàn)的個數(shù)。

2.2 低灰度值統(tǒng)計法（LGV）

對比圖1 （a）、（c）兩幅圖片，清晰圖像中的細(xì)胞明顯比模糊圖像中的細(xì)胞要黑，對應(yīng)著灰度直方圖中灰度值較低的區(qū)域。而清晰細(xì)胞的面積對應(yīng)低灰度區(qū)域的面積。一張圖片的灰度直方圖總面積就是其圖像像素點(diǎn)的總數(shù)。根據(jù)圖像實(shí)際情況，選取一個閾值T，劃分出一個有效信息的低灰度區(qū)域作為觀察區(qū)域，如圖1（d）中灰度值50～150之間的類三角形的區(qū)域。在圖像清晰度變化時，對應(yīng)區(qū)域面積的變化可以作為評價清晰的標(biāo)準(zhǔn)，公式為：

其中閾值的選取辦法為，從焦點(diǎn)一側(cè)開始以較小的步長移動至圖像焦點(diǎn)另一側(cè)直到圖像完全模糊，統(tǒng)計每幅圖像出現(xiàn)過最小的灰度值繪成曲線圖，如圖3所示，圖中最小值為35左右，最大值為140，則閾值的選取范圍為35至140之間。圖4為選取不同閾值對同一圖像沿Z軸方向移動的清晰度評價函數(shù)曲線。實(shí)驗(yàn)表明，閾值選取的越小，對圖像的變化越敏感，但閾值的選取不是越小越好，閾值過小導(dǎo)致其聚焦可見區(qū)域變小。根據(jù)此圖像曲線的情況，現(xiàn)閾值選取為80。

3 變步爬山法

傳統(tǒng)的盲人爬山法從起始點(diǎn)開始以一個定長的步子去搜索最大值，然后將最大值點(diǎn)作為焦點(diǎn)所在位置。該方法無法預(yù)知山頂?shù)拇笾挛恢茫绻鹗嘉恢镁嚯x山頂較遠(yuǎn)，則一次聚焦的時間就會過長，在大量采集照片的時候，其效率會較低。因此，本文提出了一種改進(jìn)的盲人爬山法，稱為變步長爬山法。

使用變步爬山法，當(dāng)起始位置距離山頂較遠(yuǎn)時，選用大步長迅速靠近，當(dāng)靠近山頂位置時，采用小步長保證精確度。變步爬山法采用灰度非零值統(tǒng)計法和低灰度值統(tǒng)計法這兩種清晰度評價函數(shù)來進(jìn)行聚焦。其中灰度非零值統(tǒng)計法的特點(diǎn)在于，針對不同細(xì)胞照片清晰度函數(shù)的取值都在0至255之間，因此可以根據(jù)當(dāng)前位置對應(yīng)的清晰度值來確定距離山頂?shù)拇笾麻L度。

變步長爬山法的步長一共有3種：

第一種情況是在焦點(diǎn)附近的位置，用較小的步長S，并采用低灰度值統(tǒng)計法找到焦點(diǎn)位置。

第二種情況是在遠(yuǎn)離焦點(diǎn)但是依然能夠看到圖像的區(qū)域，采用灰度零值比較法，用較大的步長S2去找到焦點(diǎn)位置。

第三種情況是在離焦點(diǎn)更遠(yuǎn)的地方，只能隱約看到圖像的區(qū)域，采用灰度零值比較法，用更大的步長S1去找到可見圖像的區(qū)域。

聚焦爬山路線如圖6所示。聚焦起點(diǎn)使用GZV計算得出步長為S2，向焦點(diǎn)方向移動，再次使用GZV計算得出步長為S1，繼續(xù)移動并使用GZV計算得出，此時的位置已靠近焦點(diǎn)位置，接下來選用LGV函數(shù)作為清晰度評價函數(shù)，步長大小變?yōu)镾，繼續(xù)移動，知道發(fā)現(xiàn)越過峰頂，立刻反向移動，結(jié)束聚焦。聚焦流程如圖7所示。

4 實(shí)驗(yàn)與分析

結(jié)合細(xì)胞識別項(xiàng)目的要求，清晰度評價函數(shù)應(yīng)該滿足：

1）單峰性：在聚焦點(diǎn)兩側(cè)，圖像聚焦函數(shù)單調(diào)遞減。變步爬山法僅能實(shí)現(xiàn)單峰的曲線極點(diǎn)搜索，所以單峰是精準(zhǔn)對焦的前提。

2）精準(zhǔn)性：評價函數(shù)的極點(diǎn)應(yīng)精準(zhǔn)對應(yīng)聚焦焦點(diǎn)。

3）尖銳性：尖銳性越好，能靈敏地刻畫圖像差異[13]。

4）高效性：計算時間開銷較短，能為聚焦提高效率。

4.1 實(shí)驗(yàn)環(huán)境

本實(shí)驗(yàn)基于我們開發(fā)的DNA倍體分析系統(tǒng)，其結(jié)構(gòu)如圖8所示，具體設(shè)備包括：

①德國UEYE高清數(shù)碼攝像機(jī)②數(shù)碼攝像機(jī)適配器③電動載物臺④控制遙桿⑤顯微鏡⑥顯微鏡光源盒⑦控制盒。

計算機(jī)運(yùn)行環(huán)境：CPU：i5-4460s，內(nèi)存：8G，操作系統(tǒng)：Windows 7，編程語言VC++，圖片大小2048×2048。連續(xù)的80張照片從離焦到聚焦再到離焦，其照片對應(yīng)Z軸間隔為10個步長單位，如圖9所示。

細(xì)胞DNA顯微分光圖像自動分析儀結(jié)構(gòu)如圖10所示，包括顯微成像系統(tǒng)，高清數(shù)碼攝相機(jī)，計算機(jī)，三維移動平臺以及一些輔助配套裝置。計算機(jī)通過兩個端口分別控制CMOS攝像機(jī)和控制盒，控制盒可以控制平臺的移動和聚焦。

系統(tǒng)工作原理，首先光源通過濾光片照射置于載物平臺上的玻片，圖像通過顯微鏡由數(shù)碼攝像機(jī)采集，然后將圖像通過USB上傳至計算機(jī)，計算機(jī)計算圖像的清晰度后通過移動Z軸改變平臺到顯微鏡物鏡的距離，最終移動到一個清晰圖像的位置。

在顯微鏡對細(xì)胞標(biāo)本進(jìn)行掃描的時候由于攝像頭可視范圍有限的原因不能一次將整個細(xì)胞標(biāo)本的圖像采集下來，所以需要進(jìn)行多次采集才能將整個細(xì)胞標(biāo)本的圖像獲取然后進(jìn)行圖像分析。掃描時的移動是通過移動電動載物臺來實(shí)現(xiàn)攝像頭的相對移動，移動所使用的是X軸電機(jī)和Y軸電機(jī)。

4.2 清晰度評價函數(shù)

圖11為由自動顯微鏡下獲取的連續(xù)80張照片計算得到的評價函數(shù)曲線。從圖中進(jìn)行單峰性、精準(zhǔn)性、尖銳性的比較。

單峰性比較：灰度非零值統(tǒng)計法的出現(xiàn)局部極大值，單峰性較差；低灰度統(tǒng)計法和灰度方差算子法在較大的區(qū)域（240～700）都沒有出現(xiàn)局部極大值，單峰性較好；拉普拉斯、灰度差分絕對值之和算子以及Roberts梯度算子在較小的區(qū)域（380～600）沒有出現(xiàn)局部極大值，單峰性一般。

精準(zhǔn)性比較：圖中除了灰度非零值統(tǒng)計法在焦點(diǎn)位置出現(xiàn)多個點(diǎn)精準(zhǔn)性較差以外，其余函數(shù)在焦點(diǎn)位置均相同且只有一個點(diǎn)，精準(zhǔn)性好。

尖銳性比較：灰度非零值統(tǒng)計法、拉普拉斯、灰度差分絕對值之和算子以及Roberts梯度算子這四種函數(shù)的尖銳性一般，在焦點(diǎn)附近變化程度一般；灰度差分絕對值之和算子變化較為明顯；低灰度統(tǒng)計法變化最為明顯。

表1為幾種清晰度評價函數(shù)處理照片的時間。表格是針對每個清晰度評價函數(shù)單獨(dú)進(jìn)行時間測試的結(jié)果，80張圖片已經(jīng)事先加載到內(nèi)存中，計算時間僅為計算用時。根據(jù)表格所示，進(jìn)行高效性比較。

高效性比較：灰度非零值統(tǒng)計法和低灰度統(tǒng)計法用時最短，灰度差分絕對值之和算子用時最長，其余函數(shù)用時相似。所以灰度非零值統(tǒng)計法和低灰度統(tǒng)計法高效性最好。

4.3 實(shí)驗(yàn)總結(jié)

灰度非零值統(tǒng)計函數(shù)的聚焦函數(shù)曲線在峰值附近不夠敏感，并且函數(shù)存在極大值不利于最后的聚焦，但是其函數(shù)計算用時少。如果增大步長即可避免極大的出現(xiàn)，同時與其他函數(shù)相比單調(diào)區(qū)間最大，在離焦點(diǎn)較遠(yuǎn)的地方依然能夠?qū)崿F(xiàn)聚焦。灰度方差算子法的聚焦函數(shù)曲線明顯要好于其他幾種，焦點(diǎn)位置的敏感度較高，但是其計算量大，用時過多，嚴(yán)重影響聚焦效率。拉普拉斯、灰度差分絕對值之和算子以及Roberts梯度算子的聚焦函數(shù)曲線基本相似，后兩者計算所消耗時間相差不大，拉普拉斯用時更多。由于這三種函數(shù)本身計算的是圖像邊緣的能量，函數(shù)計算較為復(fù)雜，因此計算效率會比較低。低灰度值統(tǒng)計法的聚焦函數(shù)曲在峰值附近敏感度高于其他函數(shù)，且其單調(diào)性好。計算時間僅次于灰度非零值統(tǒng)計函數(shù)。

通過實(shí)驗(yàn)對比發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)的清晰度評價函數(shù)優(yōu)點(diǎn)是在焦點(diǎn)附近位置敏感度高，缺點(diǎn)是計算時間長，且敏感區(qū)間過小。當(dāng)聚焦起始位置距離焦點(diǎn)稍遠(yuǎn)時，由于其較遠(yuǎn)位置單調(diào)性差，從而導(dǎo)致聚焦失敗。現(xiàn)針對這兩個問題提出了變步爬山法.變步爬山法的聚焦分為細(xì)聚焦和粗聚焦兩個階段，其中粗聚焦又分為長距離聚焦和近距離聚焦兩個部分。兩個階段的函數(shù)選取首要條件是計算速度快，其中粗聚焦階段，初始位置到焦點(diǎn)的距離非常遠(yuǎn)，且要快速靠近焦點(diǎn)，所以這部分步長比較大，因此要求函數(shù)單調(diào)區(qū)間大，且在較大步長情況下不存在極值點(diǎn)。精細(xì)聚焦階段，距離焦點(diǎn)位置較近，使用小步長來保證聚焦的精確度，因此要求函數(shù)在焦點(diǎn)附近敏感度高。

結(jié)合以上指標(biāo)分析發(fā)現(xiàn)，低灰度值統(tǒng)計法和灰度非零值統(tǒng)計函數(shù)滿足條件。其中低灰度值統(tǒng)計法與其他方法相比唯一的區(qū)別就是計算復(fù)雜度較低，且聚焦精度較好，因此可將此函數(shù)作為細(xì)聚焦的最優(yōu)函數(shù)。而對于粗聚焦階段，聚焦步長較大，灰度非零值統(tǒng)計函數(shù)的聚焦函數(shù)曲線便不會出現(xiàn)極大值，只有最大值，并且其單調(diào)區(qū)間較大，因此可作為粗聚焦的最優(yōu)函數(shù)。

5 結(jié) 論

本文針對DNA倍體分析系統(tǒng)對聚焦速度的要求，從清晰度評價函數(shù)的計算速度和聚焦搜索策略兩方面進(jìn)行了提升。清晰度評價函數(shù)方面，提出了速度更快的低灰度值統(tǒng)計法和灰度非零值統(tǒng)計函數(shù)，在搜索策略方面，采用了改進(jìn)的變步爬山法。通過實(shí)驗(yàn)證明，它的效率與傳統(tǒng)的聚焦函數(shù)相比有明顯的提升。下一步的工作是運(yùn)用機(jī)器學(xué)習(xí)讓計算機(jī)自動計算低灰度值統(tǒng)計法的閾值。

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（編輯：溫澤宇）