短小芽孢桿菌AR03揮發(fā)性有機(jī)物的抑菌活性及其組分分析

王靜，曹建敏，陳德鑫，邱軍，王曉強(qiáng)，馮超，王文靜

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短小芽孢桿菌AR03揮發(fā)性有機(jī)物的抑菌活性及其組分分析

王靜，曹建敏，陳德鑫，邱軍，王曉強(qiáng)，馮超，王文靜

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，山東青島 266101）

【目的】對(duì)分離自煙草根際土壤中的一株短小芽孢桿菌（）AR03菌株產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)物進(jìn)行抑菌活性測(cè)定和組分分析。【方法】采用培養(yǎng)皿對(duì)扣熏蒸法和凹玻片孢子萌發(fā)法測(cè)定揮發(fā)性有機(jī)物對(duì)煙草黑脛病菌（var.）和赤星病菌（）菌落、菌絲生長(zhǎng)以及孢子萌發(fā)的影響，采用離體葉片接種法測(cè)定揮發(fā)性有機(jī)物對(duì)煙草黑脛病和赤星病的防治效果；采用頂空加熱法收集抑菌揮發(fā)性有機(jī)物，對(duì)其進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS)檢測(cè)，并結(jié)合保留指數(shù)（retention index，RI）和內(nèi)標(biāo)（internal standard，IS）1-十五烯對(duì)其組分進(jìn)行定性和定量分析?！窘Y(jié)果】短小芽孢桿菌AR03菌株分泌的揮發(fā)性有機(jī)物對(duì)供試的兩種病原真菌均具有一定的抑制作用，表現(xiàn)為經(jīng)處理后的煙草黑脛病菌菌絲生長(zhǎng)稀疏緩慢變粗、分支增多且扭曲、斷裂；赤星病菌菌絲生長(zhǎng)畸形，其上不產(chǎn)生分生孢子梗，內(nèi)含物大部分聚集成團(tuán)導(dǎo)致菌絲干癟、縊縮。對(duì)峙培養(yǎng)2、4、6和8 d時(shí)，揮發(fā)物對(duì)黑脛病菌和赤星病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制率分別為56.21%和59.23%、64.75%和59.86%、66.13%和61.10%、67.04%和70.00%；對(duì)黑脛病菌游動(dòng)孢子和赤星病菌分生孢子的抑制作用表現(xiàn)為延遲萌發(fā)且萌發(fā)后的芽管生長(zhǎng)緩慢；黑脛病菌產(chǎn)生孢子囊數(shù)明顯減少，赤星病菌分生孢子各分隔處的細(xì)胞畸形腫脹成泡狀。離體葉片抗病測(cè)定結(jié)果顯示，揮發(fā)性有機(jī)物抑制黑脛病菌和赤星病菌病斑在葉片的擴(kuò)展,對(duì)峙熏蒸40 h時(shí)，對(duì)照葉片黑脛病的發(fā)病率為92.50%，圓形壞死病斑直徑是25.10 mm，經(jīng)揮發(fā)物處理后葉片發(fā)病率為70.83%，病斑直徑為9.45 mm，對(duì)黑脛病斑擴(kuò)散的抑制率為62.35%；對(duì)峙熏蒸80 h時(shí)，對(duì)照葉片赤星病的發(fā)病率為88.33%，病斑擴(kuò)散為近圓形的褐色壞死斑，平均直徑為8.32 mm，經(jīng)揮發(fā)物處理后赤星病的發(fā)病率為60.80%，病斑擴(kuò)展較慢，平均直徑為2.85 mm，揮發(fā)物對(duì)赤星病斑擴(kuò)散的抑制率為65.75%。SPME GC-MS分析表明，AR03菌株胞外分泌7種組分揮發(fā)性物質(zhì)，均為C15H24結(jié)構(gòu)的倍半萜烯類(lèi)化合物，分別是二氫姜黃烯、()--金合歡烯、-姜黃烯、-姜烯、-紅沒(méi)藥烯、-倍半萜水芹烯和--紅沒(méi)藥烯；AR03培養(yǎng)1 d后，其中-倍半萜水芹烯相對(duì)含量最高，為80.64%，其次為()--金合歡烯和-姜烯，相對(duì)含量分別為7.20%和6.67%；隨著AR03培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各組分種類(lèi)相同，但相對(duì)含量差異較大，除二氫姜黃烯含量保持基本不變外，其他組分含量呈遞減趨勢(shì)，培養(yǎng)至第6天時(shí)，各組分含量下降超過(guò)50%。【結(jié)論】短小芽孢桿菌AR03菌株能夠產(chǎn)生具有較強(qiáng)抑菌活性的揮發(fā)性有機(jī)物，有潛力作為開(kāi)發(fā)抗真菌代謝物和新藥物的重要微生物資源。

短小芽孢桿菌AR03; 揮發(fā)性有機(jī)物；煙草黑脛病菌；煙草赤星病菌；頂空-固相微萃取-氣質(zhì)聯(lián)用

0 引言

【研究意義】煙草黑脛病（病原菌var.）和赤星?。ú≡┦峭{世界煙草生產(chǎn)的兩個(gè)重要病害。黑脛病常導(dǎo)致植株萎蔫壞死、根部變黑腐爛，最終整株死亡，每年對(duì)世界煙草生產(chǎn)造成百億美元的損失[1]。目前，黑脛病的防治措施主要包括健康栽培、抗性品種利用、合理輪作及殺菌劑甲霜靈（metalaxyl）的施用。然而，長(zhǎng)期大量施用甲霜靈會(huì)帶來(lái)環(huán)境問(wèn)題并產(chǎn)生抗甲霜靈菌株的風(fēng)險(xiǎn)[2]。赤星病是煙草成熟期葉部重要的病害之一，氣候適宜往往暴發(fā)流行，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。使用化學(xué)殺菌劑是赤星病防治的主要措施，但可能會(huì)導(dǎo)致烤后煙葉農(nóng)殘超標(biāo)。因此，尋找能持續(xù)防控此病害和其他作物同類(lèi)病害的新途徑具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】利用有益微生物（生物農(nóng)藥）作為合理而安全的作物管理措施是較有前景的方法[3]?；谵卓刮⑸锖筒≡锘プ鞯纳锓乐伪徽J(rèn)為是減少化學(xué)農(nóng)藥使用和改善植物健康的可替代或補(bǔ)充的方式[4-5]。研究表明，生物防治因子（biological control agents，BCAs）如芽孢桿菌（）、假單胞菌（）、放線菌（）、木霉菌（）和酵母菌（yeast）在抑制病原細(xì)菌和真菌方面均具有良好的表現(xiàn)[6-10]。生物防治因子的作用機(jī)制主要包括抗生作用，定殖位點(diǎn)、營(yíng)養(yǎng)或礦物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)，寄生和噬菌體[11]；其中通過(guò)分泌抗真菌代謝物質(zhì)（antifungal metabolites，AFMs）來(lái)發(fā)揮對(duì)病原真菌的抗生作用是最常見(jiàn)的策略，目前研究較多的抗真菌代謝物質(zhì)主要有抗生素、酶和揮發(fā)物[12]。作為抗真菌代謝物質(zhì)之一的混合著各種以碳為基礎(chǔ)的氣相混合物的揮發(fā)性有機(jī)物（volatile organic compounds，VOCs），由于其小分子，體積小，易擴(kuò)散到大氣和土壤中，是理想的信息素，并且已被應(yīng)用于昆蟲(chóng)、致病和污染有害菌的生物防治。作為生物防治因子的芽孢桿菌屬細(xì)菌種類(lèi)繁多，能夠產(chǎn)生大量廣譜且具有抗生活性的次生代謝產(chǎn)物，其中環(huán)狀的脂肽類(lèi)物質(zhì)具有抗真菌和細(xì)菌等生物學(xué)功能[13]，在這些抗生物質(zhì)中，揮發(fā)性物質(zhì)大都是由一組低分子量親脂類(lèi)物質(zhì)組成的混合物，來(lái)源于很多微生物的不同生物合成途徑，其中的一些揮發(fā)性代謝產(chǎn)物可采用氣體處理的方式用于生物熏蒸[14]。圍繞芽孢桿菌屬細(xì)菌產(chǎn)生揮發(fā)物的抗生活性已展開(kāi)了廣泛的研究，20世紀(jì)90年代，F(xiàn)iddaman等[15]報(bào)道了枯草芽孢桿菌（）分泌抗真菌揮發(fā)性物質(zhì)過(guò)程中培養(yǎng)基質(zhì)的重要性。近來(lái)又相繼報(bào)道了解淀粉芽孢桿菌（）在果實(shí)病害防治中的應(yīng)用，解淀粉芽孢桿菌CPA-8產(chǎn)生的揮發(fā)物質(zhì)抑制甜櫻桃采后果實(shí)腐爛真菌核果褐腐菌（）、美澳型核果褐腐菌（）和灰葡萄孢（）菌絲的生長(zhǎng)，能減輕櫻桃采后腐爛程度。通過(guò)SPME-GC分析，CPA-8產(chǎn)生的主要揮發(fā)物為1,3-戊二烯、3-羥基丁酮和噻吩，各純品的體外菌絲生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)和對(duì)3種腐爛病菌的EC50測(cè)定結(jié)果顯示，噻吩是揮發(fā)物中最有效的成分[16]。在防治植物細(xì)菌病害方面，解淀粉芽孢桿菌T-5菌株產(chǎn)生的揮發(fā)物能夠明顯地抑制引起番茄青枯病的青枯雷爾氏菌（），且對(duì)該病菌的運(yùn)動(dòng)性、根部定殖、生物膜形成及其胞外多糖的產(chǎn)生具有抑制作用[17]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】分離自貴州煙區(qū)黑脛病田塊健康煙株根際土壤的短小芽孢桿菌（）AR03菌株，對(duì)煙草黑脛病菌、赤星病菌、青枯病菌、白粉病菌和炭疽病菌均有較好的拮抗活性，兼具促生作用[18-21]。進(jìn)一步的研究表明，AR03發(fā)酵液（3×108cfu/ml）對(duì)上述病原菌具有拮抗活性，但其除菌上清液卻無(wú)活性。筆者對(duì)該拮抗菌株分泌的活性物質(zhì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該菌株能夠產(chǎn)生揮發(fā)性物質(zhì)且具有拮抗活性?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】分析短小芽孢桿菌AR03菌株產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)煙草黑脛病菌、赤星病菌的抑菌活性及其組成成分，為該菌株在病害生物防治上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2016年9月至2017年9月在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所完成。

1.1 供試菌株、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件與試劑

短小芽孢桿菌AR03（CGMCC No. 4117）分離和鑒定參見(jiàn)文獻(xiàn)[18]。常規(guī)活化采用NA培養(yǎng)基（酵母提取物5.0 g，蛋白胨5.0 g，氯化鈉1.5 g，瓊脂13.0 g，蒸餾水1 L，pH 7.3，121℃滅菌20 min），28℃恒溫、黑暗條件培養(yǎng)36 h。將AR03接種于NB培養(yǎng)基（配方同NA，不加瓊脂）中，120 r/min、28℃振蕩培養(yǎng)48 h后獲得AR03發(fā)酵液，經(jīng)低溫冷凍離心后的菌體經(jīng)適量ddH2O梯度稀釋后，采用分光光度計(jì)調(diào)整菌體懸浮液濃度為108cfu/mL，備用。

煙草黑脛病菌和煙草赤星病菌為筆者實(shí)驗(yàn)室在田間病株采集、分離、鑒定并保存。活化黑脛病菌和赤星病菌培養(yǎng)基分別為燕麥培養(yǎng)基（OA）和馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA），28℃培養(yǎng)5 d后備用。皮氏培養(yǎng)液：硝酸鈣0.4 g，磷酸二氫鉀0.15 g，硝酸鎂0.15 g，氯化鈣0.06 g，蒸餾水1 L，121℃ 15 min滅菌，備用。土壤浸出液：稱(chēng)取煙草品種紅花大金元根際土壤25 g，溶于50 g蒸餾水中，攪拌均勻后室溫靜置30 min，經(jīng)濾紙過(guò)濾后的溶液121℃ 15 min滅菌，備用。手動(dòng)萃取手柄，50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，20 mL棕色頂空瓶，購(gòu)自美國(guó)Supelco公司；1-十五烯、正構(gòu)烷烴（C7-C30）購(gòu)自北京百靈威公司；二氯甲烷、甲醇均為色譜純；美國(guó)安捷倫7890B-5975C氣相色譜質(zhì)譜儀。

1.2 揮發(fā)性有機(jī)物對(duì)煙草黑脛病菌和赤星病菌體外抑制作用測(cè)定

1.2.1 對(duì)菌絲生長(zhǎng)和形態(tài)的影響 接種環(huán)粘取活化的AR03菌落后均勻、密集地于NA平板上劃線，使該細(xì)菌布滿平板；另取煙草黑脛病菌和赤星病菌菌碟（Φ=5 mm）分別接種于OA和PDA平板的中央，參照王靜等[21]方法在距菌碟1.5 cm處30°傾斜插入滅菌的蓋玻片，然后與布滿AR03菌體的NA平板對(duì)扣，周?chē)梅饪谀っ芊猓?8℃、黑暗條件下恒溫培養(yǎng)，另以空白NA平板為對(duì)照，間隔2 d分別觀察并測(cè)量處理和對(duì)照平板菌落直徑，一直到對(duì)照平板菌絲長(zhǎng)滿，共調(diào)查4次，每處理3次重復(fù)。生長(zhǎng)抑制率計(jì)算公式參照周翠等[22]，比較揮發(fā)物的拮抗效果。試驗(yàn)重復(fù)2次。抑制率計(jì)算公式：

抑制率（%）=（單獨(dú)培養(yǎng)菌落直徑-菌落趨向直徑）/單獨(dú)培養(yǎng)菌落直徑×100

分別將培養(yǎng)6 d的煙草黑脛病菌和赤星病菌培養(yǎng)皿內(nèi)附著菌絲的蓋玻片置于倒置顯微鏡下（目鏡10倍）觀察經(jīng)揮發(fā)物處理后菌絲的形態(tài)變化。

1.2.2 對(duì)孢子萌發(fā)的影響 首先制備煙草黑脛病菌游動(dòng)孢子懸浮液和赤星病菌分生孢子懸浮液。分別將預(yù)先活化的黑脛病菌和赤星病菌菌碟（Φ=5 mm）接種于OA和PDA平板中央28℃培養(yǎng)14 d后，誘導(dǎo)黑脛病菌產(chǎn)生孢子囊和游動(dòng)孢子懸浮液制備方法如下：在盛有15 mL皮氏培養(yǎng)液無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)接入8個(gè)黑脛病菌菌碟（Φ=6 mm），然后加入100 μL土壤浸出液，置于28℃恒溫箱中黑暗培養(yǎng)3 d后，將培養(yǎng)皿置于4℃擱置2 h，再轉(zhuǎn)到28℃條件培養(yǎng)18 h，在無(wú)菌條件下，將培養(yǎng)皿內(nèi)的菌餅移入盛有適量無(wú)菌水的離心管中，輕微振蕩后經(jīng)4層無(wú)菌紗布過(guò)濾收集游動(dòng)孢子，載玻片法在光學(xué)顯微鏡下觀察，隨后通過(guò)梯度稀釋和血小球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法將游動(dòng)孢子懸浮液調(diào)整為2×104個(gè)/mL備用。赤星病菌孢子懸浮液制備方法如下：倒入適量的無(wú)菌水于長(zhǎng)滿菌絲的平板內(nèi)，用涂布器涂布平板表面，使得菌絲和孢子懸浮于無(wú)菌水中，將此混合液經(jīng)4層無(wú)菌紗布過(guò)濾后并收集，按照上述方法在倒置顯微鏡下觀察并調(diào)整孢子懸浮液濃度為2×104個(gè)/mL，備用。

各取100 μl黑脛病菌游動(dòng)孢子懸浮液和赤星病菌孢子懸浮液置于滅菌的凹玻片上，同時(shí)置于保濕的培養(yǎng)皿內(nèi)，上面倒扣均勻劃滿AR03菌體的NA平板，對(duì)照為NA培養(yǎng)基，封口膜密封后置于28℃恒溫分別黑暗培養(yǎng)6 h后，在倒置顯微鏡下觀察形態(tài)變化。每個(gè)視野觀察10個(gè)孢子，共觀察5個(gè)視野，芽管的長(zhǎng)度是孢子的兩倍視為孢子萌發(fā)。計(jì)算各處理抑制游動(dòng)孢子和分生孢子萌發(fā)和生長(zhǎng)的抑制率，每處理3次重復(fù)。試驗(yàn)重復(fù)2次。孢子萌發(fā)抑制率計(jì)算公式：

孢子萌發(fā)抑制率（%）=（對(duì)照組孢子萌發(fā)數(shù)-處理組孢子萌發(fā)數(shù)）/對(duì)照組孢子萌發(fā)數(shù)×100

1.2.3 揮發(fā)性有機(jī)物離體葉片的抑菌測(cè)定 揮發(fā)物抑制煙草黑脛病和赤星病的離體葉片生測(cè)接種采用菌餅接種和孢子懸浮液懸滴接種，具體如下：于NA平板（直徑15 cm）密集劃線接種AR03菌株，對(duì)照為空白的NA平板；另外培養(yǎng)皿底部分別放置2片大小適宜的煙草葉片紅花大金元（用于黑脛病生測(cè)試驗(yàn)）和品種NC89（成熟期，用于赤星病抗病試驗(yàn)），浸濕的棉球包圍葉柄保濕，葉片表面無(wú)菌水噴霧后，在主脈兩側(cè)各選取適宜數(shù)量的接種點(diǎn)，針刺制造傷口后，分別接種黑脛病菌碟（Φ=6 mm）和懸滴100 μL赤星病菌孢子懸浮液（濃度為1×107個(gè)孢子/mL），每處理10個(gè)皿，3次重復(fù)。將接種細(xì)菌的培養(yǎng)皿與接種葉片的培養(yǎng)皿對(duì)扣后Parafilm封口膜密封，30℃黑暗條件下對(duì)峙培養(yǎng)40 h和80 h后調(diào)查病斑在葉片上擴(kuò)展情況并計(jì)算抑制率。抑制率計(jì)算公式：

病斑擴(kuò)展抑制率（%）=（對(duì)照組病斑直徑-處理組病斑直徑）/對(duì)照組病斑直徑×100

1.3 揮發(fā)性有機(jī)物的收集及其組分分析

1.3.1 1-十五烯內(nèi)標(biāo)溶液配制 稱(chēng)取20 mg 1-十五烯對(duì)照品，純度不低于98.5%，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，得到濃度為2 mg·mL-11-十五烯內(nèi)標(biāo)母液，然后取適量1-十五烯內(nèi)標(biāo)母液用甲醇稀釋400倍，得到濃度為5 μg·mL-11-十五烯內(nèi)標(biāo)溶液，備用。

1.3.2 AR03細(xì)菌揮發(fā)物收集-頂空-固相微萃取法 移液器吸取3 mL尚未冷卻的NA培養(yǎng)基（約55℃），傾倒于20 mL滅菌的棕色頂空瓶中，并將瓶體傾斜15°角，待培養(yǎng)基冷卻凝固后，取100 μL預(yù)先制備好的AR03菌懸液均勻涂布于培養(yǎng)基斜面上，迅速用含有聚四氟內(nèi)涂層的瓶蓋封口，將頂空瓶置于28℃恒溫箱中靜置、黑暗培養(yǎng)，為了排除培養(yǎng)基釋放的揮發(fā)物和萃取頭涂層流失對(duì)細(xì)菌揮發(fā)物鑒定結(jié)果的干擾，設(shè)置不涂布AR03菌懸液處理為空白對(duì)照，每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)。

將培養(yǎng)2 d的頂空瓶置于室溫中平衡20 min后，采用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭（購(gòu)于Supelco公司）進(jìn)行采樣，萃取頭使用前，需先按照廠家提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行老化。采樣前首先用5 μL尖頭微量注射器向頂空瓶側(cè)壁注入2 μL濃度為5 μg·mL-11-十五烯內(nèi)標(biāo)溶液，注意盡量避免接觸培養(yǎng)基基質(zhì)，平衡30 min后，將SPME針管刺入頂空瓶，同時(shí)將萃取頭推出，置于頂空瓶上部1/3處，采集細(xì)菌分泌的揮發(fā)性有機(jī)物，采樣時(shí)間為30 min。采集完畢后，將萃取頭收起，并將針管拔出樣品瓶，樣品收集結(jié)束。

1.3.3 利用氣象色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）技術(shù)分析揮發(fā)性物質(zhì)組分 GC-MS分析條件：色譜柱DB-5MS彈性毛細(xì)管色譜柱，規(guī)格為30 m×0.25 mm×0.25 μm；進(jìn)樣口250℃：不分流模式；初始溫度40℃，以100℃·min-1速率升至250℃，解吸時(shí)間5 min；載氣為99.999%氦氣，流速為1.0 mL·min-1；柱溫箱：初始溫度40℃，保持2 min，以5℃·min-1速率升至180℃，保持10 min，以10℃·min-1速率升至280℃，保持15 min，總運(yùn)行時(shí)間為55 min；EI離子源，電子能量70 ev；離子源溫度230℃，四級(jí)桿溫度150℃，傳輸線溫度280℃；全掃描模式，掃描范圍30—400 m/z。數(shù)據(jù)采集處理系統(tǒng)，安捷倫MassHunter（B.05.02）軟件。

1.3.4 抑菌揮發(fā)性有機(jī)物成分鑒定 揮發(fā)物MS結(jié)果經(jīng)NIST和WILIY譜庫(kù)自動(dòng)檢索，要求匹配率＞80，初步進(jìn)行識(shí)別。對(duì)于識(shí)別的每種代謝物，根據(jù)其相鄰正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間和碳原子數(shù)，計(jì)算其保留指數(shù)，然后查閱文獻(xiàn)報(bào)道的該物質(zhì)在相同色譜柱中的保留指數(shù)（retention index，RI），進(jìn)一步進(jìn)行確證。保留指數(shù)計(jì)算公式：

RI=100z+100[TR(x)-TR(z)]/[TR(z+1)-TR(z)]（線性程序升溫）

式中，TR(x)、TR(z)、TR(z+1)分別代表組分x及碳數(shù)為z、z+1正構(gòu)烷的保留溫度。且TR(z)＜TR(x)＜TR(z+1)，由于保留溫度和保留時(shí)間通常具有高度的相關(guān)性，所以用保留時(shí)間代替上式中的保留溫度來(lái)進(jìn)行計(jì)算保留指數(shù)。

1.3.5 不同生長(zhǎng)期抑菌揮發(fā)性有機(jī)物組分定量分析 按照1.3.2方法分別將培養(yǎng)1、3、6 d的AR03，按照1.3.2、1.3.3和1.3.4方法收集細(xì)菌揮發(fā)物進(jìn)行GC-MS檢測(cè)，并進(jìn)行定量分析。抑菌揮發(fā)性有機(jī)物半定量分析以添加到頂空瓶中的1-十五烯作為內(nèi)標(biāo)（internal standard，IS），假設(shè)內(nèi)標(biāo)與生防菌株AR03揮發(fā)物的相對(duì)校正因子為1，按下述公式計(jì)算目標(biāo)代謝物的相對(duì)含量。

mi= m15×（Ai/A15）

式中，mi為目標(biāo)代謝物含量（μg）；m15為加入1-十五烯的量（μg）；Ai為目標(biāo)代謝物總離子流圖峰面積；A15為1-十五烯總離子流圖峰面積。

2 結(jié)果

2.1 揮發(fā)性有機(jī)物對(duì)供試病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響

平板對(duì)扣法測(cè)定結(jié)果顯示，揮發(fā)性有機(jī)物對(duì)煙草黑脛病菌和赤星病菌菌絲生長(zhǎng)的抑制作用較強(qiáng)，對(duì)赤星病菌的抑制表現(xiàn)為菌落生長(zhǎng)緩慢且培養(yǎng)性狀異常；對(duì)黑脛病菌的抑制表現(xiàn)為菌絲生長(zhǎng)稀疏且菌落生長(zhǎng)遲緩，而對(duì)照菌落生長(zhǎng)正常（圖1-A、1-B）。培養(yǎng)6 d的黑脛病菌和赤星病菌菌絲生長(zhǎng)速率的測(cè)定結(jié)果如圖2。從圖中可以看出，該抑菌揮發(fā)物對(duì)兩種供試病原菌菌絲生長(zhǎng)均有不同程度的抑制作用，抑制率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而增長(zhǎng)，對(duì)峙培養(yǎng)8 d時(shí)，對(duì)黑脛病菌和赤星病菌的菌絲生長(zhǎng)抑制率分別為67.04%和70.00%。鏡檢觀察顯示，揮發(fā)物處理后的黑脛病菌生長(zhǎng)緩慢、稀疏，菌絲扭曲、分枝增多且斷裂；經(jīng)揮發(fā)物處理的赤星病菌菌絲畸形，其上不產(chǎn)生分生孢子梗，內(nèi)含物聚集成團(tuán)導(dǎo)致菌絲粗細(xì)不均、縊縮。

圖1 揮發(fā)性有機(jī)物對(duì)煙草赤星病菌（A）和黑脛病菌（B）的抑菌活性

2.2 揮發(fā)性有機(jī)物對(duì)供試病原菌孢子萌發(fā)的影響

赤星病菌菌分生孢子經(jīng)抑菌揮發(fā)性有機(jī)物處理后萌發(fā)受到抑制，且延遲萌發(fā)后的芽管生長(zhǎng)緩慢、短小畸形，大部分分生孢子畸形，表現(xiàn)為各分隔處的細(xì)胞腫脹成圓球狀泡或其他不規(guī)則形，而對(duì)照孢子均正常萌發(fā)且芽管生長(zhǎng)正常。經(jīng)揮發(fā)性有機(jī)物處理后的黑脛病菌產(chǎn)生的孢子囊數(shù)量明顯減少游動(dòng)孢子萌發(fā)延遲，且萌發(fā)后芽管比空白對(duì)照生長(zhǎng)緩慢。

2.3 揮發(fā)性有機(jī)物抑菌活性的離體葉片測(cè)定

揮發(fā)性有機(jī)物抑菌試驗(yàn)結(jié)果如表1和圖3，培養(yǎng)至40 h和80 h，對(duì)照葉片的病斑擴(kuò)散迅速，黑脛病發(fā)病率為92.50%，病斑表現(xiàn)為水浸狀斑塊沿接種點(diǎn)向周?chē)鷶U(kuò)散為近圓形，病斑直徑平均為25.10 mm；經(jīng)揮發(fā)物處理后葉片發(fā)病率為70.83%，病斑直徑的平均值為9.45 mm，揮發(fā)物對(duì)黑脛病斑擴(kuò)散的抑制率為62.35%。對(duì)照葉片赤星病的發(fā)病率為88.33%，病斑擴(kuò)散為近圓形的褐色壞死斑，平均直徑為8.32 mm；經(jīng)揮發(fā)物處理后赤星病的發(fā)病率為60.80%，病斑擴(kuò)展較慢，平均直徑為2.85 mm，揮發(fā)物對(duì)赤星病斑擴(kuò)散的抑制率為65.75%。

圖2 揮發(fā)性有機(jī)物對(duì)煙草赤星病菌和黑脛病菌菌絲生長(zhǎng)的影響

2.4 基于SPME GC-MS技術(shù)獲得AR03抑菌揮發(fā)性有機(jī)物總離子流圖

將上述獲得的吸附揮發(fā)物的萃取頭，在全掃描模式下進(jìn)行分析，得到正構(gòu)烷烴（C10-C20）、空白樣品揮發(fā)物和細(xì)菌揮發(fā)性有機(jī)物的總離子流圖（圖4-A、4-B、4-C）。根據(jù)前期試驗(yàn)結(jié)果，初步判定AR03產(chǎn)生的抑菌代謝混合物為倍半萜烯類(lèi)物質(zhì)（C15H24），本方法選用結(jié)構(gòu)式相近的1-十五烯為內(nèi)標(biāo)物（C15H30），因其屬性與目標(biāo)代謝物相似，在色譜圖中出峰時(shí)間比較接近，且經(jīng)檢驗(yàn)AR03抑菌揮發(fā)代謝物在十五烯的保留時(shí)間內(nèi)，無(wú)干擾峰出現(xiàn)（圖4-A）。將GC-MS采集的AR03揮發(fā)物總離子流圖，扣除空白樣品揮發(fā)物總離子流圖中共有色譜峰（圖4-B），即為揮發(fā)性有機(jī)物特征指紋峰（圖4-C），該菌體分泌的抑菌揮發(fā)性有機(jī)物共為7種，色譜峰出現(xiàn)的時(shí)間相對(duì)集中于22—25 min，主要成分為保留時(shí)間24.72 min的一種化合物，相對(duì)含量很高，而其他各物質(zhì)含量相對(duì)較低，且各揮發(fā)物間不存在重疊性。

A：對(duì)赤星病的抑制效果Inhibition effect on tobacco brown spot；B：對(duì)黑脛病的抑制效果Inhibition effect on tobacco black shank

表1 AR03菌株分泌的揮發(fā)性有機(jī)物對(duì)煙草黑脛病和赤星病的防治效果

A：正構(gòu)烷烴（C10-C20）總離子流圖Total ion flow diagram of n-alkanes (C10-C20)；B：空白基質(zhì)揮發(fā)物總離子流圖Total ion flow chart of volatile matter in blank matrix；C：AR03揮發(fā)物總離子流圖Total ion flow chart of volatile matter in AR03

2.5 揮發(fā)性有機(jī)物的定性與定量分析

將2.4中獲得細(xì)菌揮發(fā)物總離子流圖，扣除空白樣品揮發(fā)物總離子流圖中共有色譜峰，即為AR03菌株釋放的揮發(fā)性特征指紋峰。計(jì)算每個(gè)色譜峰的保留指數(shù)，結(jié)合使用NIST和WILIY譜庫(kù)，對(duì)總離子圖中色譜峰進(jìn)行定性識(shí)別，設(shè)置匹配度閾值為80，AR03抑菌揮發(fā)代謝物定性匹配結(jié)果見(jiàn)表2，該菌株分泌的抑菌揮發(fā)物共7種且均為C15H24結(jié)構(gòu)的倍半萜烯類(lèi)化合物，根據(jù)色譜峰出現(xiàn)的先后順序分別為二氫姜黃烯、()--金合歡烯、-姜黃烯、-姜烯、-紅沒(méi)藥烯、-倍半萜水芹烯和--紅沒(méi)藥烯；內(nèi)標(biāo)1-十五烯在色譜圖中出峰時(shí)間比較接近，且經(jīng)檢驗(yàn)AR03抑菌揮發(fā)性有機(jī)物在十五烯的保留時(shí)間內(nèi)。

2.6 不同生長(zhǎng)期AR03揮發(fā)性有機(jī)物定量分析

AR03菌株分別培養(yǎng)1、3和6 d后，其分泌的抑菌揮發(fā)性有機(jī)物相對(duì)含量有一定差異（表3），且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈遞減趨勢(shì)，當(dāng)細(xì)菌培養(yǎng)1 d時(shí)，揮發(fā)物各組分相對(duì)含量最高，尤其是-倍半萜水芹烯的分泌量高達(dá)112.01 ng，占總含量的80.64%，其次為()--金合歡烯和-姜烯，相對(duì)含量分別為7.20%和6.67%；培養(yǎng)至3 d時(shí)，除了二氫姜黃烯含量小幅度升高外，揮發(fā)物其他各組分相對(duì)含量均逐漸降低，培養(yǎng)至6 d時(shí)，相對(duì)含量減少50%左右，各組分含量下降較明顯。

表2 AR03菌株抑菌揮發(fā)性有機(jī)物的鑒定

表3 AR03菌株揮發(fā)性有機(jī)物組分定量分析

3 討論

能分泌抑菌揮發(fā)性有機(jī)物的細(xì)菌在微生物界普遍存在，Zou等[23]隨機(jī)選擇1 018種細(xì)菌中，有328株細(xì)菌可以產(chǎn)生抗真菌的揮發(fā)性物質(zhì)。與非揮發(fā)性抗菌物質(zhì)相比，揮發(fā)性抑菌物質(zhì)分子小，更易于在土壤和環(huán)境中滲透和擴(kuò)散，能更全方位地殺滅環(huán)境中的病原菌，并能通過(guò)調(diào)節(jié)激素的代謝促進(jìn)植物生長(zhǎng)[24]。在植物病害生物防治中，細(xì)菌分泌抗真菌性揮發(fā)物質(zhì)的鑒定及其應(yīng)用是由Fernando等[25]首次報(bào)道，分離自大豆根部的綠針假單胞菌（）PA-23揮發(fā)物在體外和土壤中能抑制核盤(pán)菌（）菌絲生長(zhǎng)及子囊孢子和菌核的萌發(fā)，凹玻片萌發(fā)法測(cè)定結(jié)果顯示揮發(fā)物對(duì)子囊孢子萌發(fā)的抑制率為54%—90%；本研究中的短小芽孢桿菌AR03菌株產(chǎn)生的揮發(fā)物對(duì)煙草黑脛病菌和赤星病菌菌絲、菌落生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)具有不同程度的抑菌和致畸作用，結(jié)合AR03菌株先前的研究結(jié)果分析其活性物質(zhì)，該菌株產(chǎn)生胞外抑菌揮發(fā)物與其拮抗活性緊密相關(guān)，且是該菌株對(duì)黑脛病菌和赤星病菌拮抗機(jī)制的關(guān)鍵因子。揮發(fā)性有機(jī)物是很理想的信息化學(xué)物質(zhì)，由于它們的易擴(kuò)散性，揮發(fā)物的活動(dòng)范圍可以從近處的互作擴(kuò)展到更遠(yuǎn)的距離[26]。本試驗(yàn)中，AR03菌株分泌的抑菌揮發(fā)物利用其擴(kuò)散的特性，抑制了離體葉片上病斑的擴(kuò)展，從而減輕病害發(fā)生。在煙草生產(chǎn)上，可以將菌株施入土壤或噴施在葉片上，產(chǎn)生的抑菌揮發(fā)物在土壤或煙株周?chē)沫h(huán)境中擴(kuò)散進(jìn)而充分保護(hù)煙株根部或葉片免受病原菌的侵染。

細(xì)菌在代謝過(guò)程中產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)較多，Kai等[11]通過(guò)頂空收集法和GC-MS技術(shù)分析了不同細(xì)菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)不同的細(xì)菌能分別產(chǎn)生1—30種不同組分的揮發(fā)性化合物。已有很多研究報(bào)道了關(guān)于揮發(fā)性有機(jī)物具有抗植物病原真菌的活性，例如三甲胺（trimethylamine）抑制白地霉（）菌絲生長(zhǎng)和孢子形成[27]，Almenar等[28]鑒定了spp.產(chǎn)生的14種不同的揮發(fā)物，包括二乙基己醇（2-ethyl-hexanol）、對(duì)羥基苯甲醛（4-hydroxybenzaldehyde）和壬酮（2-nonanone）等抗真菌揮發(fā)物；Arrebola等[29]采用GC-MS技術(shù)檢測(cè)分析拮抗果實(shí)采后病菌青霉（）的枯草芽孢桿菌PPCB01和解淀粉芽孢桿菌PPCB04產(chǎn)生揮發(fā)性抑菌物質(zhì)，PPCB01菌株產(chǎn)生21種不同類(lèi)型的揮發(fā)物，而PPCB04菌株產(chǎn)生8種不同的揮發(fā)物，其中3-羥基-2-丁酮是主要抑菌成分，含量分別為45.98%和97.52%。在本研究中，采用將AR03菌株產(chǎn)生的揮發(fā)性有機(jī)物經(jīng)頂空收集采樣并進(jìn)行GC-MS定性和定量分析，省去了普遍采用有機(jī)溶劑萃取的步驟，避免了有機(jī)溶劑不能完全萃取到所有揮發(fā)物質(zhì)的缺點(diǎn)。GC-MS分析表明，AR03菌株產(chǎn)生7種C15H24結(jié)構(gòu)的倍半萜烯類(lèi)物質(zhì)。相關(guān)研究表明，大多數(shù)倍半萜烯化合物具有芳香和重要的生物活性，是研究天然產(chǎn)物和開(kāi)發(fā)新藥物的重要來(lái)源，廣泛存在于生姜（）[30]、人參（）[31]、刺芹屬植物[32]及中藥假鷹爪（）果實(shí)[33]等植物體中，本研究報(bào)道了來(lái)源于微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的倍半萜烯類(lèi)化合物，為挖掘和開(kāi)發(fā)具有藥用前景的倍半萜烯提供了新的微生物資源和途徑。

天然產(chǎn)物在開(kāi)發(fā)抗癌藥物中發(fā)揮著重要的作用，約80%的藥物來(lái)源于天然產(chǎn)物[34]。已有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道本試驗(yàn)中抑菌揮發(fā)物質(zhì)的一些組分具有重要的生物活性，相對(duì)含量為80.64%的-倍半萜水芹烯是一種重要的香料和藥理活性物質(zhì)，1984年首次發(fā)現(xiàn)于生長(zhǎng)于冰島的早花百里香的揮發(fā)油中[35]；還存在于姜、艾草（）[36]及美國(guó)冷杉（）葉片和嫩枝的揮發(fā)油中[37]。近期，Tyagi等[38]從姜黃粉的酒精浸提物中分離獲得的-倍半萜水芹烯具有抗惡性細(xì)胞擴(kuò)散的活性，能抑制人類(lèi)白血病細(xì)胞、骨髓瘤細(xì)胞和結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖；通過(guò)細(xì)胞內(nèi)酯酶活性、質(zhì)膜完整性和細(xì)胞相試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該物質(zhì)還可以高效地抑制癌細(xì)胞克隆形成和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。另外一個(gè)相對(duì)含量較高的組分()--金合歡烯是一種重要的警報(bào)信息素，大多數(shù)蚜蟲(chóng)都能產(chǎn)生和利用該種激素，它的揮發(fā)釋放參與蚜蟲(chóng)間的化學(xué)聚集，特別是能干擾蚜蟲(chóng)取食，可用于蚜蟲(chóng)的生物防治[39-40]。AR03菌株揮發(fā)物中的-姜烯也具有重要的藥理活性，據(jù)Bou等[41]研究發(fā)現(xiàn)，從林生腳骨脆葉（）粗提精油中分離的-姜烯純品對(duì)人宮頸癌HeLa、U-87、Siha和HL60細(xì)胞系具有細(xì)胞毒素活性，但其抑制中濃度（IC50）比粗提精油高。本研究鑒定的倍半萜烯各組分的藥理活性尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

生物揮發(fā)性物質(zhì)的釋放是動(dòng)態(tài)的過(guò)程，在細(xì)菌生長(zhǎng)的過(guò)程中，隨著時(shí)間的變化和培養(yǎng)基的消耗，揮發(fā)物質(zhì)的種類(lèi)和數(shù)量會(huì)發(fā)生變化[42-43]。本研究通過(guò)保留指數(shù)和以1-十五烯為內(nèi)參測(cè)定AR03菌株不同培養(yǎng)時(shí)間產(chǎn)生揮發(fā)物的相對(duì)含量，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，各組分種類(lèi)不變，但相對(duì)含量呈降低趨勢(shì)，原因主要包括以下兩個(gè)方面：其一可能是細(xì)菌生長(zhǎng)經(jīng)過(guò)對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期進(jìn)入衰亡期，繁殖越來(lái)越慢，代謝活動(dòng)減慢，代謝產(chǎn)物亦隨之減少；另一個(gè)可能原因是GC-MS分析揮發(fā)物除了倍半萜物質(zhì)外，還含有戊二烯（C5H8），由于戊二烯含有含多種同分異構(gòu)體（1,3-戊二烯、反式-1,3-戊二烯、1,4-戊二烯、反式-1,4-戊二烯等），這些異構(gòu)體的質(zhì)譜圖相似度極高，且在DB-5MS色譜柱中保留行為較差，出峰時(shí)間較早（在本文報(bào)道色譜條件下1.6 min出峰），無(wú)法準(zhǔn)確確證。因此筆者推測(cè)揮發(fā)物中的倍半萜烯類(lèi)物質(zhì)具有化學(xué)不穩(wěn)定性，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，可能降解為單體戊二烯，加上該物質(zhì)無(wú)生物活性，本試驗(yàn)未對(duì)其進(jìn)行分析。另外值得注意的是，先期的研究結(jié)果顯示，AR03發(fā)酵液對(duì)煙草赤星病菌分生孢子萌發(fā)有很強(qiáng)的抑制效果，經(jīng)一定濃度含菌發(fā)酵液處理的分生孢子幾乎不萌發(fā)，而本試驗(yàn)結(jié)果顯示，AR03產(chǎn)生揮發(fā)物對(duì)供試病原菌分生孢子萌發(fā)的抑制和致畸作用比發(fā)酵液的抑菌作用弱，因此，揮發(fā)物質(zhì)的抑菌活性可能只是AR03菌株抑菌作用的一部分；另外，揮發(fā)物對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響采用的凹玻片萌發(fā)法，因?yàn)榉稚咦臃稚⒂跓o(wú)菌水中，揮發(fā)物無(wú)法直接作用于分生孢子從而不能充分發(fā)揮其抑菌活性；AR03菌株分泌的揮發(fā)物在密封的培養(yǎng)皿空間內(nèi)分散后濃度低可能也是影響其抑菌活性的重要因素。

4 結(jié)論

經(jīng)室內(nèi)培養(yǎng)皿對(duì)扣熏蒸法、凹玻片萌發(fā)法和離體葉片抗病測(cè)定，基本確定短小芽孢桿菌AR03菌株分泌的揮發(fā)性有機(jī)物對(duì)煙草黑脛病菌和赤星病菌菌絲生長(zhǎng)具有抑制和致畸作用，抑制黑脛病菌產(chǎn)生孢子囊并延遲游動(dòng)孢子的萌發(fā)；抑制赤星病菌分生孢子的萌發(fā)并引致孢子畸形；同時(shí)抑制黑脛病菌和赤星病菌病斑在葉片上的擴(kuò)展。SPME GC-MS分析表明，AR03能分泌二氫姜黃烯、()--金合歡烯、-姜黃烯、-姜烯、-紅沒(méi)藥烯、-倍半萜水芹烯和--紅沒(méi)藥烯7種C15H24結(jié)構(gòu)的倍半萜烯類(lèi)物質(zhì)，其中-倍半萜水芹烯相對(duì)含量最高，其次為()--金合歡烯和-姜烯。短小芽孢桿菌AR03菌株有潛力作為開(kāi)發(fā)抗真菌代謝物和新藥物的重要微生物資源。

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（責(zé)任編輯 岳梅）

Antimicrobial effect and components analysis of volatile organic compounds fromAR03

WANG Jing, CAO JianMin, CHEN DeXin, QIU Jun, WANG XiaoQiang, FENG Chao, WANG WenJing

(Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, Shandong)

【Objective】 The objective of this study is to determine the antimicrobial activity of volatile organic compounds (VOCs), produced from tobacco rhizosphere soilAR03 strain, and to analyze its main components.【Method】The antifungal effect of VOCs on the colony, mycelium growth and spore germination ofvar.andwas determined by a double Petri dish assay and cavity slide method. The control effect of VOCs on tobacco black shank and brown spot by leaf inoculation was determined. VOCs were collected by head-space solid phase microextraction (HS-SPME) and identified by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). Retention index (RI) and internal standard (IS) 1-pentadecence were used for qualitative and quantitative analysis.【Result】VOCs released fromAR03 strain had certain inhibitory effect on the two target pathogens, which showed that the mycelium ofgrew slowly and thinned, branches increased and twisted, and broke. The mycelium ofwas deformed and no conidial pedicle was produced on the mycelium. Most of the inclusions gathered together and caused the mycelium to dry and constricted. Growth of exposed fungus colonies was inhibited by VOCs, the inhibition rates of VOCs were 56.21% and 59.23%, 64.75% and 59.86%, 66.13% and 61.10%, 67.04% and 70.00%, respectively, againstandculturedin sealed plates for 2, 4, 6 and 8 dWhen the zoospores ofandascospores ofexposed to these volatile components for 6 h, the germination was delayed and the growth was slow. The number of sporocyst produced byobviously reduced. most conidiophores ofexpanded abnormally as cystic structure, indicating the fungicidal nature of the volatiles. Moreover, VOCs could significantly inhibit the disease severities of tobacco black shank and brown spot on leaves tests. Direct fumigation for 40 h and 80 h, black shank disease incidence was 92.50% on control and 70.83% on leaves treated by VOCs, the inhibitory of spot expansion was 62.35%. Brown spot disease incidence was 88.33% on control and 60.80% on leaves treated by VOCs, lesions expanded slowly and inhibitory rate was 65.75%. SPME GC-MS analysis showed that seven components of the volatiles were identified, all of which are sesquiterpenes with C15H24structure. They are dihydrocurcumene (CAS nO. 1461-02-5), ()--famesene (CAS nO. 18794-84-8),-curcumene (CAS nO. 451-55-8),-zingiberene (CAS nO. 495-60-3),-bisabolene (CAS nO. 495-61-4),-sesquiphellandrene (CAS nO. 20307-83-9) and--bisabolene (CAS nO. 53585-13-0). When AR03 was cultured for 1 d, the relative content of-sesquiphellandrene was the highest (80.64%), followed by ()--famesene and-zingiberene, the relative content was 7.20% and 6.67%, respectively. With the extension of culturing time, the species of each component were the same, but the relative content was different. Except for dihydrocurcumene, the content of other components showed a decreasing trend, when cultured for 6 d, other ingredients decreased more than 50%, besides dihydrocurcumene keeping relatively stable. 【Conclusion】VOCs produced byAR03 could develop an additive antifungal effect against fungal pathogens on tobacco.AR03 has potential as an important microbial resource for developing antifungal metabolites and new drugs.

AR03; volatile organic compounds;var.;; SPME GC-MS

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.10.0010

2017-11-03；

2017-12-18

中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)（1610232016012）、中國(guó)煙草總公司四川省公司重點(diǎn)科技項(xiàng)目（SCYC201604）、山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系煙草產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（SDAIT-2）

王靜，E-mail：wangjing06@caas.cn。曹建敏，E-mail：caojianmin@caas.cn。王靜和曹建敏為同等貢獻(xiàn)作者。通信作者王靜