靶向多肽R8-HBAP抑制成人T細(xì)胞白血病細(xì)胞惡性增殖*

宋早文， 張?jiān)ＸS， 方金勇， 郭一孚， 劉越丹， 徐玲玲， 趙鐵軍

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

成人T細(xì)胞白血病(ATL)是一種惡性淋巴系統(tǒng)增殖性疾病[1].人類T淋巴細(xì)胞白血病1型病毒(HTLV-1)的感染與ATL的發(fā)生密切相關(guān)[2-3].迄今為止，尚無有效的預(yù)防及治療ATL的手段[4].近30年的研究表明，HTLV-1編碼的病毒蛋白在促進(jìn)病毒感染復(fù)制、進(jìn)而誘發(fā)成人T細(xì)胞白血病的過程中扮演極為重要的角色[2-3,5-6].因此，探索直接以HTLV-1病毒蛋白為靶點(diǎn)的新型療法成為攻克該疾病的關(guān)鍵.

HTLV-1病毒基因組除正向編碼結(jié)構(gòu)基因gag，pol，env外，位于3’LTR和env之間的pX區(qū)還編碼一系列調(diào)節(jié)基因Tax，Rex，p12，p13，p30和HBZ等,其中HBZ蛋白由HTLV-1反義鏈編碼[7-8].HBZ蛋白包含3個(gè)功能結(jié)構(gòu)域：N末端激活結(jié)構(gòu)域(AD domain)，C末端堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域(bZIP domain)，以及位于中間的中央結(jié)構(gòu)域(CD domain)[9-10].研究證明，HBZ蛋白的致癌功能通過其亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域參與調(diào)節(jié)多條細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑得以實(shí)現(xiàn)[11-16].綜合以上信息，本研究人工合成能有效封閉HBZ bZIP功能的靶向多肽——HBAP(HBZ bZIP associate peptide)，并通過多聚精氨酸穿膜肽R8將HBAP攜帶入白血病細(xì)胞，觀察其對(duì)腫瘤細(xì)胞惡性增殖起關(guān)鍵作用信號(hào)通路的抑制作用，最后運(yùn)用MTT實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞術(shù)觀察該靶向多肽對(duì)白血病細(xì)胞的殺傷作用.這一研究成果將為我們研發(fā)抗病毒的藥物提供一個(gè)全新的思路與策略.

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和靶向多肽

成人T細(xì)胞白血病細(xì)胞株ATL-T，ATL-2，急性T細(xì)胞白血病細(xì)胞株Jurkat及人胚腎細(xì)胞293FT細(xì)胞，皆由日本京都大學(xué)松崗雅雄教授惠贈(zèng).

靶向多肽R8-HBAP：購于百奇生物科技(蘇州)有限公司.

1.2 主要試劑與儀器

細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM，RPMI-1640，胰蛋白酶為Invitrogen公司產(chǎn)品；抗體購自于Santa Cruze公司；胎牛血清購自法國(guó)Biowest公司；二甲基四氮唑鹽(MTT)為Sigma公司產(chǎn)品；細(xì)胞凍存液Cellbanker購自上海微科生物技術(shù)有限公司；雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒及質(zhì)粒大提試劑盒購買自Promega公司；BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)公司；丙烯酰胺、甘氨酸、苯甲基磺酰氟(PMSF)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、考馬斯亮藍(lán)G-250和R-250、十二烷基硫酸鈉(SDS)、TrionX-100、脫脂奶粉等均購于生工生物工程(上海)股份有限公司.

生物安全柜、3111型CO2培養(yǎng)箱：Thermo公司；1500型全自動(dòng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀：美國(guó)熱電公司.

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理

白血病細(xì)胞株(Jurkat、ATL-T和ATL-2)及人胚腎細(xì)胞293FT細(xì)胞分別培養(yǎng)于含10%胎牛血清和雙抗(青、鏈霉素，100 IU/mL)的RPMI-1640和DMEM完全培養(yǎng)基中.細(xì)胞于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱及飽和水蒸氣條件下常規(guī)培養(yǎng)及傳代，使用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的白血病細(xì)胞制成細(xì)胞懸液后，按1×105個(gè)/mL的密度接種于96孔板，90 μL/孔，以10 μL/孔的量加入0.05 mg/mL的靶向多肽R8-HBAP溶液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱分別孵育0，24，48，72和96 h后，加入MTT溶液10 μL，培養(yǎng)4 h后，加入100 μL裂解液室溫振蕩處理15 min.在595 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)OD值.

1.5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

表達(dá)HBZ和c-Jun蛋白的質(zhì)粒及AP-1報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞，再經(jīng)靶向多肽處理細(xì)胞48 h后，裂解細(xì)胞，提取總蛋白.應(yīng)用雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒檢測(cè)報(bào)告基因數(shù)值.

1.6 免疫共沉淀技術(shù)分析蛋白結(jié)合情況

靶向多肽處理轉(zhuǎn)染有HBZ和c-Jun蛋白的293FT細(xì)胞，48 h后提取細(xì)胞的總蛋白.20 μL Protein G預(yù)處理1 mg總蛋白樣品30 min后，收集上清蛋白，加入FLAG抗體，4 ℃旋轉(zhuǎn)混勻1 h，再加入20 μL Protein G，4 ℃旋轉(zhuǎn)混勻1 h.結(jié)合有抗體及目的蛋白的Protein G經(jīng)過洗滌緩沖液漂洗5次后，煮沸變性，Western blot檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)水平.

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

采用Origin 8.5軟件作圖，SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，“*”P<0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異；“**”P<0.01表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上有極顯著性差異.

2 結(jié) 果

2.1 HBZ bZIP卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域分析

HTLV-1編碼的病毒蛋白HBZ，其N端含有與c-Fos相似的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域，這一結(jié)構(gòu)域參與了HBZ與c-Jun等亮氨酸拉鏈相關(guān)蛋白(JunB, JunD等)的互作，并影響了HBZ致癌功能的發(fā)揮[11-13].針對(duì)這一結(jié)合特性，靶向設(shè)計(jì)并合成能阻遏HBZ與c-Jun相關(guān)蛋白結(jié)合的多肽，將為治療ATL提供新的技術(shù)和有效的手段.

c-Jun和c-Fos形成的復(fù)合物對(duì)細(xì)胞生命活動(dòng)具有重要作用，因此，該靶向多肽不能干擾細(xì)胞Fos-Jun蛋白復(fù)合物的形成(見圖1)[17-18].然而，由于HBZ與Fos的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域具有較高的相似性，這給設(shè)計(jì)針對(duì)HBZ的抑制性多肽帶來一定的困難.HBZ和c-Fos與c-Jun相關(guān)蛋白之間的結(jié)合主要有賴于亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域中的卷曲螺旋二聚體的形成(見圖2).在以亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)的異質(zhì)二聚體中，結(jié)構(gòu)域中的e位點(diǎn)和g位點(diǎn)之間的靜電互作起到關(guān)鍵性作用.e—g位點(diǎn)之間的結(jié)合特性也成為設(shè)計(jì)人工異質(zhì)二聚體的基礎(chǔ)[19-20].然而，HBZ和c-Fos蛋白在e位和g位中電荷分布極其相似，均為g位點(diǎn)上有4個(gè)谷氨酸(Glu)，e位點(diǎn)上有2個(gè)谷氨酸和其他中性氨基酸(見圖2).

圖1 設(shè)計(jì)能抑制HBZ蛋白功能的靶向多肽HBAP

圖2 HBZ，c-Jun及c-Fos的卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域分析

此外，對(duì)c-Jun-c-Fos復(fù)合體的X射線單晶衍射分析和對(duì)卷曲螺旋肽測(cè)算分析顯示，a位點(diǎn)和g位點(diǎn)的互作也可能是一個(gè)比較重要的因素.因此，根據(jù)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域中的a—g位點(diǎn)互作，筆者成功設(shè)計(jì)了基于c-Jun序列的突變型的亮氨酸拉鏈片段HBAP.這一片段的顯著特點(diǎn)在于它對(duì)HBZ亮氨酸拉鏈的親和性明顯高于對(duì)c-Fos亮氨酸拉鏈的親和性.

2.2 設(shè)計(jì)并合成靶向多肽R8-HBAP

結(jié)合上述設(shè)計(jì)原則，并在上述熱力學(xué)分析的基礎(chǔ)上，根據(jù)CANDI-PCA理論設(shè)計(jì)了6個(gè)能與HBZ蛋白bZIP結(jié)構(gòu)域形成二聚體的多肽序列，并在每個(gè)多肽的C末端添加8個(gè)精氨酸R8的細(xì)胞穿膜肽(見表1).多聚精氨酸是一類人工合成的短肽，它由8個(gè)精氨酸殘基構(gòu)成，蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)活性極強(qiáng)，可作為一種有潛力的藥物輸送載體.為了避免多肽之間發(fā)生相互作用，維持蛋白的構(gòu)象及其生物學(xué)活性，在HBAP和R8序列間引入一個(gè)可彎曲的間隔區(qū)Acp.

表1 靶向多肽R8-HBAP序列

2.3 靶向多肽R8-HBAP抑制HBZ與c-Jun蛋白互作

隨后，筆者研究了R8-HBAP是否能有效地與HBZ蛋白結(jié)合，從而干擾HBZ蛋白與c-Jun蛋白的互作.表達(dá)HBZ和c-Jun蛋白的載體pcDNA3-mycHis-HBZ和pCMV-HA-c-Jun共轉(zhuǎn)染至293FT細(xì)胞，6 h后分別加入不同序列的R8-HBAP.處理48 h后，裂解細(xì)胞，免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白結(jié)合情況.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，HBZ蛋白能與c-Jun蛋白結(jié)合，然而處理R8-HBAP后，多數(shù)靶向多肽均未呈現(xiàn)抑制效果，1b，2b和2c片段能顯著抑制HBZ-c-Jun蛋白復(fù)合物的形成.后續(xù)研究中，將使用1b，2b和2c號(hào)靶向多肽進(jìn)一步分析其抑制功能.

圖3 靶向多肽R8-HBAP抑制HBZ與c-Jun蛋白的結(jié)合

圖4 靶向多肽R8-HBAP抑制HBZ對(duì)AP-1信號(hào)通路的調(diào)控作用

2.4 靶向多肽R8-HBAP抑制HBZ對(duì)AP-1信號(hào)通路的調(diào)控作用

為了進(jìn)一步研究R8-HBAP對(duì)HBZ調(diào)控的AP-1信號(hào)通路的作用，筆者采用了雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù).將HBZ和c-Jun表達(dá)質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到對(duì)應(yīng)組別的Jurkat細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染6 h后處理R8-HBAP,48 h后收集細(xì)胞，運(yùn)用報(bào)告基因檢測(cè)儀檢測(cè)熒光值，結(jié)果如圖4所示，HBZ可顯著抑制由c-Jun激活的AP-1信號(hào)通路.當(dāng)加入R8-HBAP后，HBZ對(duì)AP-1信號(hào)通路的抑制作用明顯被抵消.該結(jié)果進(jìn)一步證明，R8-HBAP能通過與HBZ結(jié)合，從而干擾HBZ與其他亮氨酸拉鏈蛋白的結(jié)合，進(jìn)而影響到下游的信號(hào)通路.

2.5 靶向多肽R8-HBAP抑制白血病細(xì)胞惡性增殖

運(yùn)用MTT技術(shù)分析R8-HBAP是否可以通過抑制HBZ的功能，從而影響白血病細(xì)胞的惡性增殖.MTT檢測(cè)細(xì)胞活力發(fā)現(xiàn)，感染有HTLV-1病毒的ATL-T和ATL-2細(xì)胞在檢測(cè)的96 h內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，但R8-HBAP的加入可以顯著抑制白血病細(xì)胞ATL-T和ATL-2的惡性增殖(見圖5).該結(jié)果證明，R8-HBAP可以通過與HBZ互作影響HBZ下游調(diào)控信號(hào)通路，最終抑制白血病細(xì)胞的生長(zhǎng).

圖5 HBAP抑制白血病細(xì)胞惡性增殖

2.6 R8-HBAP靶向多肽促進(jìn)白血病細(xì)胞凋亡

為了進(jìn)一步檢測(cè)靶向多肽是否影響腫瘤細(xì)胞凋亡，筆者對(duì)多肽處理后的細(xì)胞進(jìn)行Annexin V/7-AAD染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，HBAP-1b多肽可誘導(dǎo)25.83%的ATL-T細(xì)胞發(fā)生凋亡.同樣，HBAP-1b靶向多肽作用ATL-2細(xì)胞24 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，處理組細(xì)胞凋亡比率明顯提高(見圖6).

圖6 HBAP誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡

綜上所述，R8-HBAP可以通過抑制其蛋白結(jié)合能力，顯著抑制白血病細(xì)胞惡性增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡.

3 討 論

20世紀(jì)70年代人們首次發(fā)現(xiàn)成人T細(xì)胞白血病(ATL)，并證明人類T淋巴細(xì)胞白血病1型病毒(HTLV-1)與ATL的發(fā)生密不可分.至今的三十多年間，圍繞ATL及HTLV-1開展的病毒學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)上的研究取得了突破性的進(jìn)展.然而在臨床上，缺乏有效的治療手段，預(yù)后效果不理想仍然是我們面臨的最棘手問題.目前治療ATL的方法主要包括化療和干擾素治療，但是療效均不明顯.其主要原因在于：1)在長(zhǎng)期使用藥物后，ATL細(xì)胞容易產(chǎn)生耐藥性；2)ATL病人呈現(xiàn)免疫缺陷狀態(tài)，易于遭受機(jī)會(huì)性感染[4].

HTLV-1和HIV同屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒家族.HTLV-1編碼的病毒蛋白在促進(jìn)感染細(xì)胞復(fù)制、誘發(fā)成人T細(xì)胞白血病的過程中起到舉足輕重的作用.日本京都大學(xué)Matsuoka教授第一個(gè)深入研究了HBZ蛋白的功能，并闡明了它與ATL發(fā)病密切相關(guān)[21].研究發(fā)現(xiàn)HBZ是HTLV-1編碼產(chǎn)物中唯一一個(gè)持續(xù)表達(dá)且不存在無義突變的基因.HBZ基因的缺失會(huì)顯著抑制HTLV-1感染細(xì)胞的增殖能力.此外，HBZ蛋白參與調(diào)節(jié)多條細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途經(jīng)，進(jìn)而促進(jìn)T細(xì)胞分化，抑制宿主免疫反應(yīng)，最終導(dǎo)致全身性炎癥反應(yīng)和T細(xì)胞淋巴瘤的發(fā)生[9-10].研究發(fā)現(xiàn)，HBZ蛋白通過其AD和bZIP結(jié)構(gòu)域與NF-κB p65亞基結(jié)合，從而抑制經(jīng)典NF-κB信號(hào)通路[16].此外，HBZ蛋白的AD和bZIP結(jié)構(gòu)域可協(xié)同抑制C/EBPα，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞惡性增殖[14].另外有研究顯示，HBZ蛋白通過其bZIP結(jié)構(gòu)域與CREB，CREB2和p300/CBP形成蛋白復(fù)合物，負(fù)向調(diào)節(jié)Tax介導(dǎo)的病毒轉(zhuǎn)錄.此外，HBZ bZIP結(jié)構(gòu)域可與c-Jun，JunB及JunD相互作用調(diào)節(jié)AP-1途徑，從而幫助病毒逃避免疫攻擊，抑制由病毒過度復(fù)制引起的宿主死亡[9-10].這些結(jié)果均表明，HBZ蛋白的持續(xù)表達(dá)在ATL發(fā)病機(jī)制中有著重要的意義.在這一系列過程中，HBZ bZIP結(jié)構(gòu)域通過與多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的方式參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，進(jìn)而導(dǎo)致白血病的發(fā)生.HBZ蛋白尤其是bZIP結(jié)構(gòu)域在HTLV-1致癌過程的重要作用，為研究和開發(fā)ATL治療措施提供了重要的靶點(diǎn)和線索.

因此，探索直接以HBZ蛋白作為靶點(diǎn)的新型治療方法成為攻克該疾病的關(guān)鍵.這些病毒蛋白不僅成為區(qū)分感染細(xì)胞和正常細(xì)胞的重要標(biāo)志，也成為腫瘤治療藥物的良好作用靶點(diǎn).利用這一特點(diǎn)研制出一系列腫瘤靶向藥物，如單克隆抗體、反義寡核苷酸等.但細(xì)胞膜具有選擇滲透性，生物大分子藥物無法通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而存在于細(xì)胞外的藥物很難直接影響細(xì)胞內(nèi)的生物反應(yīng)，因此，促進(jìn)藥物穿透細(xì)胞膜的研究變得非常重要.

細(xì)胞穿膜肽(CPP)是一類具有細(xì)胞穿透功能的短肽的統(tǒng)稱，一般少于30個(gè)氨基酸，它可以向細(xì)胞內(nèi)運(yùn)送各種自身不能穿越細(xì)胞膜的大分子生物活性物質(zhì)，為生物治療提供了一個(gè)嶄新的有力工具.細(xì)胞穿膜肽在腫瘤治療中的應(yīng)用通常是將各種腫瘤特異性的治療物質(zhì)靶向運(yùn)輸?shù)侥[瘤組織及細(xì)胞內(nèi)，從而起到抑制腫瘤細(xì)胞增生，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用.CPP通過運(yùn)送腫瘤特異性的治療物質(zhì)在一定程度上克服了腫瘤治療缺乏靶向?qū)脒@一困難，提高了藥物的利用效率，減少藥物引起的毒副作用.目前已有許多關(guān)于應(yīng)用CPP介導(dǎo)抗腫瘤藥物顯著抑制腫瘤細(xì)胞惡性表型，成功治療腫瘤動(dòng)物模型的報(bào)道[22].

通過本研究，首次以HTLV-1關(guān)鍵病毒蛋白HBZ為靶點(diǎn)研發(fā)治療方法，找準(zhǔn)了誘發(fā)ATL的關(guān)鍵因素，這一靶向治療手段解決了傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用.該研究為今后研究及設(shè)計(jì)抗HTLV-1和ATL的藥物提供了一個(gè)全新的思路與策略.

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