膠紅酵母產(chǎn)類胡蘿卜素固態(tài)發(fā)酵工藝

孫佳靜，李貌，孫志洪，唐志如，張相鑫，陳進(jìn)超

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膠紅酵母產(chǎn)類胡蘿卜素固態(tài)發(fā)酵工藝

孫佳靜，李貌，孫志洪，唐志如，張相鑫，陳進(jìn)超

（西南大學(xué)動物科技學(xué)院/生物飼料與分子營養(yǎng)實驗室，重慶 400715）

【目的】優(yōu)化膠紅酵母固態(tài)發(fā)酵底物與發(fā)酵條件，提高類胡蘿卜素產(chǎn)量，改善發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)價值，降低生產(chǎn)成本?！痉椒ā窟x用膠紅酵母TZR2014作為發(fā)酵菌種，采用Design-Expert軟件的Mixture-Design設(shè)計固態(tài)發(fā)酵底物的配比，各底物原料的范圍如下：麩皮50%—80%、豆粕6%—20%、玉米粉3%—15%、米糠2%—14%、玉米漿2%—10%、硫酸銨0.4%—2.5%、磷酸二氫鉀0.05%—0.5%和硫酸鎂0.03%—0.3%，通過固態(tài)發(fā)酵工藝生產(chǎn)類胡蘿卜素，并根據(jù)類胡蘿卜素的產(chǎn)量來確定最優(yōu)的發(fā)酵底物。確定最適發(fā)酵底物配比后，利用L16(45)正交設(shè)計對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計，各參數(shù)的范圍如下：接種量5.0%—12.5%、發(fā)酵時間60.0—96.0 h、發(fā)酵溫度26—32℃、pH 4.0—7.0、含水量60.0%—75.0%，根據(jù)試驗結(jié)果確定膠紅酵母產(chǎn)類胡蘿卜素的最優(yōu)發(fā)酵條件。研究優(yōu)化的膠紅酵母固態(tài)發(fā)酵工藝對發(fā)酵產(chǎn)物粗纖維、粗蛋白質(zhì)、水分、粗脂肪、粗灰分、鈣、磷和氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)的影響。【結(jié)果】膠紅酵母發(fā)酵產(chǎn)物中類胡蘿卜素含量與固態(tài)發(fā)酵底物中麥麩的添加量呈顯著負(fù)相關(guān)（=-0.336，=0.045），與發(fā)酵底物中玉米漿的添加量呈顯著正相關(guān)（=0.344，=0.040），與發(fā)酵底物中米糠添加量為正相關(guān)（=0.329，=0.050）。發(fā)酵產(chǎn)物中膠紅酵母活菌數(shù)與底物中豆粕含量呈顯著正相關(guān)（=0.510，=0.001）。接種量、發(fā)酵溫度、pH、底物含水量對膠紅酵母活菌數(shù)均有極顯著的影響（＜0.01），但其中發(fā)酵溫度對膠紅酵母菌體數(shù)影響最大，其次是底物含水量，之后依次是接種量和pH。發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度和pH均顯著影響發(fā)酵產(chǎn)物中類胡蘿卜素含量（＜0.05），其中發(fā)酵溫度對發(fā)酵產(chǎn)物中類胡蘿卜素含量影響最大，pH次之，發(fā)酵時間影響最小。經(jīng)過發(fā)酵工藝的優(yōu)化，發(fā)酵產(chǎn)物中類胡蘿卜素產(chǎn)量提高到4 535 μg·kg-1，發(fā)酵產(chǎn)物中的活菌數(shù)為3.79×109CFU/g；發(fā)酵后粗纖維、粗蛋白質(zhì)、粗灰分、蘇氨酸、谷氨酸、脯氨酸含量均顯著高于發(fā)酵前（＜0.05），而組氨酸、水分、粗脂肪含量顯著低于發(fā)酵前（＜0.05）?！窘Y(jié)論】膠紅酵母固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)類胡蘿卜素底物的最佳配比為麥麩52.5%、豆粕20.0%、玉米粉3.00%、米糠14.0%、玉米漿10.0%、硫酸銨0.40%、磷酸二氫鉀0.05%和硫酸鎂0.04%；最佳發(fā)酵條件為菌液接種量5.0%、發(fā)酵時間72.0 h、發(fā)酵溫度28.0℃、pH 6.0、底物含水量60.0%。經(jīng)過優(yōu)化膠紅酵母發(fā)酵工藝，類胡蘿卜素產(chǎn)量得到顯著提高，并且發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)價值得到明顯改善。

膠紅酵母；固態(tài)發(fā)酵；類胡蘿卜素；發(fā)酵底物；發(fā)酵條件

0 引言

【研究意義】類胡蘿卜素是一類廣泛存在于自然界中的有色多烯類化合物，主要包括β-類胡蘿卜素、蝦青素、葉黃素和番茄紅素等。天然類胡蘿卜素因其抗氧化、防癌、增強免疫力等保健作用受到越來越多人的青睞[1]。因此，開展膠紅酵母產(chǎn)胡蘿卜素研究具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】類胡蘿卜素混合物和β-胡蘿卜素都沒有基因毒性，類胡蘿卜素可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞信號和基因表達(dá)抵抗癌癥[2]，且可以抑制基因突變和抵抗環(huán)境誘導(dǎo)的基因毒性劑[3]。類胡蘿卜素已被FAO和WHO定為A類營養(yǎng)色素，在50多個國家和地區(qū)獲準(zhǔn)作為營養(yǎng)、著色雙重功用的食品添加劑，被廣泛應(yīng)用于保健食品及醫(yī)藥和化妝品工業(yè)[4]。目前，類胡蘿卜素主要利用微生物和高等植物進(jìn)行生產(chǎn)。從植物中提取天然類胡蘿卜素不僅受地域條件、原料來源、提取效率等限制，而且生產(chǎn)成本較高。近年來，利用微生物生產(chǎn)類胡蘿卜素受到越來越多的關(guān)注。生產(chǎn)類胡蘿卜素的微生物主要包括三孢布拉霉（）和紅酵母類。三孢布拉霉雖然產(chǎn)率高，但發(fā)酵工藝較難調(diào)控，而且液態(tài)發(fā)酵普遍存在著生產(chǎn)工藝復(fù)雜、能耗高、環(huán)境污染大、成本高等缺點。膠紅酵母是一種主要合成β-胡蘿卜素的紅酵母[5]，其通過固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素的工藝與液態(tài)發(fā)酵法相比，具有能耗低、培養(yǎng)基簡單、生產(chǎn)過程節(jié)水、操作簡便易行等優(yōu)點[6]。【本研究切入點】紅酵母合成類胡蘿卜素的效率受許多因素的影響，例如，培養(yǎng)基組成、發(fā)酵條件[7]。目前，有關(guān)利用膠紅酵母進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)類胡蘿卜素的研究較少。本研究選用膠紅酵母作為發(fā)酵菌種，主要利用農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品麩皮，并輔以其他發(fā)酵原料作為固態(tài)發(fā)酵底物原料，旨在探究發(fā)酵底物原料（麩皮、豆粕、玉米粉、玉米漿、米糠、硫酸銨、磷酸氫二鉀和硫酸鎂等）配比和發(fā)酵條件（接種量、發(fā)酵溫度、底物含水量、發(fā)酵時間和底物pH）對類胡蘿卜素產(chǎn)量、膠紅酵母活菌數(shù)和發(fā)酵產(chǎn)物營養(yǎng)價值的影響。【擬解決的關(guān)鍵問題】確定膠紅酵母最優(yōu)的發(fā)酵底物配比和發(fā)酵條件；制定高效生產(chǎn)類胡蘿卜素的膠紅酵母發(fā)酵工藝。

1 材料與方法

試驗于2015—2016年在西南大學(xué)生物飼料與分子營養(yǎng)實驗室進(jìn)行。

1.1 主要儀器

雙目生物顯微鏡（B203LEDR，重慶奧特光學(xué)儀器有限公司）；高速冷凍離心機（ST 8，賽默飛世爾科技公司）；臺式低速離心機（TDZ4-WS，湘儀公司）；渦旋儀（WH-3，上海滬西分析儀器有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱（HH?BII?500-BS，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）；pH計（PHS-4C+，成都世紀(jì)方舟科技有限公司）；高壓蒸汽滅菌器（MJ-54A，施都凱儀器設(shè)備有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-8，常州國華電器有限公司）；超純水系統(tǒng)（SDLD-R，重慶市澳凱龍醫(yī)療器械研究有限公司）；潔凈工作臺（SW-CJ-2D，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

1.2 試驗材料

（1）菌種來源：重慶市北碚區(qū)柑桔研究所果園分離出的膠紅酵母。該菌株已于2015年9月24日送至中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，分類命名為膠紅酵母TZR2014，保藏編號為CCTCC NO：M 2015574，保藏地址為武漢大學(xué)。菌落特征如下：菌落呈圓形、橙紅色、隆起，膠質(zhì)黏稠，邊緣整齊，表面光滑，易于挑起。

（2）PDA培養(yǎng)基：稱取馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，溶于1 000 mL水中，自然pH，115℃滅菌20 min。

（3）種子培養(yǎng)基：稱取葡萄糖20 g、蛋白胨10 g、酵母提取物10 g，溶于1 000 mL自來水中，自然pH，115℃滅菌20 min。

1.3 膠紅酵母固態(tài)發(fā)酵底物的優(yōu)化

從滿足膠紅酵母生長必需的營養(yǎng)素以及經(jīng)濟性原則考慮，本研究選擇麩皮、豆粕、玉米粉、玉米漿、米糠、硫酸銨、磷酸氫二鉀和硫酸鎂8種原料作為發(fā)酵底物，在借鑒前人研究基礎(chǔ)上[8-9]，采用Design-Expert軟件中的Mixture Design設(shè)計固態(tài)發(fā)酵底物配比，各原料的范圍如下：麩皮50%—80%、豆粕6%—20%、玉米粉3%—15%、米糠2%—14%、玉米漿2%—10%、硫酸銨0.4%—2.5%、磷酸二氫鉀0.05%—0.5%和硫酸鎂0.03%—0.3%。具體設(shè)計如表1所示。

取-80℃凍存的膠紅酵母接種于PDA培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)72 h，進(jìn)行菌種的復(fù)蘇。再取PDA培養(yǎng)基上的膠紅酵母菌接種于種子培養(yǎng)基上，置于恒溫振蕩器中于200 r/min、28℃培養(yǎng)24 h，即得膠紅酵母種子液。分別秤取按表1設(shè)計的36種發(fā)酵底物132 g，混勻，并將水分含量調(diào)節(jié)為65%，平均分成4份，其中1份做空白對照，另外3份作為一個處理的3次重復(fù)，用于排除培養(yǎng)基中原有的類胡蘿卜素對試驗的影響。置于250 mL三角瓶密封滅菌，待冷卻后按發(fā)酵底物質(zhì)量體積的5%接種。8層紗布密封后置于30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)72 h。

1.4 發(fā)酵條件優(yōu)化

在獲取最佳發(fā)酵底物配比的基礎(chǔ)上，借鑒前人研究結(jié)果[10-11]設(shè)定接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、發(fā)酵pH和發(fā)酵底物含水量的梯度（表2），并對以上5個參數(shù)進(jìn)行L16(45)正交設(shè)計（表3）。

膠紅酵母復(fù)蘇以及得到種子液的步驟同上。稱取上述研究得到的最優(yōu)發(fā)酵底物16組，每組132 g，混勻，并將水分含量調(diào)節(jié)為65%，平均分成4份，其中一份做空白對照，然后置于250 mL三角瓶密封滅菌，按表3設(shè)置的固態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行發(fā)酵，其中pH用氫氧化鈉和鹽酸進(jìn)行調(diào)節(jié)。

1.5 膠紅酵母固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化對底物養(yǎng)分的影響

發(fā)酵底物以及發(fā)酵產(chǎn)物滅菌、混勻后，在60℃烘干、粉碎，用于測定樣品中的水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗纖維、粗灰分、無氮浸出物、鈣、磷和氨基酸含量。

1.6 測定方法

（1）膠紅酵母活菌數(shù)：取5 g發(fā)酵底物或產(chǎn)物置于錐形瓶內(nèi)，在錐形瓶內(nèi)加入100 mL 0.85%的生理鹽水，置于恒溫振蕩器中于200 r/min振蕩20 min，用血球計數(shù)板進(jìn)行計數(shù)。

固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物含膠紅酵母細(xì)胞數(shù)（y，CFU/g）的計算方法如下：

y={[（80個小方格內(nèi)細(xì)胞個數(shù)）/80×400×104×稀釋的倍數(shù)]×100}/5

（2）類胡蘿卜素：測定過程主要參考楊文等[12]和王歲樓等[13]介紹的方法，并對部分操作步驟進(jìn)行了改進(jìn)。具體測定步驟如下：稱取10 g樣品并用50 mL 0.85%的生理鹽水稀釋，八層紗布過濾后菌液于 4 800 r/min下離心10 min。收集菌體，置于50℃恒溫箱中烘干至恒重。稱取干酵母0.1 g，加入3 mol·L-1的鹽酸2.4 mL，靜止1 h，轉(zhuǎn)至沸水浴中加熱4 min，迅速冷卻，然后4 000 r/min離心10 min，棄上清液。水洗后再離心，重復(fù)2次，即得細(xì)胞碎片。在細(xì)胞碎片中加入4 mL丙酮溶液，室溫漩渦振蕩15 min后，4 000 r/min離心10 min，取上清液，重復(fù)浸提2次，所得上清液即為類胡蘿卜素提取液。類胡蘿卜素含量按下列公式計算：

表1 膠紅酵母固態(tài)發(fā)酵底物優(yōu)化設(shè)計

表2 膠紅酵母固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化梯度

表3 膠紅酵母固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化設(shè)計

表中A、B、C、D分別代表表2中相對應(yīng)的發(fā)酵梯度

A, B, C and D represents the relative gradients of inoculum amount, fermentation time, fermentation temperature, pH value, and moisture content in table 2, respectively

色素的含量（μg·g-1干菌體）=Aλ×D×V/0.16×W式中：Aλ為475 nm波長處的吸光值，D為測定試樣時的稀釋倍數(shù)，V為丙酮的用量（mL），W為酵母菌重量（g），0.16為類胡蘿卜素的摩爾消光系數(shù)。

（3）水分：將樣品（105±2）℃烘箱烘干至恒重。

（4）粗蛋白質(zhì)：采用凱氏定氮法，用半自動凱氏定氮儀進(jìn)行測定。

（5）粗脂肪：采用乙醚浸提法，用脂肪測定儀進(jìn)行測定。

（6）粗灰分：將樣品在（550±20）℃下灰化至恒重。

（7）粗纖維：采用濾袋技術(shù)進(jìn)行測定。

（8）鈣：采用高錳酸鉀滴定法進(jìn)行測定。

（9）磷：采用鉬黃比色法進(jìn)行測定。

（10）氨基酸：采用全自動氨基酸分析儀進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)使用SAS 9.0和Design-Expert進(jìn)行統(tǒng)計分析。＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 固態(tài)發(fā)酵底物優(yōu)化

由表4所示，發(fā)酵底物18所產(chǎn)的類胡蘿卜素含量最高，而發(fā)酵底物17經(jīng)過發(fā)酵后產(chǎn)物中的活菌數(shù)量最高，考慮到本研究是以類胡蘿卜素產(chǎn)量為主要目標(biāo)，因此，將發(fā)酵底物18作為最優(yōu)發(fā)酵底物，供后續(xù)的研究使用。

2.1.1 試驗的數(shù)學(xué)模型分析 以表4數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，用Design-Expert軟件對類胡蘿卜素含量和膠紅酵母菌數(shù)進(jìn)行分析，得到模型的性噪比（Adeq Precision）和2預(yù)測值（Pred R-Squared），如表5所示。當(dāng)模型的信噪比大于4時表示模型是比較合適的。數(shù)據(jù)顯示類胡蘿卜素和膠紅酵母菌數(shù)模型的性噪比均大于4，表明數(shù)據(jù)均是可取的，且具有較高的精密度值。當(dāng)2預(yù)測值為負(fù)值時意味著預(yù)測模型比實際模型更合適。該試驗?zāi)Ｐ头治龅慕Y(jié)果均為負(fù)值，表明預(yù)測模型比實際模型具有更理想的效果。

由表6可知，膠紅酵母發(fā)酵產(chǎn)物中類胡蘿卜素含量與固態(tài)發(fā)酵底物中麥麩的添加量呈顯著負(fù)相關(guān)（=-0.336，=0.045）；固態(tài)發(fā)酵底物中豆粕含量與發(fā)酵產(chǎn)物中膠紅酵母活菌數(shù)呈顯著正相關(guān)（=0.510，=0.001）；玉米漿的添加量與類胡蘿卜素產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)（=0.344，=0.040）。此外，發(fā)酵底物中米糠添加量與發(fā)酵產(chǎn)物中類胡蘿卜素含量正相關(guān)（=0.329，=0.050）。

2.1.2 試驗結(jié)果驗證 表7為通過Design-Expert軟件對各指標(biāo)進(jìn)行分析后，以盡可能達(dá)到發(fā)酵產(chǎn)物中類胡蘿卜素含量和膠紅酵母菌數(shù)最大的一個最佳配方。

以表7配方為基礎(chǔ)對兩個指標(biāo)進(jìn)行模型預(yù)測，得出預(yù)測值如表8所示。再按照該配方進(jìn)行發(fā)酵試驗，將實測值與預(yù)測值進(jìn)行顯著性檢驗。由表8可知，類胡蘿卜素的實測值略高于預(yù)測值，但差異不顯著（＞0.05）。

2.2 固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化

用正交設(shè)計軟件對類胡蘿卜素含量和膠紅酵母細(xì)胞數(shù)進(jìn)行逐個分析處理，找出最佳的配方方案，得到的試驗方案如表9所示。由表9可知，就發(fā)酵產(chǎn)物中活菌數(shù)來看，極差C＞E＞D＞A＞B，因此C因素（發(fā)酵溫度）被確定為最重要的影響因素，并且發(fā)酵溫度在第4水平時（32℃）發(fā)酵產(chǎn)物中活菌數(shù)最多；之后進(jìn)行主次因素依次分析，得到獲取最多活菌數(shù)的發(fā)酵條件為C4E1D1A1B2。而從發(fā)酵產(chǎn)物中類胡蘿卜素含量進(jìn)行比較，極差C＞D＞B＞E＞A，因此，因素C是最重要的影響因素，并且發(fā)酵溫度第2水平時（28℃）類胡蘿卜素含量最高；然后進(jìn)行主次因素依次分析，得到獲取最高類胡蘿卜素產(chǎn)量的發(fā)酵條件為C2D3B2E1A2。針對不同發(fā)酵目的的優(yōu)化發(fā)酵方案不完全相同，如表10所示。

表4 膠紅酵母固態(tài)發(fā)酵底物優(yōu)化對類胡蘿卜素產(chǎn)量和菌體數(shù)量的影響

n=3；數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。下同

n=3; The value is mean±SD. The same as below

表5 模型的性噪比及R2 預(yù)測值

表6 發(fā)酵底物與膠紅酵母類胡蘿卜素產(chǎn)量及菌體數(shù)量的相關(guān)性

表7 膠紅酵母固態(tài)發(fā)酵底物優(yōu)化配方

表8 膠紅酵母類胡蘿卜素產(chǎn)量的模型預(yù)測值與實測值

為了更直觀地反映各產(chǎn)物在不同因素水平下的變化，本研究還做了關(guān)于膠紅酵母細(xì)胞數(shù)和類胡蘿卜素含量的相關(guān)方差分析，分別如表11、表12所示。由表11可知，接種量、發(fā)酵溫度、pH、含水量對發(fā)酵產(chǎn)物中膠紅酵母活菌數(shù)均有極顯著的影響（＜0.001），其中發(fā)酵溫度影響最大，其次是含水量，之后依次是接種量和pH。由表12得，發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度和pH對發(fā)酵產(chǎn)物中類胡蘿卜素含量的影響均為極顯著（＜0.01），其中發(fā)酵溫度的影響最大，其次為pH，最后是發(fā)酵時間。

根據(jù)影響主次性以及顯著性程度，含水量對發(fā)酵產(chǎn)物中膠紅酵母活菌數(shù)影響顯著，最佳含水量取E2（60%）；發(fā)酵時間對發(fā)酵產(chǎn)物中類胡蘿卜素含量影響顯著，且最佳發(fā)酵時間為B2（72 h）；接種量活菌細(xì)胞數(shù)影響極顯著，最佳接種量取A1（5.0%）；pH對活菌數(shù)和類胡蘿卜素含量影響均顯著，因pH選取應(yīng)優(yōu)先考慮類胡蘿卜素含量，本試驗最佳pH取D3（6.0）；發(fā)酵溫度對活菌數(shù)和類胡蘿卜素含量影響均顯著，因本試驗以產(chǎn)類胡蘿卜素為主要優(yōu)化目標(biāo)，最佳發(fā)酵溫度取C2（28℃）。最佳優(yōu)化條件下發(fā)酵產(chǎn)物中類胡蘿卜素含量與膠紅酵母菌數(shù)如表13所示，對比表4可看出，發(fā)酵條件優(yōu)化后，發(fā)酵產(chǎn)物中類胡蘿卜素含量與活菌數(shù)得到明顯增加。

表9 膠紅酵母固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化的正交試驗結(jié)果

A—E分別代表接種量、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、pH、含水量；n=3；數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。下同

A-E represents inoculum amount, fermentation time, fermentation temperature, pH, and moisture content, respectively. n=3; the value is mean±SD. The same as below

表10 膠紅酵母固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化方案

表11 發(fā)酵條件對膠紅酵母菌體數(shù)量影響的方差分析

***代表＜0.001；**代表＜0.01。下同

*** represents＜0.001; ** represents＜0.01. The same as below

表12 發(fā)酵條件對發(fā)酵產(chǎn)物中類胡蘿卜素含量影響的方差分析

表13 最優(yōu)發(fā)酵工藝下類胡蘿卜素產(chǎn)量和膠紅酵母數(shù)量

2.3 膠紅酵母固態(tài)發(fā)酵工藝優(yōu)化對底物養(yǎng)分的影響

2.3.1 發(fā)酵前后底物常規(guī)營養(yǎng)成分對比分析 由表14可知，發(fā)酵后粗蛋白質(zhì)、粗灰分和粗纖維含量顯著高于發(fā)酵前（＜0.05）；發(fā)酵后含水量和粗脂肪含量顯著低于發(fā)酵前；而發(fā)酵前后鈣和磷的含量沒有顯著差異。

2.3.2 發(fā)酵前后底物氨基酸結(jié)果分析 由表15可知，發(fā)酵后蘇氨酸、谷氨酸、脯氨酸含量顯著高于發(fā)酵前（＜0.05）。

表14 膠紅酵母發(fā)酵底物常規(guī)營養(yǎng)成分在發(fā)酵前后的變化

表15 膠紅酵母發(fā)酵底物氨基酸含量在發(fā)酵前后的變化

3 討論

本試驗結(jié)果表明，發(fā)酵產(chǎn)物中類胡蘿卜素含量與固態(tài)發(fā)酵底物中麥麩的添加量呈顯著負(fù)相關(guān)。這一結(jié)果同過去的報道并不完全一致。眾所周知，適量添加麩皮可以增加培養(yǎng)基的蓬松程度，有助于氧氣的流通，促進(jìn)好氧菌的生長[14]。但是，發(fā)酵底物中麩皮含量過高會影響酵母菌的發(fā)酵，其原因在于麩皮纖維含量高，會影響酵母菌的正常生長[15]。為最大限度地利用廉價底物資源，本研究選擇了52.5%的麩皮含量作為最適濃度。與麥麩結(jié)果相反，發(fā)酵底物中豆粕含量與發(fā)酵產(chǎn)物中膠紅酵母活菌數(shù)呈極顯著正相關(guān)；發(fā)酵底物中玉米漿的含量與發(fā)酵產(chǎn)物中類胡蘿卜素的產(chǎn)量呈顯著正相關(guān)，可能是這些物質(zhì)含有酵母生長所必需的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素、微量元素及某些生長因子。

除麥麩、豆粕、玉米漿、米糠外，其他底物（玉米、硫酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂）與發(fā)酵產(chǎn)物中類胡蘿卜素含量及膠紅酵母活菌數(shù)均未達(dá)到顯著相關(guān)。王歲樓等[16]也報道，K+和Mg2+并不能提高紅酵母的類胡蘿卜素產(chǎn)量。但有研究表明，KH2PO4、MgSO4和(NH4)2SO4對發(fā)酵產(chǎn)物中類胡蘿卜素含量的影響均為正效應(yīng)，因此，建議提高發(fā)酵底物中上述物質(zhì)的實際水平[17-18]。另有研究表明，當(dāng)K2HPO4和MgSO4的濃度分別為1 g·L-1和10 g·L-1時，海洋紅酵母Y2細(xì)胞生物量最高；當(dāng)K2HPO4和MgSO4的濃度分別為2.5 g·L-1和8 g·L-1時，類胡蘿卜素產(chǎn)量最高[19]。因此，推測在一定劑量范圍內(nèi)，K+、PO43-、Mg2+、NH4+、SO42+與類胡蘿卜素產(chǎn)量可能表現(xiàn)出劑量-效應(yīng)關(guān)系，但超出一定范圍，劑量-效應(yīng)則不明顯，甚至出現(xiàn)膠紅酵母的生長或類胡蘿卜素的合成受到抑制的情況[20-23]。

在本研究中，溫度對類胡蘿卜素產(chǎn)量的影響最大，其次是pH，這一結(jié)果與趙紫華等[24]報道的相反。有關(guān)資料顯示，紅酵母發(fā)酵產(chǎn)類胡蘿卜素溫度一般在30℃左右[25]，且固態(tài)發(fā)酵適宜的溫度在25—35℃[26-27]，這些報道與本試驗結(jié)果基本相符。關(guān)于發(fā)酵底物最適pH的報道也不盡相同，Aksu和Eren[28]報道，膠紅酵母產(chǎn)類胡蘿卜素的最適pH為7.0；張闖[29]研究得出紅酵母發(fā)酵產(chǎn)類胡蘿卜素的最適pH為6.0；還有報道指出，膠紅酵母DBVPG 3853產(chǎn)類胡蘿卜素的最適值pH為5.8[16]。關(guān)于發(fā)酵時間，本試驗結(jié)果與梁曉華等[19]報道一致，而與王歲樓等[16]、劉卉琳[20]的報道不一致，原因可能是菌種、發(fā)酵底物或所采取的發(fā)酵工藝（固態(tài)與液態(tài)）不同。

本研究表明，膠紅酵母產(chǎn)胡蘿卜素的固態(tài)發(fā)酵工藝經(jīng)優(yōu)化后，發(fā)酵底物中的粗蛋白質(zhì)提高9.67%，粗纖維提高11.5%，粗脂肪降低16%，鈣和磷含量沒有顯著變化。此外，發(fā)酵后蘇氨酸、谷氨酸、脯氨酸濃度顯著高于發(fā)酵前，且總氨基酸含量提高了7.19%。通過發(fā)酵提高蛋白質(zhì)或氨基酸含量在過去的研究中已得到廣泛證實。Zhang等[30]研究表明，脫毒的麻籽餅粕經(jīng)固態(tài)發(fā)酵后粗脂肪顯著減少了5.53%，粗蛋白質(zhì)含量增加15.1%。王建軍[31]研究表明，利用混菌固態(tài)發(fā)酵黃酒糟后，發(fā)酵產(chǎn)物中共檢測出17種氨基酸，除組氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸外，其他14種氨基酸的含量均有不同程度的提高。孫展英[32]報道，利用曲霉X3發(fā)酵可使粗纖維含量降低51.3%，本研究發(fā)酵產(chǎn)物粗纖維升高可能與酵母菌基本不能利用纖維素類多糖有關(guān)。

4 結(jié)論

前人對膠紅酵母的研究多采用液態(tài)發(fā)酵，本試驗本著降低生產(chǎn)成本和環(huán)保的原則，采用固態(tài)發(fā)酵的方式。膠紅酵母固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)類胡蘿卜素底物的最佳配比為麥麩52.5%、豆粕20.0%、玉米粉3.00%、米糠14.0%、玉米漿10.0%、硫酸銨0.40%、磷酸二氫鉀0.05%和硫酸鎂0.04%；最佳發(fā)酵條件為菌液接種量5.0%、發(fā)酵時間72.0 h、發(fā)酵溫度28.0℃、pH 6.0、底物含水量60.0%。通過對膠紅酵母固態(tài)發(fā)酵底物與發(fā)酵條件的優(yōu)化，提高了發(fā)酵產(chǎn)物中類胡蘿卜素產(chǎn)量，并改善了發(fā)酵底物的營養(yǎng)價值，使膠紅酵母不僅可以生產(chǎn)類胡蘿卜素，而且其發(fā)酵后的產(chǎn)物也可以直接用來飼喂動物。但膠紅酵母固態(tài)產(chǎn)物對動物生產(chǎn)性能和在動物日糧中的最適添加量還需進(jìn)一步探究。

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（責(zé)任編輯 趙伶俐）

The Solid-state Fermentation Process offor Producing Carotenoids

SUN JiaJing, LI Mao, SUN ZhiHong, TANG ZhiRu, ZHANG XiangXin, CHEN JinChao

(College of Animal Science and Technology/Laboratory for Bio-Feed and Animal Nutrition, Southwest University, Chongqing 400715)

【Objective】This study was performed to enhance carotenoid yield, to improve nutritional value of fermentation product, and to reduce the production cost of carotenoids through optimizing solid-state fermentation substrate and fermentation conditions of【Method】In this study,TZR2014was used as a inoculant. First, the Mixture-Design of Design-Expert software was used to design the fermentation substrate, and the contents of ingredients as followed: 50%-80% wheat bran, 6%-20% soybean meal, 3%-15% maize flour, 2%-14% rice bran, 2%-10% maize syrup, 0.4%-2.5% ammonium sulfate, 0.05%-0.5% monopotassium phosphate, and 0.03%-0.3% magnesium sulfate. Then the optimal ratio of ingredients in substrate was determined according to the carotenoid yield. Based on this result, an L16(45) orthogonal design was used to optimize the fermentation conditions, including inoculum (5.0%-12.5%), fermentation time (60.0-96.0 h), fermentation temperature (26-32℃), and fermentation pH (60.0%-75.0%). Finally, the number ofand contents of carotenoids, crude fiber, crude protein, water, crude fat, ash, calcium, phosphorus, and amino acids in fermentation product were determined to evaluate the effects of the optimized fermentation process on the nutritional values of fermentation product. 【Result】The results showed that there was a positive correlation between maize starch content in substrate and carotenoid content in fermentation product (=0.344,=0.040) or between rice bran content in fermentation substrate and carotenoid content in fermentation product (=0.329,=0.050). There was a significantly negative correlation between carotenoid yield and the content of wheat bran in solid-state fermentation substrate (=-0.336,=0.045). There was a positive correlation between the number of live bacteria ofin fermentation product and the content of soybean meal in fermentation substrate (=0.510,=0.001). Inoculum, fermentation temperature, pH, and moisture had extremely significant impacts on the number of(＜0.01), thereinto, fermentation temperature had the greatest effect on the number of, followed by moisture, inoculum, and pH. Fermentation time, fermentation temperature, and pH had extremely significant influences on the carotenoid content in the fermentention product (＜0.01), and fermentation temperature had the greatest influence on the carotenoid content in the fermented product, followed by pH and fermentation time. After the optimization of the fermentation process, the carotenoid yield byTZR2014was increased to 4 535 μg·kg-1; the bacteria number was increased to 3.79×109CFU/kg; the contents of crude fiber, crude protein, ash, threonine, glutamate, and proline in fermentation product were significantly increased (＜0.05), meanwhile, the contents of histidine, water, and crude fat was significantly decreased (＜0.05). 【Conclusion】The optimal ratio of solid-state fermentation substrate forwas as followed: 52.5% wheat bran, 20.0% soybean meal, 3.0% maize flour, 14.0% rice bran, 10.0% maize syrup, 0.4% ammonium sulfate, 0.05% monopotassium phosphate, and 0.04% magnesium sulfate. The optimal fermentation conditions were as followed: inoculum 5.0%, fermentation time 72 h, fermentation temperature 28.0℃, pH 6.0, and moisture 60.0%. The results suggested that the optimized fermentation process ofenhanced the yield of carotenoids and improved the nutritional value of fermentation product.

; solid-state fermentation; carotenoids; fermentation substrates; fermentation conditions

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.10.017

2017-10-09；

2018-03-05

國家自然科學(xué)基金（31772610）、重慶市留學(xué)人才創(chuàng)新計劃重點項目（cx2017024）、農(nóng)業(yè)部“948”項目（2015-Z74）

孫佳靜，E-mail：2020853948@qq.com。通信作者孫志洪，E-mail：465179460@qq.com