多種外源激素處理對水稻葉片衰老的影響*

徐江民， 蔣玲歡， 沈晨輝， 胡瑚倩， 林 晗， 馬 路， 饒玉春

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

衰老是生物有機(jī)體發(fā)育的必經(jīng)階段，也是一個(gè)高度程序化的過程，對植物來說，通過這個(gè)過程可將衰老葉片中營養(yǎng)物質(zhì)分解并轉(zhuǎn)運(yùn)至生長旺盛的果實(shí)或種子等.葉片是水稻(Oryzasativa. L)重要的源器官，其功能及生長進(jìn)程對水稻產(chǎn)量與品質(zhì)有重要的影響.葉片發(fā)生衰老時(shí)，細(xì)胞內(nèi)自由基產(chǎn)生及清除的動(dòng)態(tài)平衡被破壞，自由基不斷積累，從而加劇細(xì)胞膜脂過氧化，而作為細(xì)胞膜脂氧化產(chǎn)物的丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量也會(huì)增加[1].此外葉片中的超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性不斷下降，導(dǎo)致水稻葉片對活性氧的清除能力降低，活性氧積累，使膜脂過氧化作用不斷加強(qiáng)，從而促進(jìn)了衰老[2-3].葉綠體是光合作用的主要場所，一旦葉片衰老，葉綠素含量降低，葉片光合能力將顯著下降，直接影響植物的生長量[4].衰老還伴隨著抗壞血酸過氧化物酶、過氧化氫酶和谷胱甘肽過氧化物酶含量的減少、活性的降低，抗壞血酸、谷胱甘肽、甘露醇和類黃酮含量也會(huì)減少等一系列反應(yīng)[5].

植物激素在調(diào)控葉片衰老的啟動(dòng)及進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用[6].其中，一般情況下脫落酸(abscisic acid，ABA)、水楊酸(salicylic acid，SA)和茉莉酸(jasmonates，JA)可以促進(jìn)葉片的衰老，而通?？梢砸种迫~片衰老的植物激素有細(xì)胞分裂素(cytokinins，CTK)、生長素(auxins)和赤霉素(gibberellins，GA)，這表明葉片的衰老涉及一個(gè)復(fù)雜的激素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[7].脫落酸在植物生理代謝活動(dòng)中有重要作用，可減輕環(huán)境脅迫對植物的傷害，調(diào)控植物衰老[8-9].脫落酸對水稻灌漿的抑制或促進(jìn)作用與其作用時(shí)間、濃度有關(guān)，在灌漿初期，脫落酸對籽粒灌漿有促進(jìn)作用，灌漿后期高濃度脫落酸對灌漿起抑制作用[10].水楊酸是一種植物小分子酚類物質(zhì)，它能夠抑制植物中乙烯的合成，同時(shí)又能夠促進(jìn)植物生長過程中SOD和過氧化物酶(POD)的活性，進(jìn)而抑制脂膜過氧化[11-12].近期研究發(fā)現(xiàn)植物激素茉莉酸的自然突變更能闡明茉莉酸在水稻衰老中發(fā)揮的作用，證明了甲醇-茉莉酸共同作用與其表觀遺傳的調(diào)控對于水稻葉片的衰老起著重要的作用[13].細(xì)胞分裂素延緩葉片衰老的機(jī)理之一是負(fù)調(diào)控葉綠素相關(guān)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)葉綠素分解酶的降解，從而增加葉綠素含量，以維持葉片正常的光合能力[14].生長素在植物的生長發(fā)育過程中能提高相關(guān)的酶活性，提高源器官光合作用合成同化物的速率，促進(jìn)同化物運(yùn)輸，提高庫容活性[15].在葉片衰老過程中，赤霉素活性成分含量逐漸變低，噴施赤霉素可以延緩葉片衰老進(jìn)程，所以赤霉素被認(rèn)為是一類延緩葉片衰老的激素[16-17].

本文以水稻常規(guī)品種日本晴NIP及其作為背景的早衰突變體esd1為試驗(yàn)材料，通過在不同時(shí)期施加不同濃度的多種外源激素處理后，測定水稻葉片中葉綠素含量、MDA含量、SOD含量等指標(biāo)的變化，研究外源激素噴施對水稻葉片衰老的影響，找到最適宜的外源激素處理的時(shí)期和濃度，觀察其各種生理指標(biāo)的變化.以期為延緩水稻衰老、提高水稻產(chǎn)量和品質(zhì)的調(diào)節(jié)提供參考.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

水稻常規(guī)粳稻品種日本晴(NIP)和由NIP經(jīng)過EMS (ethylmethane sulfonate，甲基磺酸乙酯)誘變得到的早衰突變體esd1作為本實(shí)驗(yàn)的水稻材料.

1.2 方 法

1.2.1 水稻種子的萌發(fā)與培養(yǎng)

取各品種的水稻種子200 粒，將水稻種子進(jìn)行表面消毒(70%乙醇溶液消毒10 min，10%次氯酸鈉溶液消毒30 min)，再用去離子水沖洗數(shù)次，置于水中浸種2 d，期間換水1次.再進(jìn)行37 ℃培養(yǎng)箱浸種催芽48 h (用濕毛巾包裹，確保種子的濕度)，待催芽之后挑選露白一致的種子進(jìn)行播種.

1.2.2 各種外源激素最適濃度的確立

對2個(gè)品種的水稻進(jìn)行常規(guī)的水肥管理，在水稻長到三葉期時(shí)取長勢一致的植株，在大田條件下于7:00用濃度為0，0.05，0.10，0.50，1.00和2.00 μmol/L的外源SA進(jìn)行噴施處理，同時(shí)用濃度為0，0.25，0.50，0.75，1.00，1.25和1.50 μmol/L的外源獨(dú)角金內(nèi)酯GR24也進(jìn)行噴施葉片處理，在噴施激素后的0，6，12，24，36，48和72 h時(shí)分別剪取葉片測其SOD或葉綠素含量，比較不同濃度下2種水稻葉片中SOD或總?cè)~綠素含量的相對變化率，確定最佳處理濃度.當(dāng)水稻長到灌漿期時(shí)，選取長勢一致的植株，在大田條件下于7:00用外源生長素2,4-D、ABA、GA3和細(xì)胞分裂素KT-30分別進(jìn)行噴施處理，2,4-D的處理濃度為0，50，200，300，400和500 μmol/L，ABA的處理濃度為0，10，30，50，100，200和400 mg/L，GA3的處理濃度為0，10，50，100和200 mg/L，KT-30的處理濃度為0，0.10，0.50，1.00，2.00和4.00 μg/L，在處理后的0，1，3，5和7 d時(shí)分別剪取葉片測其葉綠素a、葉綠素b或MDA含量.比較不同濃度下2種水稻生理指標(biāo)的相對變化率，最顯著的處理濃度為最適處理濃度.

1.2.3 與衰老相關(guān)的生理指標(biāo)測定

葉綠素含量測定的方法參照Arnon分光光度法[18]，MDA含量參照陳建勛等[19]的方法，采用硫代巴比妥酸比色法測定.SOD酶活測定參照Wang等[20]和李合生[21]的方法，即以SOD抑制NBT光化學(xué)還原50%所需酶量為一個(gè)酶活性單位進(jìn)行測定.

2 結(jié) 果

2.1 外源赤霉素對水稻葉片中MDA含量影響

從圖1(a)和圖1(b)中可以看出，當(dāng)GA3的濃度為0 mg/L時(shí)，7 d后esd1和NIP中水稻葉片MDA含量均上升.NIP葉片經(jīng)不同濃度的GA3處理7 d后，與0 d相比,MDA的含量均有所下降，且隨濃度的增加，MDA的減少程度呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢；esd1的葉片經(jīng)不同濃度的GA3處理7 d后，與1 d相比,MDA的含量均有所下降，下降趨勢與NIP一樣，但MDA的下降程度較NIP更為明顯.二者均在GA3濃度為50 mg/L時(shí)，下降程度最為明顯，下降率分別為60.2%和90.6%，可以推測此濃度為外源GA3處理NIP和esd1的最適濃度(見表1).與NIP相比，esd1在GA3濃度為50 mg/L處理時(shí)MDA的下降程度更大，因此，esd1表現(xiàn)出對外源GA3更為敏感.

表1 各外源激素處理水稻最適濃度的確定

2.2 外源生長素對水稻葉片中w(葉綠素a∶葉綠素b)的影響

從圖1(c)和圖1(d)可知，在2,4-D的處理下，2種水稻葉片中w(葉綠素a∶葉綠素b)均有不同程度的增加，且在相同濃度的處理下，除了300 μmol/L濃度組的處理，其余esd1組w(葉綠素a∶葉綠素b)增加明顯高于NIP，其中在50 μmol/L濃度的處理下，esd1w(葉綠素a∶葉綠素b)增加量達(dá)到最大，達(dá)127.5%.而在此濃度下，esd1與NIP的增加程度差異也達(dá)到最大，達(dá)118.2%.說明發(fā)生早衰的esd1對生長素更為敏感，同時(shí)也暗示2,4-D對水稻葉片的衰老有抑制作用.在300 μmol/L的處理濃度下，NIPw(葉綠素a∶葉綠素b)的增加最為明顯，達(dá)到了75.5%，增加程度大于esd1，esd1只增加了36.0%.本研究表明，2,4-D處理的最佳濃度為野生型NIP最適濃度為300 μmol/L，而esd1最適濃度為50 μmol/L(見表1).

圖1 多種外源激素處理下NIP和esd1生理指標(biāo)的變化

2.3 外源獨(dú)角金內(nèi)酯對水稻葉片中總?cè)~綠素含量的影響

從圖1(e)和圖1(f)中可知，經(jīng)GR24處理72 h后，esd1和NIP的總?cè)~綠素含量變化均不是很明顯，但變化過程稍有區(qū)別.其中NIP噴施GR24后，72 h內(nèi)總?cè)~綠素含量呈“M”型變化.噴施不同濃度GR24 6 h后，NIP中總?cè)~綠素含量均有一定程度的上升.而esd1噴施GR24后，72 h內(nèi)總?cè)~綠素含量呈“W”型變化，在噴施后第一個(gè)6 h內(nèi)，esd1中總?cè)~綠素含量會(huì)有一個(gè)較為明顯的下降過程，后又逐漸上升，在噴施24 h后出現(xiàn)一個(gè)較為緩和的下降過程，后又逐漸上升.其中，esd1在濃度為0.50 μmol/L的GR24作用下，總?cè)~綠素含量下降幅度大.這些結(jié)果表明,esd1對GR24較為敏感.

2.4 外源細(xì)胞分裂素對水稻葉片中MDA含量的影響

從圖1(g)和圖1(h)中可知，NIP和esd1在未經(jīng)過KT-30處理時(shí)，MDA含量變化趨勢不明顯.經(jīng)過不同濃度的KT-30處理后，esd1所有組均呈下降趨勢，在0.1 μg/L濃度處理下，水稻葉片MDA值下降程度最大，達(dá)72.7%.NIP在不同濃度處理下，相對未處理的均有下降，但是下降幅度不大，其中處理濃度為0.1 μg/L時(shí)，MDA下降趨勢最大，達(dá)9%.總的來說，在經(jīng)過KT-30處理后，水稻葉片的MDA值均出現(xiàn)了不同程度的下降.但是esd1的葉片MDA值下降程度較NIP更加明顯，而且處理時(shí)間超過5 d后上升趨勢也比NIP的慢.根據(jù)以上結(jié)果可知,NIP和esd1的最適處理濃度均為0.1 μg/L(見表1).同時(shí)表明,esd1對KT-30更為敏感.

2.5 外源脫落酸對水稻葉片中w(葉綠素a∶葉綠素b)的影響

從圖1(i)和圖1(j)中可知，NIP葉片經(jīng)濃度為30 mg/L的ABA處理時(shí)，效果最好，w(葉綠素a∶葉綠素b)呈上升趨勢，其余濃度處理的水稻葉片中w(葉綠素a∶葉綠素b)雖呈下降趨勢，但下降趨勢逐漸減緩.esd1的水稻葉片中的w(葉綠素a∶葉綠素b)變化趨勢與NIP基本相同，但最適處理濃度為100 mg/L(見表1).總的來說，2組水稻經(jīng)激素處理后，w(葉綠素a∶葉綠素b)下降減緩，但對NIP更為明顯，表明esd1對ABA低敏感.

2.6 外源水楊酸對水稻葉片中SOD活性的影響

從圖1(k)和圖1(l)中可知，經(jīng)各濃度梯度SA處理，esd1水稻葉片的SOD值在前24 h內(nèi)幾乎無明顯變化.大部分濃度的SA在處理24 h后，SOD值有小幅度的升高.且當(dāng)處理濃度為2 μmol/L時(shí),SOD變化最顯著，在處理后12 h內(nèi)就有較明顯的升高，雖然在處理36 h后水稻葉片SOD值有一個(gè)明顯的下降過程，但在72 h后逐漸上升.NIP水稻葉片的SOD值在經(jīng)SA處理后仍呈下降趨勢，但是在處理24 h后各組均呈上升趨勢，其中處理濃度為0.1 μmol/L的水稻葉片的SOD值上升趨勢最明顯，在處理12 h之后就有一個(gè)較明顯的上升，但發(fā)現(xiàn)esd1葉片中SOD值呈下降趨勢.因此，野生型NIP最適處理濃度為0.1 μmol/L，而esd1最適濃度為2 μmol/L(見表1).從各組SOD變化的程度分析，可以認(rèn)為esd1對SA更加敏感.

3 討 論

植物的衰老是一個(gè)極其復(fù)雜的生物學(xué)過程，是植物生命周期中必然經(jīng)歷的階段，除受遺傳因素調(diào)控外，外部環(huán)境因素也會(huì)影響其正常的生長發(fā)育.其中，植物激素在調(diào)控植物衰老的進(jìn)程中起著很重要的作用，因此，對外源激素影響植物衰老機(jī)理的研究是不可或缺的.在本試驗(yàn)中，通過不同濃度的多種外源激素噴施水稻葉片的方法，來探究外源激素在影響水稻生長發(fā)育的影響作用.這為植物激素在調(diào)控水稻葉片衰老的研究提供一定的參考價(jià)值.

本研究中，在未噴施GA3時(shí)水稻葉片的MDA含量隨著時(shí)間的推移而逐漸上升，而噴施GA3后對應(yīng)品種的葉片內(nèi)MDA含量總體呈下降趨勢，暗示了GA3能通過某些生化途徑來抑制水稻葉片中MDA的產(chǎn)生，從而延緩葉片衰老.與NIP相比，esd1表現(xiàn)出對GA3更敏感，推測esd1突變體影響了GA的信號(hào)傳導(dǎo)途徑.生長素對葉片衰老的調(diào)節(jié)作用通過應(yīng)答和編碼生長素相應(yīng)因子或吲哚乙酸蛋白來實(shí)現(xiàn)，生長素在葉片衰老過程中可以有效抑制衰老基因表達(dá)，從而維持細(xì)胞活性來延緩衰老[22].本研究通過噴施2,4-D可以提高水稻葉片中w(葉綠素a∶葉綠素b)，esd1在低處理濃度下就表現(xiàn)出異常敏感反應(yīng)，說明esd1對2,4-D更敏感.推測esd1突變體衰老相關(guān)基因的表達(dá)升高而表現(xiàn)出早衰表型，外源噴施2,4-D可以有效延緩衰老的發(fā)生.通過噴施KT-30來統(tǒng)計(jì)分析葉片中MDA含量的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在很低濃度處理下esd1突變體就表現(xiàn)出葉片中MDA含量急劇下降的敏感反應(yīng).推測這可能與esd1突變的分子機(jī)制有關(guān)，導(dǎo)致其對KT-30的敏感反應(yīng)增強(qiáng).在灌漿初期外源噴施不同濃度ABA，發(fā)現(xiàn)在低濃度處理下對w(葉綠素a∶葉綠素b)影響不大，在較高濃度下處理，發(fā)現(xiàn)NIP和esd1w(葉綠素a∶葉綠素b)呈下降趨勢，由此推斷，外源ABA能促進(jìn)葉片的衰老，會(huì)推進(jìn)庫源轉(zhuǎn)運(yùn)的進(jìn)程.在水稻三葉期時(shí)噴施SA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NIP和esd1的SOD含量均呈上升趨勢，但SOD變化趨勢與實(shí)驗(yàn)預(yù)期存在差異，這可能是因?yàn)槲覀兲幚淼乃咎幱谌~期，胚中的營養(yǎng)物質(zhì)充分，足以保證水稻生長到五葉期，因此葉片還未呈現(xiàn)出衰老狀態(tài)，SOD含量并不會(huì)產(chǎn)生特別明顯的變化.另外，本研究也進(jìn)行了噴施GR24處理，發(fā)現(xiàn)與衰老相關(guān)的生理指標(biāo)沒有太大的變化，這可能與噴施的時(shí)期有關(guān).據(jù)陳小娟研究發(fā)現(xiàn)，獨(dú)腳金內(nèi)酯位于生長素的下游，其作為第二信使，對水稻的衰老的調(diào)控需要較長一段時(shí)間來體現(xiàn)[23].由于受種種條件所限，我們所選的實(shí)驗(yàn)周期較短，可能不足以體現(xiàn)獨(dú)腳金內(nèi)酯對延緩水稻衰老所起的作用效果.然而考慮到外源激素對水稻葉片衰老作用的延緩具有時(shí)效性[24]，仍要經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)才能得出合適的處理周期，并得到更令人滿意的結(jié)果.

整體上看，噴施外源激素對延緩水稻衰老具有一定的可行性效果，并且esd1對多種外源激素更為敏感.這些結(jié)論可以為水稻葉片發(fā)生早衰的品種延緩衰老提供理論支持.下一步筆者將通過分子水平上探究多種植物激素是如何參與調(diào)控植物葉片衰老的，分析esd1基因參與的信號(hào)通路，初步探明水稻早衰發(fā)生的分子機(jī)制和激素間的遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò).

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