二甲雙胍對高葡萄糖環(huán)境下結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲的影響

劉付俊業(yè) 吳共發(fā) 邱麗湞 曾宇婷 黃綺亭

隨著生活水平及飲食方式的變化，2型糖尿病與結(jié)腸癌的發(fā)病率日益增加，且兩者有共同的危險因素，包括精碳水化合物而低纖維素飲食、中心性肥胖、高體質(zhì)指數(shù)、缺乏活動等。流行病學(xué)也發(fā)現(xiàn)2型糖尿病與包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的發(fā)病密切相關(guān)，促使人們越來越關(guān)注糖尿病與結(jié)腸癌的關(guān)系。二甲雙胍廣泛用于2型糖尿病的治療，除發(fā)揮降低血糖作用外，還能降低2型糖尿病人的結(jié)腸癌發(fā)生率和改善其預(yù)后［1-2］，但其機制還未完全明確。引起結(jié)腸癌患者死亡的主要因素是腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，上皮——間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal transition，EMT）已經(jīng)被廣泛證實參與了惡性腫瘤包括結(jié)腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究觀察二甲雙胍在高葡萄糖環(huán)境下對人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480增殖和侵襲的影響，并觀察其對EMT標(biāo)志物的影響，初步探討二甲雙胍影響結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制。

材料與方法

一、一般材料

SW480細(xì)胞購自中科院上海生命科學(xué)研究院。鹽酸二甲雙胍、二甲基亞砜（DMSO）和Matrigel膠均購自美國Sigma公司，E-cadehrin、Vimentin和β-actin抗體購于美國Santa Cruz公司，辣根酶標(biāo)記抗兔IgG購自北京中杉金橋公司，Transwell小室購自美國Corning公司，標(biāo)準(zhǔn)蛋白、ECL反應(yīng)檢測試劑盒、全蛋白提取試劑盒、蛋白濃度檢測試劑盒和Cell Counting Kit-8（CCK-8）試劑盒均購自上海碧云天公司，胎牛血清、DMEM無糖培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，D-無水葡萄糖購自廣州達(dá)爾斯科公司，胰酶購自南京凱基公司。

二、CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM無糖培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。對照組葡萄糖濃度為0 mmol/L，高糖組含葡萄糖終濃度為20 mmol/L，在高糖基礎(chǔ)上分別加終濃度為1 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L的二甲雙胍干預(yù)處理為高糖干預(yù)組一，高糖干預(yù)組二，高糖干預(yù)組三，高糖干預(yù)組四，高糖干預(yù)組五。

取對數(shù)生長期的SW480細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，細(xì)胞5 000個/孔接種至96孔板，培養(yǎng)液終體積100 μl/孔，細(xì)胞貼壁按照上述分組進行處理，同時與實驗孔平行設(shè)置不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對照孔，培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 后每孔加10 μl CCK-8，置于培養(yǎng)箱中避光孵育2 h，放在酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm 處測定各組細(xì)胞孔的吸光度（absorbance，A）值。每組設(shè)置3個復(fù)孔計算平均值。各實驗孔吸光度平均值減去平行空白對照孔的吸光度平均值后，按照以下公式計算細(xì)胞的細(xì)胞增殖抑制率，取細(xì)胞增殖抑制率為50%的二甲雙胍濃度進行后續(xù)實驗。抑制率（%）=（1-A實驗組/A對照組）×100%

三、Transwell侵襲實驗

Transwell小室的下室加入500 μl培養(yǎng)液，加100 μl SW480細(xì)胞懸液于Transwell小室的上室加100 μl SW480細(xì)胞懸液。對照組及高糖組設(shè)置同上，以增殖抑制率為50%的二甲雙胍濃度處理高糖培養(yǎng)的細(xì)胞（高糖＋二甲雙胍組）及無高糖培養(yǎng)的細(xì)胞（二甲雙胍組）48h后，取出Transwell小室，用95%乙醇固定濾膜，蘇木素染色。棉簽拭去濾膜上室面的細(xì)胞，鏡下計數(shù)穿過Matrigel膠細(xì)胞數(shù)。每組設(shè)3復(fù)孔，每組分別設(shè)定無Matrigel 膠的孔作為空白對照，計算癌細(xì)胞體外侵襲指數(shù)，計算方法如下：癌細(xì)胞體外侵襲指數(shù)（%）=該組穿過Matrigel膠的細(xì)胞數(shù)/該組空白對照穿膜細(xì)胞數(shù)×100%。

四、Western blot

各組細(xì)胞處理48 h后離心收集，提取細(xì)胞蛋白并測定蛋白含量，每泳道40 μg蛋白等質(zhì)量上樣，經(jīng)過10%聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳分離后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，印跡膜在含5%脫脂奶粉的PBST緩沖液內(nèi)室溫封閉1 h，加入一抗（E-cadheirn和Vimentin的稀釋度均為1：1 000）4 ℃孵育過夜，洗膜后加人1：5 000稀釋的辣根酶標(biāo)記抗兔IgG，室溫震蕩孵育1 h，PBST洗膜采用ECL化學(xué)發(fā)光法進行檢測，以β-actin為內(nèi)對照。

五、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，兩組間數(shù)據(jù)比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組數(shù)據(jù)采用方差齊性檢驗和單向方差分析，多重比較采用LSD法分析，方差不齊采用Dunnett′s T3法，雙側(cè)檢驗P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、高糖環(huán)境對SW480細(xì)胞增殖的影響

CCK-8法檢測結(jié)果顯示，高糖組SW480細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h后，各時間段的A值均明顯高于對照組細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（分別t=-20.718，P＜ 0.001；t=-33.439，P＜ 0.001；t=-67.018，P＜0.001；圖1），說明高糖在不同時間段均能促進SW480細(xì)胞增殖。

圖1 高糖組與對照組不同時間點的細(xì)胞增殖情況

二、不同濃度二甲雙胍對高糖環(huán)境下SW480細(xì)胞的抑制作用

在高糖環(huán)境下，加入1 mmol/L、5 mmol/L、10 mmol/L、20 mmol/L、40 mmol/L濃度的二甲雙胍干預(yù)處理后，CCK-8結(jié)果顯示，除了1 mmol/L濃度在24 h對細(xì)胞增殖無影響外，其余不同濃度的二甲雙胍在各個時間點均對SW480細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，A值明顯減低，呈時間——劑量依賴性（F=826.820，均P＜0.001，圖2）。計算顯示當(dāng)20 mmol/L作用48 h其抑制率為50%，故以下實驗設(shè)置該濃度及時間點。

圖2 不同濃度二甲雙胍對高糖環(huán)境下SW480細(xì)胞的增殖影響

三、二甲雙胍對高糖環(huán)境下SW480細(xì)胞侵襲影響

單向方差分析顯示各組間的細(xì)胞侵襲指數(shù)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（F=49.403，P＜0.001），進一步多重比較分析顯示高糖＋二甲雙胍組細(xì)胞侵襲指數(shù)為（40.18±2.22）%，顯著低于高糖組的（66.16±5.52）%（P＜0.001），二甲雙胍組的侵襲指數(shù)為（34.94±2.13）%，顯著低于對照組（52.21±2.63）%（P＜0.001），高糖＋二甲雙胍組與二甲雙胍組的侵襲指數(shù)差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.098）。

四、二甲雙胍對高糖環(huán)境下SW480細(xì)胞EMT標(biāo)記物表達(dá)的影響

Western bolt結(jié)果顯示，與對照組比較，高糖環(huán)境能增加EMT標(biāo)記物表達(dá)，表現(xiàn)為E-cadherin蛋白表達(dá)降低，Vimentin蛋白表達(dá)增強；與對照組及高糖組比較，二甲雙胍在有或無高糖環(huán)境下均能抑制SW480細(xì)胞EMT標(biāo)記物表達(dá)，表現(xiàn)為E-cadherin蛋白表達(dá)增強，Vimentin蛋白表達(dá)減低（圖3）。

圖3 二甲雙胍對高糖環(huán)境下結(jié)腸癌細(xì)胞EMT標(biāo)記物的表達(dá)影響

討 論

2型糖尿病和癌癥是全世界范圍內(nèi)引起人類死亡的最常見疾病。2型糖尿病本身不僅是嚴(yán)重威脅人類健康的慢性消耗性炎性反應(yīng)疾病，而且還能夠增加癌癥疾病發(fā)生的風(fēng)險，其中包括結(jié)腸癌［3］。作為治療2型糖尿病的一線用藥，二甲雙胍證實除了能發(fā)揮降血糖的作用外，流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)其還能降低糖尿病患者的結(jié)腸癌發(fā)生的風(fēng)險以及改善患者預(yù)后［1，4］。目前，二甲雙胍抗腫瘤作用的機制尚不完全清楚，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為與其降低血糖的間接作用機制相關(guān)。因此，本實驗旨在觀察二甲雙胍在高葡萄糖環(huán)境下對人結(jié)腸癌細(xì)胞系SW480增殖和侵襲的影響，初步探討其可能的機制。

本實驗結(jié)果顯示，高糖環(huán)境可以刺激結(jié)腸癌細(xì)胞生長，在加入二甲雙胍處理后，細(xì)胞增殖活性受到抑制，而且，無糖環(huán)境下的結(jié)腸癌細(xì)胞增殖活性同樣受到抑制。這提示二甲雙胍抑制腫瘤的生長可能不單純通過降低血糖的間接作用所致，其本身可能存在直接的抗腫瘤活性。Zakikhini等［5］早先通過體外實驗發(fā)現(xiàn)二甲雙胍通過激活A(yù)MPK抑制結(jié)腸癌細(xì)胞株HT29的生長。而后Tomimoto等［6］動物實驗證實了二甲雙胍抑制小鼠腸息肉的生長并非由于二甲雙胍的間接作用。國內(nèi)朱等［7］報道二甲雙胍能抑制無高糖培養(yǎng)的SW480細(xì)胞的增殖，我們結(jié)果與之相符合。但有報道稱在普通培養(yǎng)基培養(yǎng)的SW480細(xì)胞中單獨加入二甲雙胍不能抑制細(xì)胞增殖［8］。在其他腫瘤，目前許多體外實驗結(jié)果顯示二甲雙胍能對多種腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖的作用［9-10］。

本實驗結(jié)果還顯示，高糖環(huán)境能刺激增強結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲能力，增加EMT標(biāo)記物表達(dá)，表現(xiàn)為E-cadherin蛋白表達(dá)降低，Vimentin蛋白表達(dá)增強，而二甲雙胍不但能抑制高糖環(huán)境結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲能力，而且對無糖環(huán)境的對照組結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲能力同樣具有抑制作用，并均能抑制有或無高糖環(huán)境下的結(jié)腸癌細(xì)胞EMT標(biāo)記物的表達(dá)。結(jié)腸癌患者的主要死亡因素是腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。EMT是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的基本過程，是非侵襲性腫瘤向高侵襲性腫瘤轉(zhuǎn)換所必需的，腫瘤發(fā)生EMT后，上皮標(biāo)志物如E-cadherin表達(dá)下降，間質(zhì)標(biāo)志物如Vimentin表達(dá)升高［11］。二甲雙胍在多種惡性腫瘤如胃癌［12］、肺腺癌［13］等均能抑制EMT。國內(nèi)研究報道二甲雙胍能抑制晚期糖基化終產(chǎn)物誘導(dǎo)的大腸癌EMT［8］。本實驗首次發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能抑制高糖或無糖環(huán)境下的結(jié)腸癌細(xì)胞EMT，可能是二甲雙胍抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖和侵襲的重要機制。

綜上所述，高葡萄糖環(huán)境能促進結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、侵襲和具有更強的EMT作用，二甲雙胍能明顯抑制有或無高葡萄糖環(huán)境下結(jié)腸癌的增殖、侵襲能力以及EMT。雖然二甲雙胍對高糖環(huán)境下結(jié)腸癌細(xì)胞具有更強的抑制增殖、侵襲和EMT的作用，但對于無糖環(huán)境下的結(jié)腸癌細(xì)胞同樣具有抑制增殖、侵襲和EMT的作用，我們推測二甲雙胍的抗腫瘤特性不僅通過降血糖的間接作用所致，可能二甲雙胍還具有直接的抗腫瘤特性，深入闡明二甲雙胍的抗腫瘤機制，對應(yīng)用二甲雙胍治療糖尿病相關(guān)惡性腫瘤具有重要意義。

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