抗生素耐藥基因污染研究進(jìn)展

武中庸，趙吳靜，侯 曉，蒲萬(wàn)霞

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院新獸藥工程重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，甘肅省新獸藥工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730050）

抗生素耐藥性與抗生素的使用相生相伴。某些環(huán)境微生物本身攜帶或者能夠從其他菌株獲得某些特定基因，這些基因能夠通過(guò)編碼具有不同功能的蛋白質(zhì)以達(dá)到去除抗生素效應(yīng)的目的，其被稱為抗生素耐藥基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）［1］。Rysz 等于 2004 年將ARGs歸納為一類新型環(huán)境污染物，Pruden等于2006年正式明確提出這一概念，從此ARGs愈受關(guān)注。ARGs可分為“內(nèi)源性耐藥基因”和“外源性耐藥基因”。內(nèi)源性耐藥基因主要指本身存在于基因組上的耐藥基因原型、準(zhǔn)耐藥基因及平時(shí)未表達(dá)的耐藥基因，其能夠隨機(jī)突變或通過(guò)外部選擇壓力表達(dá)耐藥性。D’Costa等［2］從北極3萬(wàn)年凍土中發(fā)現(xiàn)，對(duì)β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類和糖肽類等抗生素具有抗性的ARGs，且萬(wàn)古霉素耐藥蛋白結(jié)構(gòu)和功能與現(xiàn)代變體極為相似，這表明某些類型ARGs早就存于自然界，而不是現(xiàn)代使用抗生素造成的。外源性耐藥基因主要指ARGs在外在壓力下選擇性遷移到敏感菌中，從而使得敏感菌獲得耐藥性。

1 ARGs多重抗性的形成

ARGs可隨抗性細(xì)菌從糞便進(jìn)入環(huán)境，并通過(guò)水平轉(zhuǎn)移機(jī)制（Horizontal gene transfer，HGT）進(jìn)入各種環(huán)境土著菌，其擴(kuò)散效率可能超過(guò)親代菌株［3］；同時(shí)，攜帶ARGs的裸露DNA可在菌株死亡后釋放進(jìn)入環(huán)境中且長(zhǎng)期存在。畜禽養(yǎng)殖因?yàn)楫a(chǎn)業(yè)的特殊性，抗生素的大量使用不可避免，因此也極大地刺激了ARGs的發(fā)展，給予了ARGs發(fā)展的外在選擇壓力。同時(shí)，因?yàn)樾笄蒺B(yǎng)殖人員關(guān)于抗生素污染的意識(shí)單薄和畜禽糞便處理措施匱乏，大部分畜禽糞便未經(jīng)處理或者只經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單處理就進(jìn)入環(huán)境，尤其是土壤環(huán)境；動(dòng)物腸道內(nèi)和糞便中含有豐富的抗性細(xì)菌和ARGs，因此進(jìn)入農(nóng)田土壤、水源、地下水等周邊環(huán)境，極大地增加了周邊環(huán)境的ARGs豐度及土著耐藥菌的產(chǎn)生。未經(jīng)處理的畜禽糞便大量輸入環(huán)境，對(duì)環(huán)境中細(xì)菌的耐藥水平起到了重要的作用，其可誘導(dǎo)多重耐藥基因在細(xì)菌中組合，細(xì)菌呈多重耐藥性。目前，細(xì)菌多重耐藥現(xiàn)象已引起各方日益關(guān)注。典型的多重耐藥致病菌包括：泛耐藥鮑氏不動(dòng)桿菌（Pandrugresistant Acinetobacter baumannii，PRAB）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）、碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌（Carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa，CRPA）、攜NDM-1（New Delhi metallo-β-lactamase-1）耐藥基因菌、質(zhì)粒介導(dǎo)的黏菌素耐藥基因mcr-1等［4］。細(xì)菌中的多重耐藥基因常以耐藥基因盒或基因島的方式存在。中國(guó)學(xué)者發(fā)現(xiàn)，豬源 Escherichia coli的Ⅰ型整合子上 aadA1、blaP1a-aadA2-ereA、aadA2、dfrA1-aacA4-catB3、aadA23B、dfrA1-orfC和dfrA1-aadA1等耐藥基因均存在于耐藥基因島上［5］。Neyra 等［6］研究發(fā)現(xiàn)，金黃色葡萄球菌對(duì)甲氧西林的耐藥率14.3%，其多重耐藥率37.1%。

2 ARGs分類

根據(jù)抗生素抑菌機(jī)制的不同可以將抗生素分為β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、氨基糖苷類、磺胺類、糖肽類、喹諾酮類、氯霉素類、大環(huán)內(nèi)脂類等大類，ARGs也可以根據(jù)抗生素類別的不同進(jìn)行分類，其分類情況詳見(jiàn)表1。

表1 不同抗生素類別耐藥基因

3 ARGs研究進(jìn)展

ARGs的形成與傳播，是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的內(nèi)在因素。隨著科技的發(fā)展和研究手段的不斷優(yōu)化，人們對(duì)細(xì)菌染色體和基因組的研究越發(fā)深入，各種ARGs不斷被發(fā)現(xiàn)，使人們對(duì)細(xì)菌耐藥性的形成機(jī)制也有了新的認(rèn)識(shí)。因ARGs傳播和調(diào)控過(guò)程在細(xì)菌基因組內(nèi)的復(fù)雜性，借由對(duì)ARGs的研究，對(duì)細(xì)菌基因組的研究也得以拓展和深入，而細(xì)菌基因組研究也會(huì)大大促進(jìn)了ARGs的研究進(jìn)程。

3.1 傳統(tǒng)ARGs的研究方法

傳統(tǒng)ARGs的研究方法主要為微生物培養(yǎng)鑒定方法，其主要步驟為：①目的樣品采集；②對(duì)目的樣品中細(xì)菌進(jìn)行分離純化鑒定，常采用適應(yīng)不同細(xì)菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基進(jìn)行菌株分離純化，以生化鑒定方法或者16S rRNA方法對(duì)菌株進(jìn)行種群鑒定，以盡量獲取培養(yǎng)菌株信息；③對(duì)分離細(xì)菌進(jìn)行抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)，以獲取菌株耐藥表型，抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)經(jīng)常測(cè)定菌株的藥物最低抑菌濃度（Minimal inhibitory concentration，MIC），通過(guò)MIC判定菌株的耐藥表型。得益于生物技術(shù)的飛速發(fā)展，ARGs的研究方法也取得了巨大進(jìn)步。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）是一種能夠根據(jù)已知目的基因進(jìn)行保守序列的引物設(shè)計(jì)，并以DNA合成基本原料，經(jīng)變性、退火、延伸過(guò)程在生物體外快速擴(kuò)增特定DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。但是，常規(guī)PCR擴(kuò)增方法具有較大缺點(diǎn)，其只能定性檢測(cè)耐藥基因存在與否。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR，RTQ-PCR）應(yīng)運(yùn)而生，有效解決了常規(guī)PCR擴(kuò)增方法只能定性檢測(cè)基因的問(wèn)題。該方法通過(guò)在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，以積累的熒光信號(hào)的量來(lái)實(shí)時(shí)對(duì)PCR進(jìn)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)，最后與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比進(jìn)行耐藥基因豐度的檢測(cè)。但是，普通PCR和RTQ-PCR均局限于已知序列耐藥基因檢測(cè)，其不能用于新基因的發(fā)現(xiàn)；且如需進(jìn)行大量基因檢測(cè)時(shí)具有較大的工作量。Popowska等［7］采用定量PCR研究了農(nóng)業(yè)土壤中四環(huán)素類、氨基糖苷類類和大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因的分布特征。

3.2 基因芯片檢測(cè)技術(shù)

20世紀(jì)80年代末發(fā)展起來(lái)的基因芯片技術(shù)克服了PCR方法樣品檢測(cè)量小的缺點(diǎn)，其采用集約化和平面處理，在固相載體上固定了數(shù)以百萬(wàn)計(jì)的DNA探針，通過(guò)將樣品與芯片探針雜交來(lái)檢測(cè)樣品中DNA序列。該方法適用于大量樣品的檢測(cè)并具有減小工作量和降低用時(shí)的特點(diǎn)?；蛐酒夹g(shù)主要從兩方面實(shí)現(xiàn)耐藥基因的檢測(cè)：①借助寡核苷酸芯片檢測(cè)基因組序列的亞型或突變位點(diǎn)；②以基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)藥物誘導(dǎo)基因表達(dá)的改變［8］。Bruant等［9］設(shè)計(jì)了檢測(cè)大腸桿菌毒力基因和耐藥基因的基因芯片，其可檢測(cè)致病菌株及其耐藥基因?；蛐酒捎糜谘芯凯h(huán)境微生物的群落結(jié)構(gòu)、代謝途徑、追蹤關(guān)鍵基因等方面。但是基因芯片也有一系列問(wèn)題需要解決，如：費(fèi)用過(guò)高，不合適普通臨床檢測(cè)；基因序列庫(kù)尚小，需加強(qiáng)建庫(kù)工作；基因芯片專利限制，不同公司專利權(quán)不同，需加強(qiáng)行業(yè)信息整合。

3.3 宏基因檢測(cè)方法

微生物純化培養(yǎng)方法對(duì)于研究細(xì)菌的耐藥性起到了重要作用，但傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法具有一定的局限性。澳大利亞學(xué)者Heinrich Winterberg首先觀察到細(xì)胞計(jì)數(shù)方法和平板計(jì)數(shù)方法得到的樣品中微生物總量存在巨大差異，因?yàn)榇嬖谟诃h(huán)境中的微生物絕大部分是不可培養(yǎng)的，傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法能培養(yǎng)的微生物僅占環(huán)境中微生物總量不到1%，環(huán)境中尚有大量的耐藥微生物被遺漏。

Pace于1985年第一次提出可以從環(huán)境中直接提取DNA來(lái)研究不可培養(yǎng)微生物的理念。1995年，Healy等對(duì)宏基因文庫(kù)成功地進(jìn)行了功能篩選，這為后續(xù)概念提出和實(shí)驗(yàn)完善提供了基礎(chǔ)。1998年，Handelsman等［10］正式提出了宏基因組學(xué)（Metageomics）的概念，即從環(huán)境中提取總DNA中用于進(jìn)行遺傳組成和功能研究。宏基因組學(xué)研究的發(fā)展跨越了傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)研究的瓶頸，讓人們重新認(rèn)識(shí)了環(huán)境中微生物群落的多樣性，極大地拓展了微生物學(xué)研究的思路和方法。宏基因組學(xué)研究微生物的主要方法包括3個(gè)過(guò)程：①環(huán)境樣品總DNA提取。DNA提取過(guò)程需根據(jù)樣品的不同特點(diǎn)選擇不同的提取方法，而不同的提取方法得到的提取結(jié)果也會(huì)有所差異，這也直接影響了后續(xù)試驗(yàn)［11］。②建立宏基因文庫(kù)并測(cè)序。測(cè)序時(shí)可通過(guò)不同專用平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序，但不同測(cè)序平臺(tái)得到的最終結(jié)果有所差異，目前常用的測(cè)序平臺(tái)有Illumina MiSeq和Illumina HiSeq平臺(tái)。③序列拼接與分析。理論上選擇合適的樣品總DNA提取方法并測(cè)得一定的測(cè)序深度后獲得的信息能夠全面反映樣品的遺傳信息，獲得微生物全基因組信息。宏基因組學(xué)主要分為功能宏基因組學(xué)和序列宏基因組學(xué)?？梢詫⑽粗退幓虻蔫b定歸為功能宏基因組學(xué)方向。目前，宏基因測(cè)序在環(huán)境菌群分析、腸道菌群分析、耐藥基因檢測(cè)鑒定方面發(fā)揮了重要作用。耐藥基因相關(guān)比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)有：SEED database“Resistance to antibiotics and toxic compounds”、Antibiotic Resistance Genes Database（http：//ardb.cbcb.umd.edu/）和 MetaGeneMark。

基于測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，尤其是二代測(cè)序應(yīng)用以來(lái)，宏基因組方法在環(huán)境細(xì)菌耐藥性上的應(yīng)用研究得到了充分體現(xiàn)［12］。Chambers 等［13］通過(guò)宏基因組學(xué)測(cè)序方法發(fā)現(xiàn)，奶牛糞便中的β-內(nèi)酰胺類耐藥基因因?yàn)轭^孢類抗生素的使用而得到富集。有學(xué)者通過(guò)大量宏基因測(cè)序數(shù)據(jù)來(lái)比較分析不同來(lái)源ARGs的組成，確定了目前已知大部分ARGs在不同環(huán)境的分布規(guī)律［14］。Fang等［15］發(fā)現(xiàn)，蔬菜地土壤施用雞糞后能使耐藥菌和耐藥基因富集，其檢測(cè)到22大類ARGs和46種攜帶耐藥基因的潛在致病菌。

3.4 微生物單細(xì)胞基因組技術(shù)

微生物單細(xì)胞基因組學(xué)是在宏基因組學(xué)后發(fā)展起來(lái)的能夠有效獲取無(wú)法人工培養(yǎng)微生物基因信息的新技術(shù)［16］。目前，環(huán)境微生物研究中主要將其應(yīng)用于探索未被常規(guī)技術(shù)或宏基因組技術(shù)探測(cè)到的功能基因、發(fā)現(xiàn)豐度極小的未培養(yǎng)微生物或者研究微生物細(xì)胞生命進(jìn)化過(guò)程等［17］。微生物單細(xì)胞基因組技術(shù)包括單細(xì)胞獲取、全基因組擴(kuò)增、全基因組測(cè)序以及數(shù)據(jù)分析等步驟。微生物單細(xì)胞獲取常用的方法主要有：有限稀釋、流式細(xì)胞分選、光鑷抓取、顯微操作和微流控芯片等，各種方法均有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，具體使用時(shí)需按實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇。單個(gè)微生物細(xì)胞內(nèi)含有很少量的DNA，需要使用特殊擴(kuò)增方式將單細(xì)胞基因組從飛克級(jí)別擴(kuò)增到納克至微克級(jí)別才可用于后續(xù)分析［18］。Rinke 等［19］對(duì) 9 600 個(gè)環(huán)境微生物單細(xì)胞進(jìn)行全基因組擴(kuò)增和部分細(xì)胞測(cè)序，獲得了201個(gè)未培養(yǎng)的細(xì)菌細(xì)胞及古菌，揭示了微生物之間的生物關(guān)系及其潛在代謝能力，并發(fā)現(xiàn)了新的嘌呤合成途徑。微生物單細(xì)胞基因組技術(shù)在探測(cè)新型微生物或基因方面具有巨大的潛力，但是因?yàn)榧夹g(shù)發(fā)展原因，該技術(shù)使用成本高昂，不適用于常規(guī)檢測(cè)。

3.5 ARGs消除方法

目前，抗生素濫用導(dǎo)致的環(huán)境耐藥菌增多，ARGs的轉(zhuǎn)移已經(jīng)成為不爭(zhēng)的事實(shí)，由此所引發(fā)的生態(tài)環(huán)境問(wèn)題和人員健康問(wèn)題也不斷得到人們關(guān)注。作為一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，我國(guó)畜禽產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展，畜禽糞便產(chǎn)量連創(chuàng)新高，隨糞便排出的抗生素量和由此誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗性基因?qū)Νh(huán)境造成的污染也越來(lái)越嚴(yán)重。為了降低環(huán)境中抗生素殘留水平以及遏制抗性基因的傳播擴(kuò)散，必須采取有力措施，防止抗生素和抗性基因污染的進(jìn)一步蔓延和惡化。3.5.1抗生素降解方法 抗生素自發(fā)現(xiàn)以來(lái)對(duì)控制人類疾病發(fā)揮了重要的作用，其同時(shí)也被用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)，為人類畜產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展做出了巨大貢獻(xiàn)。然而，抗生素在全球范圍內(nèi)的濫用情況也十分嚴(yán)重，同時(shí)因其只有少量部分能被機(jī)體吸收，大部分通過(guò)代謝途徑排出體外進(jìn)入環(huán)境，由此引發(fā)的一系列環(huán)境問(wèn)題及最終的對(duì)人類健康的影響問(wèn)題也越來(lái)越受到人們的關(guān)注。加強(qiáng)抗生素降解方式的研究迫在眉睫。

自然環(huán)境是抗生素的受納體，同時(shí)也是抗生素降解的促進(jìn)體，但不同環(huán)境對(duì)于抗生素的降解作用有所不同［20］。光照是促進(jìn)抗生素降解作用的重要因素。有研究表明，充足光照條件下，3 h內(nèi)四環(huán)素、紅霉素和土霉素的降解率分別可以達(dá)到66.87%、92.80%和90.55%［21］。有些抗生素本身為水溶性，極易溶于水，這在一定條件下也促進(jìn)了抗生素的水解。在適宜條件（25℃，pH=7）下，青霉素、頭孢西丁和頭孢噻吩的半衰期在5.3～27 d范圍內(nèi)［22］。微生物降解也是去除環(huán)境中殘留抗生素的有效方式，如添加選擇性有益降解菌劑對(duì)于去除四環(huán)素類抗生素殘留有很大效果［23］。堆肥處理是一種去除畜禽糞便中抗生素的有效手段。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，堆肥處理能夠去除糞便中殘留抗生素的50%～70%［24］。堆肥處理過(guò)程中處理好溫度和氧氣條件有利于更好地去除糞便中抗生素殘留［25］。Arikan 等［26］發(fā)現(xiàn)，55℃條件下堆肥處理能夠去除99%的金霉素，但是無(wú)溫控堆肥僅有49%的去除率。

3.5.2 ARGs去除方法 ARGs去除與抗生素降解過(guò)程有一定相似之處，光照、溫度和微生物群落結(jié)構(gòu)等均可以影響ARGs的去除。有研究表明，ARGs降解過(guò)程可以因?yàn)楣庹窄h(huán)境而加速［27］。ARGs存在于微生物細(xì)胞內(nèi)，不同微生物對(duì)于ARGs具有一定的耐受性，因此微生物群落的組成能夠在一定程度上影響ARGs的含量，微生物菌群類型能夠促使ARGs發(fā)生變化［28］。厭氧消化和好氧堆肥是畜禽糞便處理的主要工藝，這兩種方式均對(duì)ARGs的去除具有良好的效果。Cheng等［29］對(duì)養(yǎng)豬場(chǎng)內(nèi)不同工藝處理的廢水進(jìn)行了ARGs去除情況研究，發(fā)現(xiàn)厭氧消化處理能夠降低大部分ARGs含量，但其他處理方法影響不大。利用堆肥過(guò)程產(chǎn)生的高溫，可有效去除耐藥質(zhì)粒和 ARGs含量［30］。鄭寧國(guó)等［31］研究了高溫堆肥對(duì)豬糞來(lái)源ARGs的影響，結(jié)果表明，高溫堆肥對(duì)β-內(nèi)酰胺類ARGs和喹諾酮類ARGs具有一定去除能力，但大環(huán)內(nèi)酯類ARGs去除效果不明顯。

4 結(jié)語(yǔ)

抗生素濫用造成的環(huán)境污染問(wèn)題及ARGs在菌群之間的轉(zhuǎn)移引起的生態(tài)問(wèn)題已引起各國(guó)學(xué)者和民眾的高度關(guān)注。但環(huán)境中抗生素和ARGs的產(chǎn)生與存留是長(zhǎng)期積累的過(guò)程，且在短期內(nèi)不會(huì)消失。研究抗生素和ARGs的分布和行為特征等對(duì)人類采取合理對(duì)策減輕環(huán)境污染具有十分重要的意義。目前該領(lǐng)域的研究方向主要集中在對(duì)環(huán)境中抗生素和ARGs的監(jiān)測(cè)，對(duì)于環(huán)境中ARGs存留及其影響因素、傳遞機(jī)制及其影響因素、遷移轉(zhuǎn)化、人工去除等方面研究較少，未來(lái)針對(duì)ARGs研究建議從ARGs來(lái)源、傳遞機(jī)制、環(huán)境消除規(guī)律、遷移規(guī)律等方面進(jìn)行。

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