傣藥“擺埋丁別”生藥學鑒別研究

楊妮娜 徐安順 趙應紅 王元忠

(1.西雙版納傣族自治州傣醫(yī)醫(yī)院，云南 景洪 666100；2.中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所云南分所，云南 景洪 666100； 3.云南省農(nóng)業(yè)科學院藥用植物研究所，云南 昆明 650200)

目前市場上藥材來源比較復雜，偽劣品經(jīng)常出現(xiàn)；不適宜的生境、栽培、采收、炮制、儲存、生產(chǎn)、包裝、運輸方法等均可導致藥材有效成分變化而影響其臨床療效；傣藥資源地域性明顯，蘊藏量有限，大面積毀林種茶、橡膠、香蕉致使多種野生資源蘊藏量急劇減少，甚至到了瀕危或易危的程度，如傣百解、荷包山桂花、古山龍、蓬萊葛等。鑒于此，積極地開展傣藥生藥學研究，確保基源的真實性、品質(zhì)的優(yōu)良性、資源的可持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要。

燈臺葉傣名“擺埋丁別”，系夾竹桃科(Apocynaceae)雞骨常山屬糖膠樹(Alstonia scholaris (L.) R. Br.)的干燥葉，能清火解毒、消腫止痛、止咳化痰，用于治療“攏達兒”(腮腺、頜下淋巴結(jié)腫痛)、“農(nóng)桿農(nóng)暖”(乳房腫痛)、“乃多皇賣唉列特來”(肺熱咳嗽痰多)、“兵洞飛暖”(瘡瘍疔腫)[1]。其主產(chǎn)于云南、廣西、廣東、湖南、海南、福建、臺灣及東南亞各國，生長于海拔1300m以下的丘陵山地疏林中、水溝邊[1,2]，富含生物堿、萜類、黃酮等成分，具有抗炎鎮(zhèn)痛、止咳平喘、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血脂血壓、調(diào)節(jié)免疫等藥理活性[3-6]。燈臺葉為《云南省中藥材標準》(第七冊)所收載品種，該標準檢驗項目少，缺乏定量和特征性鑒別指標，無法全面評價該藥材質(zhì)量優(yōu)劣[7]，故本研究從基源、性狀、顯微特征、光譜特征、薄層鑒別、定量分析等方面對燈臺葉進行生藥學研究，旨在為燈臺葉質(zhì)量標準提升、完善提供科學依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器：TS-12D+生物組織自動脫水機、QP-生物組織切片機、CS-VI型攤片烤片機、BM-VIII生物組織包埋機(孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司)，80i Nikon 生物顯微鏡(日本尼康)，UV-2550雙通道紫外-可見分光光度計(日本島津)，F(xiàn)rontier型傅里葉變換紅外光譜儀(美國Perkin Elmer公司)，YP-2壓片機(上海山岳科學儀器有限公司)，1260型高效液相色譜儀(美國Agilent)，GZX-9032MBE數(shù)字鼓風干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)，電子分析天平(美國奧豪斯公司)。

1.2 試藥

1.2.1 試劑：組織標本固定液(無錫市江原實業(yè)技貿(mào)總公司)，TO型生物制片透明劑(廣州市中南化工儀器有限責任公司經(jīng)銷)，固綠FCF(國藥集團化學試劑有限公司)，番紅花紅T(天新精細化工開發(fā)中心)，丁香油(國藥集團化學試劑有限公司)，分析純甲醛溶液(汕頭市達濠精細化學品有限公司)，中性樹膠(中國上海標本模型廠)，甲醇、乙醇、乙酸乙酯、石油醚、甲酸、三氯甲烷、丙酮等分析純試劑(天津風船化學試劑科技有限公司)，分析純溴化鉀(成都化學試劑廠)，色譜級乙腈、甲醇(色譜純美國fisher)。

1.2.2 對照品：燈臺葉對照藥材(中國食品生物制品鑒定研究所)，鴨腳樹葉堿、蘆丁(中國食品藥品鑒定研究院)，熊果酸、齊墩果酸(上海源葉生物科技有限公司)。

1.2.3 樣品信息：本研究所用樣品采自云南西雙版納，經(jīng)西雙版納傣族自治州傣醫(yī)醫(yī)院趙應紅傣藥主任藥師鑒定為夾竹桃科植物糖膠樹的葉子，具體信息見表2。

2 方法與結(jié)果

2.1 原植物鑒別：喬木，高7m，直徑28cm。枝輪生，皮孔密集，具白色乳汁，無毛。葉輪生，每輪3～10片，倒披針形或匙形，倒卵狀長圓形、偶見橢圓形或長圓形，長7～28cm，寬2～11cm，革質(zhì)，無毛，基部楔形，頂端通常圓鈍或微凹，偶見急尖或漸尖；側(cè)脈密生而平行，25～50對，近水平橫出至葉緣連接；葉柄長1.0～3.0cm。聚傘花序頂生，被柔毛，總花梗長4～7cm；花梗長約1mm；花冠白色，高腳碟狀，花冠筒長6～10mm，中部以上膨大，內(nèi)面有柔毛，裂片在花蕾期或裂片基部向左旋轉(zhuǎn)覆蓋，長圓形或卵狀長圓形，長2～4mm，寬2～3mm；雄蕊長圓形，長約1mm，著生在花冠筒膨大處，內(nèi)藏；子房2心皮，離生，密被柔毛，花柱絲狀，長4.5mm，柱頭棒狀，頂端2深裂；花盤環(huán)狀。蓇葖2，細長，線形，長20～57cm，外果皮近革質(zhì)，灰白色，直徑2～5mm；種子紅棕色，長圓形，兩端有紅棕色長緣毛，緣毛長1.5～2cm?；ㄆ?～11月，果期10月至次年4月[8]。

2.2 性狀鑒別：本品呈倒卵狀長圓形或長圓形，長約12～26cm，寬4～6cm?；揖G色，全緣，上表面色深且具有光澤，下表面顏色較淺無光澤；側(cè)脈40～50條，近平行，于邊緣處連接。革質(zhì)。氣微，味微苦。以葉厚、色灰綠者為佳。

2.3 顯微鑒別

2.3.1 莖橫切面組織結(jié)構(gòu)：燈臺樹嫩莖橫切片觀可見木栓細胞數(shù)列，皮層、形成層、韌皮部散在分布多數(shù)草酸鈣方晶和簇晶。中柱鞘有多數(shù)成片的纖維群，維管束雙韌型，木質(zhì)部導管單個徑向。髓部寬廣，細胞呈現(xiàn)類圓形，見圖3。

2.3.2 葉橫切面組織結(jié)構(gòu)：葉橫切面觀可見表皮外有較厚角質(zhì)層，主脈上下表皮內(nèi)部均分布有厚角組織。薄壁細胞中含草酸鈣方晶及簇晶。柵欄組織由1～2列細胞構(gòu)成，延伸至中脈厚角組織處。海綿組織中散在分布較多草酸鈣方晶及簇晶。中脈維管束雙韌型，呈U型或V型排列。木質(zhì)部導管單個徑向排列。韌皮部可見乳管分布，外方有纖維斷續(xù)環(huán)繞，周圍細胞中有草酸鈣方晶形成晶鞘[9]，見圖4。

2.3.3 莖粉末特征：本品粉末呈黃綠色。表皮細胞多角形增厚；木薄壁細胞呈長方形，細胞壁有連珠狀增厚；草酸鈣方晶較多，棱角銳尖；偶見石細胞。纖維長梭形，胞腔較大；可見網(wǎng)紋、具緣紋孔及梯形導管。分泌組織中可見黃色物質(zhì)。

2.3.4 葉粉末特征：本品粉末黃綠色。上表皮細胞呈多角形，垂周壁較平略增厚，可見線狀角質(zhì)紋理；草酸鈣方晶較多偶見簇晶，直徑25～35μm，棱角銳尖。纖維長梭形，直徑15～45μm，壁不甚厚，胞腔較大，可見晶鞘纖維。導管為網(wǎng)紋、螺紋，直徑5～35μm。木薄壁細胞長方形，長條形，長75～125μm，寬15～45μm，壁呈鏈珠狀增厚，紋孔明顯。乳管內(nèi)含黃色顆粒狀物。

2.4 薄層鑒別

2.4.1 生物堿類成分薄層鑒別：精密稱取不同批次燈臺葉粉末2 g，加pH=2的鹽酸水40 mL，搖勻，超聲30 min，取出，干燥的玻璃漏斗過濾，濾液用濃氨試液緩慢調(diào)至顏色變?yōu)闇\棕色有絮狀沉淀析出(pH7～8)。用三氯甲烷20 mL萃取，取氯甲烷層，水浴蒸干，殘渣加甲醇1 ml溶解作為供試品溶液。同法制成對照藥材溶液。精密稱取鴨腳樹葉堿適量，配制成0.5 mg/mL對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》一部附錄)試驗，吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷～甲醇(9：1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以改良碘化鉍鉀試液，供試品色譜中，在與對照品色譜和對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的橘黃色斑點。結(jié)果見圖7。

2.4.2 萜類成分薄層鑒別：精密稱取燈臺葉粉末2g，加石油醚(30-60℃)40mL，振蕩器上慢搖1h，取下，干燥玻璃漏斗過濾，棄去濾液，殘渣揮干溶劑，加甲醇30mL，超聲30 min，搖勻，干燥玻璃漏斗過濾，續(xù)濾液做為供試品溶液。同法制成燈臺葉對照藥材溶液。同法制成對照藥材溶液。精密稱取熊果酸對照品適量，配制成0.5 mg/mL對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》一部附錄)試驗，取供試品溶液、對照藥材溶液、對照品溶液各10μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷：甲醇(9：1)為展開劑，展開，取出，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃下烘烤15min，取出，供試品色譜中，在與對照品色譜和對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的紫紅色斑點。見圖8。

2.4.3 黃酮類成分薄層鑒別：取燈臺葉粉末2 g，加甲醇20 mL，超聲提取30 min，干燥玻璃濾器過濾，濾液作為供試品溶液。另去燈臺葉對照藥材粉末2 g，同法制成對照藥材溶液。精密稱取蘆丁對照品適量配制成1 mg/mL對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》四部附錄)試驗，吸取上述三種溶液各3 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(8：1：1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以AlCl3溶液，365 nm下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜和對照藥材色譜相應的位置上，顯相同顏色的黃色斑點。結(jié)果見圖9。

2.5 燈臺葉光譜鑒別

2.5.1 紫外可見光譜特征：精密稱取燈臺葉粉末0.0250 g于25 mL具塞試管中，加無水乙醇10 mL，稱定重量，室溫下超聲提取40 min，取出，靜置，再次稱定，無水乙醇補足損失重量，過濾，濾液作為供試品溶液。以無水乙醇為參比液，設定掃描波長235～800 nm，狹縫寬度1.0 nm，采樣間隔0.2 nm，掃描紫外-可見光譜圖，每份樣品平行測定3次，取平均光譜。將原始光譜圖進行扣背景8點平滑處理，以消除基線漂移和光譜噪音干擾。

燈臺葉UV-Vis光譜峰數(shù)目較多，涵蓋信息量較大。根據(jù)吸收峰位置及變化的幅度可以將光譜分為三段，第一段為235～400 nm，第二段為400～500 nm，第三段為500～800 nm。第一段中吸收峰數(shù)目最多，主要集中在270 nm、287 nm和325 nm，可能是醛酮n→π*躍遷產(chǎn)生的R帶或芳香環(huán)精細解構(gòu)B帶在助色團影響下紅移的結(jié)果，推測可能與燈臺葉中生物堿和黃酮類成分有關(guān)。同時第一段中吸光度及其變化幅度最大，體現(xiàn)出不同月份光譜圖的指紋特征。第二段吸收峰較少主要分布在410 nm和464 nm附近，吸光度及其變化較第一段減小。第三段圖譜中不同樣品吸光度及變化無明顯差異，但在665 nm處均有一個較大吸收峰，可能是葉綠素的吸收峰。

2.5.2 紅外光譜特征：精密稱定樣品0.0020 g和溴化鉀0.1000 g于瑪瑙研缽中，充分研磨混勻后壓片，每批樣品平行三份。溴化鉀壓片置于紅外光譜儀中，設定掃描范圍為4000～400 cm-1，累計掃描次數(shù)16，分辨率4 cm-1，掃描后獲取樣品原始紅外光譜。實驗過程中及時扣除CO2和水分的背景干擾。原始圖譜經(jīng)過自動基線校正、自動平滑、縱坐標歸一化處理。

燈臺葉樣品在3500～2800 cm-1和1800～500 cm-1波段呈現(xiàn)指紋特征。吸收峰主要集中在3345、2925、2855、1733、1622、1318、1248、1069、778 cm-1。3345 cm-1吸收峰強而寬為締合O-H伸縮振動吸收；2925 cm-1和2855 cm-1中等強度吸收峰歸屬為飽和C-H鍵的伸縮振動，即-CH2-的不對稱伸縮振動和對稱伸縮振動吸收峰；1733 cm-1附近中等強度吸收峰為醛羰基藍移的結(jié)果，歸屬為酯羰基的伸縮振動吸收；1622 cm-1為C=C伸縮振動；1318 cm-1處弱吸收為O-H鍵的面內(nèi)彎曲振動；1248 cm-1處中等強度吸收峰為C-O鍵的伸縮振動；1069 cm-1處較強吸收為C-O-C(醚鍵)伸縮振動；778 cm-1附近弱吸收歸屬為=C-H的面外彎曲振動。

2.6 含量測定

2.6.1 線性關(guān)系考察：精密稱取鴨腳樹葉堿、熊果酸、齊墩果酸對照品各16.1 mg、10 mg、12 mg，于10 mL容量瓶中，加色譜級甲醇溶解后定容到刻度，配制成濃度為1.61 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、1.2 mg·mL-1的對照品溶液。分別精密吸取鴨腳樹葉堿、熊果酸、齊墩果酸對照品溶液，加甲醇稀釋至不同濃度，制成單標溶液，由低至高依次進樣，以濃度(mg·mL-1)為橫坐標(x)，峰面積為縱坐標(y)進行線性回歸，得回歸方程、相關(guān)系數(shù)(R2)、檢測限(LOD，S/N=3)、定量限(LOQ，S/N=10)。

表1 鴨腳樹葉堿、熊果酸、齊墩果酸線性關(guān)系考察結(jié)果

2.6.2 精密度、重復性、穩(wěn)定性考察：取同一批次樣品制備供試溶液，連續(xù)進樣6次，計算每個成分6次峰面積的相對標準偏差，鴨腳樹葉堿RSD為0.08%，熊果酸RSD為0.13%，齊墩果酸RSD為0.16%，結(jié)果表明儀器精密度良好。平行稱取同一樣品6份，制備供試溶液后測定，以每個成分6次峰面積RSD為參考，鴨腳葉堿0.29%，熊果酸0.64%，齊墩果酸0.53%，表明方法重復性較好。取同一批次樣品，分別制備供試品溶液放置0，2，4，6，8，12，24，48 h后測定，每個成分8次進樣峰面積RSD在0.29%-1.82%，表明樣品供試液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.3 鴨腳樹葉堿含量測定：分別取各批次樣品1 g，精密稱定，置潔凈試管中，加pH=2的鹽酸水溶液20 mL，超聲提取30 min，取出，干燥玻璃漏斗過濾，濾液用氨水調(diào)至pH=8，轉(zhuǎn)移至干燥的分液漏斗中，三氯甲烷萃取兩次，每次20 mL，合并三氯甲烷層，水浴揮干，殘渣加色譜級甲醇溶解，定容于5 mL容量瓶。采用Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18色譜柱(250×4.6 mm, 5 μm)，以乙腈-0.1%氨水(40：60)為流動相，流速1.0 mL·min-1，分別設置柱溫30 ℃，檢測波長287 nm，進樣量10 μL。

2.6.4 熊果酸、齊墩果酸含量測定：精密稱定樣品0.1 g于潔凈具塞試管中，加入甲醇2 mL，混勻，超聲提取30 min，取出，提取液用0.22 μm微孔濾膜過濾，濾液備用。Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18色譜柱(250×4.6 mm, 5 μm)，流動相為甲醇-0.1%甲酸水(88：12)，流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，檢測波長210 nm，進樣量10 μL。

表2 不同批次樣品中鴨腳樹葉堿、熊果酸、齊墩果酸含量測定結(jié)果(mg·g-1)

3 結(jié)論

燈臺葉原植物形態(tài)、藥材形狀、不同器官顯微組織結(jié)構(gòu)特征明顯；薄層色譜分離度較好且斑點清晰；紫外可見光譜、傅里葉紅外光譜吸收峰和光譜特征明顯；建立的鴨腳樹葉堿、熊果酸、齊墩果酸含量測定方法精密度、穩(wěn)定性和重復性良好，為該藥材的質(zhì)量控制與資源評價提供了堅實的科學基礎。

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