我國(guó)市售食用菌中金黃色葡萄球菌污染調(diào)查、耐藥性及其腸毒素基因檢測(cè)

黃嘉慧， 吳 詩(shī)， 張 峰，2， 張菊梅， 吳清平,*

(1.廣東省微生物研究所/省部共建華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510070；2.華南理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 廣東 廣州 510006)

金黃色萄球菌(Staphylococcusaureus)(簡(jiǎn)稱金葡菌)是引起細(xì)菌性食物中毒的重要食源性致病菌之一。在美國(guó)，金葡菌每年大約引起241 000例食物中毒[1]；在我國(guó)，20%～25%的細(xì)菌性食物中毒病例是由金葡菌引起的[2]。金葡菌的腸毒素(Staphylococcalenterotoxins，SEs)是引發(fā)細(xì)菌性食物中毒最主要的因素。這些腸毒素可耐高溫，不易失活，人體攝入幾微克便可導(dǎo)致食物中毒[3-4]。伴隨著抗生素的大量使用，細(xì)菌耐藥性問(wèn)題日趨嚴(yán)重，成為全球公共衛(wèi)生體系面臨的一個(gè)嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。研究表明，食品中的耐藥菌、耐藥基因可以通過(guò)食物鏈傳播到人，從而對(duì)食品安全和人類健康造成嚴(yán)重危害。食用菌是我國(guó)主要的農(nóng)產(chǎn)品，含有豐富的人體所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，廣受人們的青睞，然而，在食用菌培植、加工、貯藏、運(yùn)輸、銷售等過(guò)程中，均可能受到各種微生物的污染[5]。此前，國(guó)內(nèi)外并沒(méi)有食用菌中金葡菌污染情況等相關(guān)調(diào)查研究。為全面了解我國(guó)市售食用菌中金葡菌的污染情況，本研究擬對(duì)全國(guó)39個(gè)城市市售食用菌的金葡菌污染情況進(jìn)行系統(tǒng)調(diào)查，并在此基礎(chǔ)上對(duì)分離到的金葡菌進(jìn)行耐藥性和腸毒素基因分析，了解和掌握我國(guó)市售食用菌源中金葡菌的遺傳特性，希望為預(yù)防和控制我國(guó)食用菌中金葡菌的污染研究提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2011年7月至2016年6月，從全國(guó)39個(gè)城市的超市和集貿(mào)市場(chǎng)采集699份食用菌樣品，包括220份金針菇，114份平菇，110份香菇，95份杏鮑菇，160份其他類型的食用菌樣品(見(jiàn)表1)。采樣地點(diǎn)覆蓋我國(guó)大部分的省會(huì)城市和直轄市。采樣方法嚴(yán)格參考GB 4789.1—2010[6]中：4“樣品的采集規(guī)則”進(jìn)行。所有樣品在采集后立即放入無(wú)菌采集袋中，并用低溫采樣箱進(jìn)行保存，在24 h內(nèi)(依據(jù)距離的長(zhǎng)短)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后立即進(jìn)行樣品處理。

1.2 試劑與材料

10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯、生理鹽水、金葡菌顯色培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂(NA)培養(yǎng)基、Muller-Hinton(MH)培養(yǎng)基、腦心浸液營(yíng)養(yǎng)肉湯(BHI)、凍干血漿，廣東環(huán)凱微生物有限公司；微球菌、葡萄球菌和相關(guān)菌屬鑒定試劑盒(比色法)API Staph20500，法國(guó)梅里埃公司；藥敏紙片，英國(guó)Oxoid公司；細(xì)菌核酸DNA小量提取試劑盒，廣州邁寶生物科技有限公司；Dream TaqTMGreen PCR Master Mix(2x)，美國(guó)Fermentas公司；Taq酶及PCR所需試劑，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；Biowest 電泳級(jí)瓊脂糖，西班牙Biowest公司；Goldview?核酸染料，生工生物工程(上海)有限公司；PCR純化試劑盒，德國(guó)Qiagen公司；DNA引物合成，北京六合華大基因科技有限公司。各試劑均在有效期內(nèi)使用。

表1 中國(guó)采樣分布Tab.1 Locations of sampling sites for this study in China

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1金黃色葡萄球菌的分離和鑒定

對(duì)采集的樣品同時(shí)進(jìn)行定性和定量檢測(cè)，檢測(cè)方法在GB 4789.10—2010的基礎(chǔ)上略做調(diào)整。將食用菌樣品用無(wú)菌的剪刀剪碎，攪拌均勻后取樣25 g加入225 mL生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)袋中均質(zhì)搖勻，制成1∶10的樣品液，并從中取1 mL加入到裝有9 mL 10% 氯化鈉胰酪胨大豆肉湯的試管中，制成1∶100的樣品液，按照此方法制成1∶1 000的樣品液。每個(gè)梯度3個(gè)平行，將樣品液放置于恒溫培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)48 h后，將每個(gè)梯度濃度的樣品液分別劃線于金葡菌顯色板培養(yǎng)基上，37 ℃中培養(yǎng)24～48 h。金葡菌的典型菌落在顯色平板上為粉色濕潤(rùn)邊緣平整，挑取3～4個(gè)疑似典型菌落劃線于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板中，37 ℃培養(yǎng)(24±1)h。挑取單菌落進(jìn)行血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)，對(duì)其陽(yáng)性菌株進(jìn)行API Staph生化鑒定，鑒定結(jié)果顯示為Staphylococcusaureus，且鑒定率≥70%的，即可記為陽(yáng)性。

1.3.2耐藥性實(shí)驗(yàn)

金葡菌抗生素敏感性實(shí)驗(yàn)參照Kirby-Bauer法[7]進(jìn)行。所有菌株經(jīng)NA平板活化后加入生理鹽水稀釋至終濃度為1×107cfu/mL，涂布于MH平板上，待菌液干后將抗生素紙片貼在培養(yǎng)基表面，37 ℃培養(yǎng)24 h。選取目前臨床上常用于治療金葡菌感染的14類24種抗生素，其中包括：阿莫西林克拉維酸(AMC，30 μg)、氨芐西林(AMP，10 μg)、頭孢吡肟(FEP，10 μg)、頭孢西丁(FOX，30 μg)、青霉素(P，10 μg)、頭孢他啶(CAZ，30 μg)、阿米卡星(AK，30 μg)、慶大霉素(CN，10 μg)、卡那霉素(K，30 μg)、鏈霉素(S，25 μg)、氯霉素(C，30 μg)、克林霉素(DA，2 μg)、紅霉素(E，15 μg)、泰利霉素(TEL，15 μg)、環(huán)丙沙星(CIP，5 μg)、諾氟沙星(NOR，10 μg)、四環(huán)素(TE，30 μg)，利奈唑胺(LZD，30 μg)、利福平(RD，5 μg)、復(fù)方新諾明(SXT，25 μg)、喹奴普汀/達(dá)富普汀(QD，15 μg)、替拉考寧(TEC，30 μg)、呋喃妥因(F，300 μg)和褐霉素(FD，10 μg)。StaphylococcusaureusATCC25923和EscherichiacoliATCC25922作為質(zhì)控菌株。采用游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈大小，精確到0.01 mm。具有3種或3種以上類型抗生素抗性的菌株定義為多重耐藥菌株，其中，對(duì)頭孢西丁(FOX)產(chǎn)生耐藥的菌株，初步認(rèn)定為耐甲氧西林金葡菌(methicililin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)，繼而進(jìn)行mecA/C基因檢測(cè)[8-9]，確定為MRSA。對(duì)于利奈唑胺耐藥的菌株，經(jīng)梯度濃度稀釋法(MIC法)[10-12]進(jìn)行再次驗(yàn)證。

1.3.3腸毒素基因檢測(cè)

利用PCR擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)所有金葡菌分離株的18種腸毒素基因(sea,seb,sec,sed,see,seg,seh,sei,sej,sek,sel,sem,sen,seo,sep,seq,ser,seu)。引物及擴(kuò)增條件參考Varshney等[7]的方法。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，取5 μL PCR產(chǎn)物上樣于1.5%瓊脂糖凝膠(含Goldview染料)進(jìn)行電泳分離，電壓120 V電泳25 min，利用UV 凝膠成像系統(tǒng)(GE Healthcare，WI，USA)進(jìn)行圖片采集，圖片保存為TIFF格式以備進(jìn)一步研究。

1.3.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

細(xì)菌的MPN值的平均計(jì)數(shù)基于basic-10 logarithms方法計(jì)算。當(dāng)MPN值小于0.3 MPN/g時(shí)，設(shè)定值為0.15，當(dāng)MPN值大于110 MPN/g時(shí)，則取最大值?？ǚ綑z驗(yàn)用于金葡菌陽(yáng)性樣品的污染率和污染水平的檢驗(yàn)。所有的數(shù)據(jù)都運(yùn)用SPSS V21.0軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌在我國(guó)食用菌中的污染情況

本次調(diào)查，從39個(gè)城市中采集699份食用菌樣品，檢出33份金葡菌陽(yáng)性樣品，平均污染率為4.72%，平均污染水平9.75 MPN/g，具體結(jié)果如表2。33份陽(yáng)性樣品分別包括金針菇18份(8.18%)，平菇3份(2.63%)，香菇4份(3.64%)，杏鮑菇4份(4.21%)，其他菇類4份(4.72%)。從污染程度來(lái)看，金針菇、平菇的平均污染水平高于10 MPN/g，而香菇、杏鮑菇和其他菇類的污染水平則低于1 MPN/g。39個(gè)城市中，有20個(gè)城市的食用菌檢出金葡菌陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率最高的城市是拉薩(15.15%，5/33)，其次為海口(12.12%，4/33)，汕頭(9.09%，3/33,)，廣州(6.06%，2/33)，湛江(6.06%，2/33)，北海(6.06%，2/33)，西寧(6.06%，2/33)，香港(3.03%，1/33)，廈門(3.03%，1/33)，三亞(3.03%，1/33)，鄭州(3.03%，1/33)，合肥(3.03%，1/33)，西安(3.03%，1/33)，武漢(3.03%，1/33)，北京(3.03%，1/33)，上海(3.03%，1/33)，杭州(3.03%，1/33)，長(zhǎng)春(3.03%，1/33)，哈爾濱(3.03%，1/33)，銀川(3.03%，1/33)。5大類食用菌中，金針菇的污染率最高，平均污染水平相對(duì)較高。同時(shí)，金葡菌污染食用菌沒(méi)有明顯的地區(qū)分布規(guī)律，這暗示著食用菌在給人們提供豐富營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的同時(shí)，也可能帶來(lái)一定的食品安全風(fēng)險(xiǎn)。

2.2 食用菌源金黃色葡萄球菌的耐藥性分析

本次調(diào)查，共分離出39株金葡菌陽(yáng)性菌株，其中23株分離自金針菇樣品，4株分離自平菇樣品，4株分離自香菇樣品，4株分離自杏鮑菇樣品，4株分離自其他類型的食用菌樣品。對(duì)39株食用菌源金葡菌均進(jìn)行了耐藥性實(shí)驗(yàn)，藥敏結(jié)果如表3。我國(guó)食用菌源金葡菌分離株對(duì)22種抗生素均產(chǎn)生不同程度的耐藥或中度耐藥，對(duì)利奈唑胺、利福平敏感。22種抗生素中，耐藥情況最嚴(yán)重的是氨芐西林和青霉素，耐藥率高達(dá)92.31% ，其次是紅霉素(56.41%)、四環(huán)素(51.28%)、卡那霉素(46.15%)、泰利霉素(35.90%)、克林霉素(30.77%)、鏈霉素(25.64%)、褐霉素(20.51%)及其他(<20%)。39株分離菌株中，有7株對(duì)頭孢西丁產(chǎn)生耐藥，PCR結(jié)果顯示7株分離株均攜帶mecA基因，確定為MRSA。39株分離株中，16株對(duì)1～3種的抗生素發(fā)生耐藥，16株對(duì)4～10種抗生素發(fā)生耐藥，7株對(duì)10種以上的抗生素發(fā)生耐藥(高度耐藥)。7株高度耐藥菌株中，6株為MRSA，1株為MSSA。對(duì)3類或3類以上的抗生素同時(shí)耐藥的微生物，被定義為多重耐藥菌。本研究中，33株(84.61%)分離株對(duì)3類或以上的抗生素發(fā)生中度耐藥或耐藥。由此可以看出，本研究中食用菌源分離株出現(xiàn)的耐藥問(wèn)題較為嚴(yán)重。值得關(guān)注的是，7株高度耐藥菌株中的MRSA幾乎對(duì)所有β-內(nèi)酰胺類藥物發(fā)生耐藥，對(duì)氟喹諾酮類藥物敏感，MSSA則與之相反。

2.3 金黃色葡萄球菌分離株腸毒素基因分布情況

通過(guò)PCR方法對(duì)分離得到的39株食用菌分離株的18種腸毒素基因攜帶情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果如表4。表4顯示，sea,seb,sec,sed,see,seg,seh,sei,sej,sek,sel,sem,sen,seo,sep,seq,ser以及seu的檢出率分別為17.95%，28.21%，35.90%，0%，15.38%，51.28%，100%，71.79%，25.64%，5.13%，7.69%。所有分離株至少攜帶1種腸毒素基因，其中有1株平菇樣品的分離株同時(shí)攜帶9種腸毒素基因(sea-seb-sec-seh-sei-sek-sem-seq-seu)，這可能與大部分腸毒素基因定位在可移動(dòng)基因元件上有關(guān)。本研究中傳統(tǒng)腸毒素基因(sea,seb,sec,sed,see)的檢出率為19.79%(38/192)，以sec基因?yàn)橹鳎礄z出sed基因。新型腸毒素(seg,sei,sem,sen,seo,seu)的檢出率為53.13% (102/192)，其中，sei基因?yàn)榻鹌暇蛛x株的主要攜帶基因(見(jiàn)圖1)。

表2 金黃色葡萄球菌在不同食用菌中的分布情況Tab.2 Contents of Staphylococcus aureus in different retail edible mushrooms

表3 全國(guó)食用菌金黃色葡萄球菌分離株藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Antimicrobial susceptibility tests of Staphylococcus aureus isolates obtained from retail edible mushrooms in China

a.耐藥菌株數(shù)，b.中度耐藥菌株數(shù)，c.敏感菌株數(shù)，n.菌株總數(shù)量。

2.4 討 論

本研究在2011—2016年，對(duì)全國(guó)39個(gè)城市699份食用菌進(jìn)行污染調(diào)查，研究其污染情況和污染水平，并檢測(cè)到金葡菌陽(yáng)性樣品33份，平均污染率達(dá)到了4.72%，平均污染水平9.75 MPN/g。這一結(jié)果顯示，我國(guó)市售食用菌中金葡菌的污染情況不容樂(lè)觀。相較于食用菌樣品，肉、雞蛋和奶制品更適宜金葡菌的生長(zhǎng)[13-14]，然而，本研究中的食用菌同樣受到金葡菌的污染，這很有可能是食用菌與其他類型產(chǎn)品發(fā)生了交叉污染；因此，需特別重視食用菌的培植環(huán)境、運(yùn)輸及銷售中的交叉污染情況。

表4 全國(guó)食用菌源金黃色葡萄球菌腸毒素基因分布情況Tab.4 Distributions of 18 types of SE genes of Staphylococcus aureus isolates edible mushrooms obtained from retail in China

圖1 全國(guó)食用菌金黃色葡萄球菌sei基因分布情況Fig.1 Distributions of sei gene in edible mushrooms Staphylococcus aureus isolates in China

一般來(lái)說(shuō)，動(dòng)物源金葡菌的耐藥性較為嚴(yán)重，這與動(dòng)物在養(yǎng)殖過(guò)程中長(zhǎng)期使用亞治療量的抗菌藥物有關(guān)。亞治療量的抗菌藥物會(huì)誘導(dǎo)動(dòng)物腸道內(nèi)正常菌群和寄居的病原菌產(chǎn)生耐藥性，導(dǎo)致動(dòng)物源性食品中病原菌耐藥株的產(chǎn)生且迅速蔓延引起環(huán)境或食品的污染；然而，本研究從食用菌中分離的金葡菌耐藥性率也很高，其中，β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)內(nèi)酯類以及四環(huán)素類等藥物耐藥情況甚至達(dá)到50%以上，該結(jié)果與汪永祿等[15]和周臣清[16]研究結(jié)果一致。Vitale等[17]對(duì)金葡菌分離株進(jìn)行了耐藥性研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其分離株同樣對(duì)β-內(nèi)酰胺類(35.7%)、四環(huán)素類(20.2%)兩類藥物發(fā)生耐藥，但其耐藥率稍低于本研究結(jié)果，這表明，食用菌源金葡菌的耐藥性同樣嚴(yán)重。本研究還分離到了7株MRSA，顯示在分離菌中的陽(yáng)性率為17.9%，這一水平明顯高于其他食品源MRSA中的陽(yáng)性比例[18-19]。MRSA傳染性強(qiáng)、致病性高且耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，不僅可產(chǎn)生多種分泌性毒素，還可以通過(guò)質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等將耐藥性基因轉(zhuǎn)移到其他菌株中[20]，能使原本對(duì)藥物敏感的菌株成為高度耐藥菌；因此，對(duì)于本研究中分離到17.9%的MRSA菌株應(yīng)特別引起關(guān)注。

與Fursova等[21]以及Vitale等[17]報(bào)道的不同，本研究的分離株主要攜帶sei、sem腸毒素基因。18種腸毒素基因檢測(cè)結(jié)果顯示，seg、sei、sem、sen、seo、seu等新型腸毒素的攜帶率(53.13%，102/192)要明顯高于sea～see五種傳統(tǒng)的腸毒素 (19.79%，38/192)基因。此外，本研究中的金葡菌傳統(tǒng)腸毒素的攜帶率遠(yuǎn)低于劉偉等[22]和劉杰等[23]報(bào)道的日常食品中的傳統(tǒng)腸毒素?cái)y帶率(≥70%)。本研究中分離株的腸毒素?cái)y帶情況有別于國(guó)內(nèi)外的報(bào)道，這可能與采集樣品的種類數(shù)量及類型有關(guān)。

3 結(jié) 論

我國(guó)市售食用菌中存在金黃色葡萄球菌的污染風(fēng)險(xiǎn)，且相關(guān)分離株在耐藥性、腸毒素基因攜帶方面的情況較為嚴(yán)重，在食品安全中存在一定的威脅。因此，建議相關(guān)食品企業(yè)嚴(yán)格把控從食品原料到成品的各個(gè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)，安排專門的化驗(yàn)員對(duì)成品進(jìn)行檢驗(yàn)，以保證產(chǎn)品的質(zhì)量，將可能引起的食物中毒風(fēng)險(xiǎn)降到最低。同時(shí)，相關(guān)生產(chǎn)及其他有關(guān)部門應(yīng)加強(qiáng)對(duì)食源性致病菌耐藥性的檢測(cè)，及時(shí)掌握病原菌的耐藥狀況，減低耐藥危害的發(fā)生，指導(dǎo)臨床合理選擇有針對(duì)性的抗菌藥物。

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Abstract： This study investigated the contamination level ofStaphylococcusaureusof retail edible mushrooms in China. 699 retail edible mushroom samples were collected from 39 cities in China during 2011 to 2016, 33 samples (4.72%) were positive forStaphylococcusaureusand the geometric mean was 9.75 MPN/g. A total of 39 isolates were analyzed.For antibiotics susceptibility tests, all isolated strains were resistant to 22 kinds of different antibiotics, such as ampicillin, and only sensitive to linezolid and rifampicin. Seven isolates were resistant to cefoxitin and carriedmecAgene, confirmed as methicililin-resistantStaphylococcusaureus(MRSA).Polymerase chain reaction(PCR) analysis of 18 SE genes showed that 4-6 kinds of enterotoxin genes carried by 60% isolated strains, andseigene was the most frequently detected, followed bysem，seg，seq，sec，seb，sen.This study reflects the potential risk ofStaphylococcusaureuscontamination of retail edible mushrooms in China and these isolate strains had virulence potential and drug tolerance, which should be drawn public attention.

Keywords：Staphylococcusaureus; edible mushrooms; pollution level; enterotoxin gene; drug tolerance

(責(zé)任編輯：葉紅波)