不同濃度β-巰基乙醇對(duì)6周齡杜泊羊卵母細(xì)胞發(fā)育能力的影響

毛楊毅，羅惠娣，王志武，趙 鵬，張冠武，李 俊，郭宏宇，張 麗，薛麗娜，黨文慶

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，太原 030032）

幼齡羊胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)始于20世紀(jì)70年代初。 Worthington 等［1］對(duì) 5～6 周齡的羔羊注射 HCG，發(fā)現(xiàn)羔羊卵巢上大量卵泡開始發(fā)育；Trounson等［2］對(duì)10～16周齡青年羔羊的卵母細(xì)胞進(jìn)行了研究，將卵母細(xì)胞在體外發(fā)育到囊胚。21世紀(jì)，科學(xué)家們對(duì)羔羊卵泡發(fā)育和體外受精技術(shù)進(jìn)行了更深入的研究，現(xiàn)已利用幼畜超排技術(shù)獲得幼齡羊的大量卵母細(xì)胞，經(jīng)體外成熟、受精、胚胎發(fā)育等一系列孵育、培養(yǎng)過程后生產(chǎn)出“試管羊”［3-12］。但是，在幼齡羊胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)體系中，一直存在卵母細(xì)胞繼續(xù)發(fā)育能力差及卵母細(xì)胞質(zhì)成熟不充分的問題［13-14］。為此，研究者模仿體內(nèi)卵母細(xì)胞成熟環(huán)境條件，在成熟液中添加胎牛血清（FBS）、谷胱甘肽（GSH）、促卵泡素（FSH）、17β-雌二醇（17β-E2）、促黃體素（LH）、生長因子（IGF-1、FGF、EGF）及能量物質(zhì)等，試圖通過改進(jìn)卵母細(xì)胞成熟液，達(dá)到提高幼齡羊卵母細(xì)胞的發(fā)育能力。韓巖等［15］進(jìn)行了谷胱甘肽對(duì)卵母細(xì)胞成熟及胚胎發(fā)育影響的研究；曹忻等［16］進(jìn)行了血管內(nèi)皮生長因子對(duì)體外成熟綿羊卵母細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化影響的研究。但迄今為止，未見有關(guān)不同濃度β-巰基乙醇成熟液對(duì)幼齡羊的卵母細(xì)胞發(fā)育能力影響的研究報(bào)道。因此，本試驗(yàn)進(jìn)行了不同濃度β-巰基乙醇成熟液對(duì)6周齡杜泊羊的卵母細(xì)胞發(fā)育能力影響的研究，為優(yōu)化幼齡羊胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)體系提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn) 試驗(yàn)于2014年10月7—25日在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物遺傳工程實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.1.2 試驗(yàn)羊 6只6周齡杜泊羊由晉中林山養(yǎng)殖合作社提供。

1.1.3 冷凍精液和發(fā)情羊血清（ESS） 杜泊羊冷凍精液和ESS自制。

1.1.4 主要激素、試劑及耗材 促黃體素（LH）、17β-雌二醇（17β-E2）、促卵泡素（FSH）及孕馬血清（PMSG），均購自北京綠欣農(nóng)牧科技有限公司；肝素鈉、牛血清白蛋白（BSA）、必需氨基酸（EAA）、非必需氨基酸（NEAA）等為索來寶（Solarbio） 品牌，M199、Hepes、β-巰基乙醇、NaCl、CaCl2·2H2O、NaHCO3等為 SIGMA 品牌，圓底玻璃試管、離心管、培養(yǎng)皿等為Corning品牌，四孔培養(yǎng)板為Nunc品牌，均購自山西賽奧生物科技有限公司。

1.1.5 主要儀器 超凈工作臺(tái)（SW-CJ-2FD）、離心機(jī)（Sigma 3-16PK）、體視顯微系統(tǒng)（OLYMPUS SZX10）、研究級(jí)倒置顯微系統(tǒng)（OLYMPUS IX71）、二氧化碳培養(yǎng)箱（SANYO MCO-5AC）等均由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物遺傳工程實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.6 主要手術(shù)器械及用品 手術(shù)刀、手術(shù)剪、止血鉗、注射器、75%酒精、碘酒等均購自山西省醫(yī)療器材公司。

1.1.7 培養(yǎng)液 采卵液：M199（含20 mmol/L Hepes，2%ESS，10 mg/mL 肝素鈉）；對(duì)照組成熟液：M199（含 20%ESS，10 μg/mL FSH，10 μg/mL LH，1 μg/mL 17β-E2）；試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組成熟液：在對(duì)照成熟液的基礎(chǔ)上，分別含50、70、100 μmol/L 的 β-巰基乙醇；獲能液：合成輸卵管液（SOF）（含 20 μg/mL肝素鈉）；受精液：SOF液（含 2%ESS）；受精卵發(fā)育液：SOF液（含 8 mg/mL BSA，2%EAA，1%NEAA）。

1.2 方法

1.2.1 6周齡杜泊羊的激素誘導(dǎo)和卵母細(xì)胞采集 采用Kelly等［3］的羔羊激素誘導(dǎo)方法，不同之處是PMSG注射量為每只羊300～350 IU；采用白佳樺［7］的活體采集卵母細(xì)胞方法。

1.2.2 ESS制備 從發(fā)情1 d羊的頸靜脈采集血液，4℃冰箱靜置20 h左右，吸取血清，56℃水浴滅活30 min，用0.22 μm濾器過濾后分裝，-20℃冷凍保存。

1.2.3 凍精制作 將活力0.8以上杜泊羊精液用常規(guī)干冰冷凍法制作顆粒凍精。

1.2.4 精子獲能 采用白佳樺［7］的精子體外獲能方法。

1.2.5 卵母細(xì)胞成熟 采用白佳樺［7］的卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的方法。不同之處是將采集的6只幼齡杜泊羊的A、B級(jí)COCs隨機(jī)分為4份，分別放入已在5%二氧化碳（38.5℃、飽和濕度）培養(yǎng)箱平衡2 h的四孔培養(yǎng)板孔中的對(duì)照組、試驗(yàn)Ⅰ組、試驗(yàn)Ⅱ組和試驗(yàn)Ⅲ組的成熟液里，礦物油覆蓋，繼續(xù)在5%二氧化碳培養(yǎng)箱里成熟培養(yǎng)24 h。

1.2.6 卵母細(xì)胞受精及受精卵培養(yǎng) 采用白佳樺［7］的卵母細(xì)胞體外受精和受精卵培養(yǎng)的方法。卵母細(xì)胞和精子共同孵育24 h左右，在顯微鏡下觀察卵裂情況；再將受精卵移至受精卵發(fā)育液培養(yǎng)12 h左右統(tǒng)計(jì)卵裂率；繼續(xù)培養(yǎng)4～5 d，觀察受精卵發(fā)育情況并統(tǒng)計(jì)桑葚胚率或囊胚率。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，χ2檢驗(yàn)方法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 幼齡杜泊羊激素誘導(dǎo)效果

由表1可知，6只6周齡杜泊羊共采集卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）489.0 枚，平均 81.5枚/只，其中 A、B級(jí)COCs 460.0枚，平均76.7枚/只。

由圖1可以看出，促性腺激素誘導(dǎo)后幼齡杜泊羊卵巢體積增大、紅漲，上面密布充滿卵泡液的卵泡。

表1 6周齡杜泊羊獲得卵母細(xì)胞情況 枚/只

圖1 6周齡杜泊羊激素誘導(dǎo)后卵巢上卵泡

2.2 不同濃度β-巰基乙醇成熟液對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育的影響

460.0 枚A、B級(jí)卵母細(xì)胞分別在不同濃度（0、50、70、100 μmol/L）β-巰基乙醇的對(duì)照組、試驗(yàn)Ⅰ、試驗(yàn)Ⅱ和試驗(yàn)Ⅲ組的成熟液中成熟后，經(jīng)體外受精孵育、受精卵發(fā)育培養(yǎng)等過程，卵母細(xì)胞的發(fā)育情況見表2及圖2～3。

由表2可知，試驗(yàn)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組的卵裂率、囊胚率均比對(duì)照組高（P＞0.05），其順序?yàn)樵囼?yàn)Ⅲ組＞試驗(yàn)Ⅱ組＞試驗(yàn)Ⅰ組＞對(duì)照組，100 μmol/L β-巰基乙醇組卵母細(xì)胞的卵裂率和囊胚率分別比對(duì)照組增加6.09個(gè)百分點(diǎn)和9.57個(gè)百分點(diǎn)，且囊胚率增加幅度大于卵裂率。表明卵母細(xì)胞成熟液中添加β-巰基乙醇可以提高幼齡羊卵母細(xì)胞的卵裂率和囊胚率，尤其囊胚率提高幅度更大。β-巰基乙醇濃度在100 μmol/L以內(nèi)，卵母細(xì)胞的卵裂率和囊胚率呈上升趨勢(shì)。

表2 不同濃度β-巰基乙醇成熟液卵母細(xì)胞發(fā)育情況

圖2 卵母細(xì)胞體外受精后的2～4細(xì)胞受精卵

圖3 卵母細(xì)胞體外受精后的囊胚

3 討論

幼畜胚胎體外生產(chǎn)的培養(yǎng)體系不僅直接影響卵母細(xì)胞成熟的程度和繼續(xù)發(fā)育的能力，而且直接影響幼畜胚胎體外生產(chǎn)的效率。白佳樺［7］、郭洪等［17］研究表明，在4～8周齡的蒙古羔羊、綿羔羊卵母細(xì)胞體外成熟液中添加100 μmol/L β-巰基乙醇，卵母細(xì)胞正常受精比例和囊胚率顯著提高，多精入卵比例明顯下降，且正常受精的比例與成年羊沒有顯著差異（P＞0.05）。權(quán)富生等［18］研究發(fā)現(xiàn)，在牛卵母細(xì)胞的顆粒細(xì)胞培養(yǎng)液中添加β-巰基乙醇，能提高活細(xì)胞率，且活細(xì)胞率隨著β-巰基乙醇濃度的增大而增加，在濃度為25 μmol/L時(shí)活細(xì)胞率最高。舒見洪等［19］研究顯示，在牛卵母細(xì)胞培養(yǎng)液中，添加100 μmol/L的β-巰基乙醇可顯著提高牛體外受精后胚胎的囊胚率以及囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)細(xì)胞數(shù)。蘭宗寶等［20］研究發(fā)現(xiàn)，在豬卵母細(xì)胞成熟液中添加β-巰基乙醇，可以提高胞質(zhì)內(nèi)谷胱甘肽濃度，而給受精卵提供適宜的細(xì)胞內(nèi)條件，可防止氧化損傷，有助于胚胎發(fā)育到囊胚。本試驗(yàn)表明，在6周齡杜泊羊的卵母細(xì)胞成熟液中添加（50、70、100 μmol/L）β-巰基乙醇，提高了卵裂率和囊胚率，尤其是囊胚率；試驗(yàn)Ⅲ組（含100 μmol/L β-巰基乙醇）的卵裂率（65.22%）和囊胚率（21.74%）最高，β-巰基乙醇濃度在100 μmol/L以內(nèi)，卵母細(xì)胞的卵裂率和囊胚率呈上升趨勢(shì)，且囊胚率增加幅度比卵裂率大，說明β-巰基乙醇有助于卵母細(xì)胞發(fā)育到囊胚。本研究結(jié)果與白佳樺［7］、郭洪等［17］、權(quán)富生等［18］、舒見洪等［19］、蘭宗寶等［20］的研究結(jié)果一致。其原因可能是β-巰基乙醇是一種低分子量的巰醇類化合物，能夠還原胱氨酸為半胱氨酸，半胱氨酸是合成谷胱甘肽（Glutathione，GSH）的底物。GSH存在于身體的每一個(gè)細(xì)胞，具有抗氧化和解毒作用。在卵母細(xì)胞發(fā)育過程中，它通過自由巰醇基團(tuán)（-SH）保護(hù)細(xì)胞發(fā)育、氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白質(zhì)合成和DNA復(fù)制等過程中所需功能蛋白質(zhì)、酶不被氧化，消除活性氧自由基（ROS）對(duì)其繼續(xù)發(fā)育的阻滯或延遲作用，加速受精卵中精子解聚和原核形成，減少孤雌激活和多精子受精的發(fā)生，提高正常受精的比例和受精卵的發(fā)育能力，增加囊胚率。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，成熟液中添加一定量的β-巰基乙醇，能夠提高6周齡杜泊羊卵母細(xì)胞的發(fā)育能力和受精卵質(zhì)量，β-巰基乙醇濃度在100 μmol/L以內(nèi)，卵母細(xì)胞的卵裂率和囊胚率呈上升趨勢(shì)。關(guān)于成熟液里β-巰基乙醇的最佳濃度，有待進(jìn)一步研究。

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