富硒黃白側(cè)耳子實(shí)體蛋白質(zhì)和多糖的研究*

王 華，劉 虹，劉 欣，南曉潔

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，山西 太原 030006）

硒對(duì)人體有很多有益的功效，如提高免疫系統(tǒng)活性、降低患癌風(fēng)險(xiǎn)和化療副作用，以及降低癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移活性等[1-3]，可以通過(guò)攝入適量的硒來(lái)強(qiáng)化人體內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)，以達(dá)到輔助治療某些疾病的目的[4]。硒一般以無(wú)機(jī)硒和有機(jī)硒2種形式存在，其中以有機(jī)硒復(fù)合物和硒-氨基酸的生物活性最高[5]。與直接攝入無(wú)機(jī)硒相比，從天然食品中獲取有機(jī)硒對(duì)人體更健康[6]。雖然我們可以從食物中獲得硒，如堅(jiān)果、雞蛋、魚、肝和雞肉等，但是，在天然食物中硒的含量很低，因此尋找富含硒的膳食來(lái)源很重要。眾所周知，食用菌具有較強(qiáng)的富集礦物元素的能力，富硒食用菌蛋白可以顯著提高食用菌的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[7-8]。側(cè)耳屬（Pleurotus spp.）食用菌基于其較高的食用價(jià)值和藥用價(jià)值，以及在生物技術(shù)應(yīng)用和環(huán)境應(yīng)用等方面的優(yōu)勢(shì)，在全球廣泛栽培，其栽培規(guī)模僅次于雙孢蘑菇（Agaricus bisporus），位居第二[9]。黃白側(cè)耳（Pleurotus geesteranus），又名秀珍菇，由于其較好的口感，含有高膳食纖維和高品質(zhì)的蛋白而備受人們喜愛[10-11]。大多數(shù)富硒栽培食用菌的研究都是采用無(wú)機(jī)硒作為硒源，以有機(jī)硒作為硒源來(lái)栽培獲得富硒食用菌的研究較少。

本試驗(yàn)旨在以有機(jī)硒—硒代蛋氨酸（Se-Met）為硒源，采用傳統(tǒng)栽培方式獲得富硒黃白側(cè)耳子實(shí)體，分析評(píng)價(jià)培養(yǎng)料中不同硒濃度對(duì)子實(shí)體產(chǎn)量、硒含量、可溶性蛋白含量和粗多糖含量的影響，并對(duì)其可溶性蛋白和多糖中的硒含量進(jìn)行測(cè)定與分析，以探究富硒黃白側(cè)耳中硒的存在形式。

1 材料與方法

1.1 菌種

黃白側(cè)耳（Pleurotus geesteranus）由本實(shí)驗(yàn)室提供，保存在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）斜面上。

1.2 材料

硒代蛋氨酸（Se-Met）由山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院提供；棉籽殼和麥麩購(gòu)自太原市小店區(qū)。

1.3 黃白側(cè)耳的栽培

基礎(chǔ)培養(yǎng)料配方：棉籽殼93%、麥麩5%、蔗糖1%、石膏1%。

含硒培養(yǎng)料配方：在基礎(chǔ)培養(yǎng)料中添加Se-Met，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別達(dá)到0.4 g·kg-1、0.6 g·kg-1和0.8 g·kg-1。

將以上培養(yǎng)料分別配料、拌料并裝瓶（500 mL罐頭瓶裝濕料300 g），然后滅菌、接種，進(jìn)行發(fā)菌期和出菇期管理。記錄子實(shí)體的產(chǎn)量（鮮重，g·瓶-1）并計(jì)算不同培養(yǎng)料的生物學(xué)效率。生物學(xué)效率（%）為總子實(shí)體鮮重除以培養(yǎng)料干重乘以100%。在含硒培養(yǎng)料和基礎(chǔ)培養(yǎng)料上所得到的黃白側(cè)耳子實(shí)體分別編號(hào)為樣品A、樣品B、樣品C和對(duì)照。

1.4 富硒黃白側(cè)耳中硒含量的測(cè)定

參照文獻(xiàn) [12]，根據(jù)吸光度值和硒的濃度繪制硒標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的方程為：y=0.434x+0.004（R2=0.99）。在 2 g待測(cè)樣品中加入 30 mL H2SO4和HNO3（1∶4）混合酸，進(jìn)行充分溶解至溶液澄清，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法，測(cè)定并計(jì)算待測(cè)樣品中的硒含量。在本試驗(yàn)中所用到的玻璃器皿均在10%HNO3溶液中浸泡24 h。

1.5 富硒黃白側(cè)耳中可溶性蛋白含量的測(cè)定

富硒黃白側(cè)耳中可溶性蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合法[13]。首先采用牛血清蛋白稀釋液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=4.381x－0.007（R2=0.99）。準(zhǔn)確稱取2.0 g用石油醚脫脂后的子實(shí)體樣品，加入30 mL雙蒸水提取，重復(fù)3次。最后將提取液定容至100 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法，測(cè)定并計(jì)算待測(cè)樣品中可溶性蛋白的含量。

1.6 富硒黃白側(cè)耳中粗多糖含量的測(cè)定

富硒黃白側(cè)耳中粗多糖的提取參照文獻(xiàn)[14]，準(zhǔn)確稱取2.0 g干燥且粉碎的待測(cè)樣品，采用NaOH溶液（1 mol·L-1）進(jìn)行提取，并用95%乙醇進(jìn)行醇沉，最后將沉淀用蒸餾水溶解并定容?？扇苄源侄嗵呛康臏y(cè)定采用苯酚-硫酸法[15]。

1.7 可溶性蛋白中硒含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取5 g脫脂后的樣品，依次用雙蒸水、NaCl溶液（0.5 mol·L-1）、Na2HPO3-KH2PO3緩沖液（0.067 mol·L-1，pH 6.0）和 Na2HPO3-KH2PO3緩沖液（0.067 mol·L-1，pH 8.5）各提取3次，在所得提取液中分別加入NH4SO4至飽和，置于4℃冰箱中24 h，離心獲得沉淀，將沉淀分別在BaCl2溶液中透析至無(wú)沉淀產(chǎn)生，然后將所獲得的蛋白質(zhì)再分別溶于上述雙蒸水、NaCl溶液（0.5 mol·L-1）、Na2HPO3-KH2PO3緩 沖 液 （0.067 mol·L-1， pH 6.0）和Na2HPO3-KH2PO3緩沖液 （0.067 mol·L-1，pH 8.5）中，分別得到水溶性、鹽溶性、弱酸溶性和弱堿溶性的蛋白質(zhì)溶液[16]。4種蛋白質(zhì)中的硒含量按照1.4中的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.8 可溶性多糖中硒含量的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取5 g脫脂后的樣品，依次用雙蒸水、NaOH溶液（0.1 mol·L-1）和HCl溶液（0.1 mol·L-1）在沸水浴中提取2 h，分別得到水溶性、堿溶性和酸溶性粗多糖溶液，分別用Sevag法除蛋白，并用95%的乙醇進(jìn)行醇沉，最后將沉淀分別使用雙蒸水、NaOH溶液（0.1 mol·L-1）和HCl溶液（0.1 mol·L-1）溶解并定容，即為水溶性、堿溶性和酸溶性多糖溶液[16]。3種多糖中的硒含量按照1.4中的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以上試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，顯著性差異采用Duncan多重比較法進(jìn)行比較[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 Se-Met對(duì)富硒黃白側(cè)耳產(chǎn)量、生物學(xué)效率、硒含量、可溶性蛋白和粗多糖含量的影響

Se-Met對(duì)富硒黃白側(cè)耳產(chǎn)量、生物學(xué)效率、硒含量、可溶性蛋白和粗多糖含量的影響結(jié)果見表1。

表1 Se-Met添加量對(duì)黃白側(cè)耳產(chǎn)量、生物學(xué)效率、硒含量、可溶性蛋白和粗多糖含量的影響Tab.1 Effects of Se-Met amount on yield,biology efficiency,Se content,soluble protein and polysaccharide contents of Pleurotus geesteranus fruiting bodies

從表1可以看出，當(dāng)培養(yǎng)料中Se-Met的濃度為0.4 g·kg-1時(shí)，黃白側(cè)耳的產(chǎn)量和生物學(xué)效率最高，分別為45.6 g·瓶-1和36.46%，但與對(duì)照組相比，并無(wú)顯著差異（P<0.05）。當(dāng)培養(yǎng)料中Se-Met的添加量為0.6 g·kg-1和0.8 g·kg-1時(shí)，黃白側(cè)耳的產(chǎn)量和生物學(xué)效率均顯著降低，且明顯低于對(duì)照組，表明高添加量的硒抑制了黃白側(cè)耳子實(shí)體的生長(zhǎng)。表1結(jié)果還顯示，黃白側(cè)耳子實(shí)體中硒的含量，隨培養(yǎng)料中Se-Met添加量的提高而提高，相關(guān)性分析結(jié)果表明，子實(shí)體中的硒含量與培養(yǎng)料中Se-Met的添加量呈顯著正相關(guān)性（R2=0.98，P<0.01），當(dāng)培養(yǎng)料中Se-Met的添加量為0.88 g·kg-1時(shí)，子實(shí)體中的硒含量最高，達(dá)到11.43 μg·g-1。此外，表1結(jié)果還表明，當(dāng)培養(yǎng)料中硒的添加量為0.4 g·kg-1時(shí)，黃白側(cè)耳的可溶性蛋白含量顯著高于其他組，達(dá)到45.82%。當(dāng)培養(yǎng)料中硒的添加量超過(guò)0.4 g·kg-1后，黃白側(cè)耳子實(shí)體中的可溶性蛋白含量，隨培養(yǎng)料中Se-Met添加量的提高而逐漸降低。而黃白側(cè)耳子實(shí)體中的粗多糖含量則是隨培養(yǎng)料中Se-Met添加量的提高而逐漸提高，相關(guān)性分析結(jié)果表明，子實(shí)體中的粗多糖含量與培養(yǎng)料中Se-Met添加量有顯著正相關(guān)性（R2=0.99，P<0.01）。當(dāng)培養(yǎng)料中硒的添加量為0.8 g·kg-1時(shí)，黃白側(cè)耳的粗多糖含量最高，達(dá)到9.26%。

2.2 富硒黃白側(cè)耳中可溶性蛋白中的硒含量

分別對(duì)富硒黃白側(cè)耳子實(shí)體中的水溶性蛋白、鹽溶性蛋白、弱酸溶性蛋白和弱堿溶性蛋白進(jìn)行了分離，并對(duì)其中的硒含量進(jìn)行了測(cè)定與比較，結(jié)果見圖1和表2。

圖1 富硒黃白側(cè)耳子實(shí)體可溶性蛋白中的硒含量Fig.1 Selenium content in soluble protein of selenium-enriched Pleurotus geesteranus fruiting bodies

由圖1和表2可以看出，在樣品A、樣品B和樣品C中，蛋白質(zhì)中的硒含量排序?yàn)椋核苄缘鞍?弱堿溶性蛋白>鹽溶性蛋白>弱酸溶性蛋白，且四者之間存在顯著差異（P＜0.05）。此外，對(duì)所分離到的蛋白質(zhì)中的硒含量占總硒含量的比例進(jìn)行了計(jì)算與分析，結(jié)果如表2所顯示，富硒黃白側(cè)耳子實(shí)體中的硒主要存在于水溶性蛋白中，樣品A、樣品B和樣品C的水溶性蛋白中的硒含量分別占總硒含量的27.22%、28.94%和27.96%，3個(gè)樣品可溶性蛋白（包括水溶性蛋白、鹽溶性蛋白、弱酸溶性蛋白和弱堿溶性蛋白）中的硒含量分別占總硒含量的53.02%、57.39%和54.30%，這說(shuō)明富硒黃白側(cè)耳中的硒主要以硒蛋白的形式存在。

表2 富硒黃白側(cè)耳子實(shí)體可溶性蛋白中的硒占總硒含量的比例Tab.2 Proportion of selenium content in soluble protein of selenium-enriched Pleurotus geesteranus fruiting bodies accounts for the total selenium content

2.3 富硒黃白側(cè)耳多糖中的硒含量

分別對(duì)富硒黃白側(cè)耳子實(shí)體中的水溶性多糖、酸溶性多糖和堿溶性多糖進(jìn)行了分離，并對(duì)其中的硒含量進(jìn)行了測(cè)定與比較，結(jié)果見圖2和表3。

圖2 富硒黃白側(cè)耳多糖中的硒含量Fig.2 Selenium content in polysaccharide of selenium-enriched Pleurotus geesteranus

由圖2和表3可以看出，在樣品A、樣品B和樣品C中，多糖中的硒含量排序?yàn)椋核苄远嗵?酸溶性多糖>堿溶性多糖，且三者之間存在顯著差異（P＜0.05）。此外，對(duì)所分離到的多糖中的硒含量占總硒含量的比例進(jìn)行了計(jì)算與分析，表3結(jié)果表明，在富硒黃白側(cè)耳子實(shí)體中，硒主要存在于水溶性多糖中，樣品A、樣品B和樣品C的水溶性多糖中的硒含量分別占總硒含量的10.63%、11.06%和11.42%，3種多糖（包括水溶性多糖、酸溶性多糖和堿溶性多糖）中的硒含量分別占總硒含量的23.26%、23.96%和24.98%。

表3 富硒黃白側(cè)耳子實(shí)體多糖中的硒占總硒含量的比例Tab.3 Proportion of selenium content in polysaccharide of selenium-enriched Pleurotus geesteranus fruiting bodies accounts for the total selenium content

3 討論

關(guān)于富硒栽培食用菌已被廣泛報(bào)道，在已有的文獻(xiàn)報(bào)道中大多是以無(wú)機(jī)硒作為硒源來(lái)獲得富硒食用菌[18-19]。Silva等[19]的研究結(jié)果表明，在栽培平菇（Pleurotus ostreatus）的培養(yǎng)料中添加亞硒酸鈉時(shí)，平菇可以富集培養(yǎng)料中的硒，而且子實(shí)體中的硒含量與培養(yǎng)料中亞硒酸鈉的添加量呈正比。這一結(jié)果與本試驗(yàn)所取得的結(jié)果是一致的：黃白側(cè)耳中的硒含量與培養(yǎng)料中Se-Met的添加量呈顯著正相關(guān)性。在本試驗(yàn)中，當(dāng)培養(yǎng)料中Se-Met添加量為0.8 g·kg-1時(shí)，黃白側(cè)耳子實(shí)體中硒含量可達(dá)到11.43 μg·g-1，這表明Se-Met適宜作為富硒栽培黃白側(cè)耳硒源。關(guān)于培養(yǎng)料中Se-Met添加量對(duì)富硒黃白側(cè)耳子實(shí)體產(chǎn)量和生物學(xué)效率的影響，本試驗(yàn)只是做了初步探究，在后續(xù)工作中有必要對(duì)Se-Met的添加量進(jìn)行細(xì)化分析，以便更系統(tǒng)地反映Se-Met對(duì)富硒黃白側(cè)耳生長(zhǎng)的影響。

很多研究都表明，硒在富硒食用菌子實(shí)體中大多與蛋白質(zhì)或者多糖結(jié)合在一起，而且在培養(yǎng)料中添加硒會(huì)影響富硒食用菌中蛋白質(zhì)和多糖等有機(jī)物的合成[20]。Zhao等[6]的結(jié)果表明，在培養(yǎng)基質(zhì)中添加低濃度的亞硒酸鈉會(huì)促進(jìn)靈芝（Ganoderma spp.）總蛋白質(zhì)和氨基酸的合成，但是高濃度的硒卻有相反的作用。在本試驗(yàn)所選的硒添加量范圍內(nèi)，培養(yǎng)料中低添加量的Se-Met有利于富硒黃白側(cè)耳中水溶性蛋白質(zhì)含量的提高，隨著培養(yǎng)料中Se-Met添加量的提高，富硒黃白側(cè)耳中的水溶性蛋白質(zhì)含量反而呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。這說(shuō)明一定添加量的Se-Met可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，這與Zhao等的結(jié)果是一致的。富硒黃白側(cè)耳中的硒含量與多糖含量呈顯著正相關(guān)性，這說(shuō)明一定添加量的硒也可以促進(jìn)多糖的合成。同樣，進(jìn)一步細(xì)化Se-Met的添加量，以更系統(tǒng)地反映Se-Met對(duì)富硒黃白側(cè)耳子實(shí)體中各營(yíng)養(yǎng)成分的影響及其富集形式是很有必要的。此外，培養(yǎng)料中Se-Met對(duì)黃白側(cè)耳子實(shí)體中蛋白質(zhì)和多糖代謝的影響機(jī)理還有待于進(jìn)一步探究。

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