PLAGL2與結(jié)腸癌侵襲能力的相關(guān)性研究

丁秀杰 王永鵬 馬思平 張睿 王燕 張慶彤 張昊 李鵬雷 林濤 李巖溪 陳玉澤 劉放

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，目前其死亡率在所有惡性腫瘤中已經(jīng)上升到第2位［1］。2015年美國(guó)全年新發(fā)結(jié)直腸癌病例約132 700例，同年死亡病例約49 700例［2］。結(jié)直腸癌的發(fā)展過程中，約有50%的患者最終出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移，20～30%患者出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者致死的主要因素［3］。結(jié)直腸癌發(fā)生與發(fā)展是一個(gè)多基因參與、多因素相互作用、經(jīng)過多個(gè)階段最終形成的、極其復(fù)雜的生物學(xué)現(xiàn)象［4-5］。上皮——間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelialmesenchymal transition，EMT）目前被認(rèn)為是腫瘤侵襲的主要機(jī)制而被廣泛研究。它是一種潛在的類似胚胎發(fā)育的過程，包括上皮標(biāo)志丟失，同時(shí)伴隨著許多間質(zhì)性標(biāo)志表達(dá)增加，如神經(jīng)鈣粘附素、波形蛋白等。其在腫瘤進(jìn)展過程中可以異常再激活，為細(xì)胞提供侵襲性和運(yùn)動(dòng)性的能力，通常被視為轉(zhuǎn)移傳播的一個(gè)主要的驅(qū)動(dòng)力［6］。良好的腫瘤標(biāo)志物監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞播散轉(zhuǎn)移對(duì)我們了解病人病理事件的發(fā)生順序顯得尤為重要。

多形性腺瘤基因樣因子2（pleomorphic adenoma gene-like 2，PLAGL2）是一類來源于PLAG基因家族的鋅指蛋白，其分子結(jié)構(gòu)式的N端含7個(gè)C2H2鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域。目前已證實(shí)，人和鼠PLAGL2基因的DNA序列有92%同源性，人類PLAGL2基因在胎兒期表達(dá)豐富，小鼠肺，脾和睪丸組織中的表達(dá)水平最高［7］。臨床上PLAGL2與惡性腫瘤的關(guān)系首先在急性髓性白血病和肺癌中被人研究，從其與肺良性疾病的研究中延伸而來，逐漸引起人的重視。本文擬從組織學(xué)水平以及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探討PLAGL2蛋白表達(dá)與結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展及侵襲的關(guān)系及機(jī)制。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選取2015年10月15日至2015年12月10日期間遼寧省腫瘤醫(yī)院結(jié)直腸外科收治的結(jié)腸癌患者40例，納入研究對(duì)象如下：（1）初診為結(jié)腸癌患者，未經(jīng)過術(shù)前放化療或者其他生物免疫治療；（2）無合并其他惡性腫瘤；（3）入組患者年齡：51～87歲；（4）根據(jù)醫(yī)學(xué)倫理學(xué)原則，研究前應(yīng)對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行告知，確保所有研究對(duì)象充分了解相關(guān)信息，并簽署知情同意書。

二、免疫組化

從福爾馬林固定的組織中切取4～6 μm厚切片，進(jìn)行石蠟包埋，然后在二甲苯和一系列濃度的乙醇中進(jìn)行脫蠟。組織切片在0.3%過氧化氫溶液內(nèi)孵育12 min，以阻止內(nèi)源性過氧化物酶活性。切片在蒸汽壓力鍋里煮沸的檸檬酸緩沖液（pH值6）中孵育以提取抗原。然后樣本與山羊血清在室溫孵育30 min。阻斷特異性抗體后，樣本與抗PLAGL2多克隆抗體（Abcam公司，美國(guó)）在1：200稀釋濃度下在4 ℃培養(yǎng)過夜。然后滴加適量生物素標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育20 min。PBS沖洗3 次，每次5 min。最后滴加適量的HRP標(biāo)記鏈霉親和素，37 ℃孵育30 min。PBS 沖洗3次，每次5 min。顯色劑顯色10 min。自來水沖洗，蘇木素復(fù)染色，脫水，透明，封片。觀察PLAGL2蛋白的表達(dá)情況。

三、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

（一）pcDNA3.1-PLAGL2質(zhì)粒構(gòu)建

（1）基因擴(kuò)增：建立PCR反應(yīng)體系，進(jìn)行目的基因片段PCR擴(kuò)增，電泳檢測(cè)擴(kuò)增情況。利用多功能DNA純化回收試劑盒提取純化的目的基因片段；（2）TA克隆：將得到的目的基因與pUM-T simple vector連接，經(jīng)過系列反應(yīng)以后，形成單菌落。挑選白色菌落，PCR鑒定插入片段長(zhǎng)度，選取陽(yáng)性克隆，標(biāo)記為T-PLAGL2，測(cè)序；（3）質(zhì)粒提取：利用質(zhì)粒大量制備試劑盒提取目的質(zhì)粒（T-PLAGL2，pcDNA3.1）；（4）基因重組：根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的酶切位點(diǎn)對(duì)T-PLAGL2，pcDNA3.1質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，回收酶切片段，將得到的目的基因與pcDNA3.1連接。挑選菌落，PCR鑒定插入片段長(zhǎng)度，選取陽(yáng)性克隆，標(biāo)記為pcDNA3.1-PLAGL2，測(cè)序。

（二）細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染及篩選

SW480細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)于含10%胎牛血清、青霉素100 u/mL、鏈霉素100 ug/mL的IMDM培養(yǎng)液中，在37 ℃、5%CO2及飽和濕度的恒溫密閉培養(yǎng)箱內(nèi)傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)SW480細(xì)胞至密度為90%左右，在6孔板中利用轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染PLAGL2質(zhì)粒及空載體Vector質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染24 h后，6孔板內(nèi)每孔加入含有200 μg/mL G418的DMEM完全培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。篩選后的細(xì)胞株經(jīng)傳代后，與未轉(zhuǎn)染的SW480細(xì)胞分三組：SW480、Vector和 PLAGL2，應(yīng)用 Western-blot方法在蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)，檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染效率及穩(wěn)定性。

（三）Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)

首先將Matrigel膠包被到小室膜上，建立Transwell小室模型。將SW480、Vector、PLAGL2各組細(xì)胞培養(yǎng)至密度為90%左右，胰酶消化后制成細(xì)胞懸浮溶液放入上室，下室放入含20%FBS培養(yǎng)液。培養(yǎng)24小時(shí)固定染色，顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)。

（四）Western-blot

分SW480、Vector和PLAGL2三組細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每組至少5個(gè)單獨(dú)樣本檢測(cè)。先對(duì)檢驗(yàn)的樣本進(jìn)行總蛋白抽提，蛋白質(zhì)定量。然后按實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)印至PVDF膜，然后封閉。選擇相關(guān)目的基因抗體孵育一抗，用羊抗兔IgG-HRP進(jìn)行二抗孵育，待ECL底物發(fā)光，圖像保存。內(nèi)參用β-actin，實(shí)驗(yàn)步驟一致。條帶的光密度通過Gel-Pro分析儀（Media Cybernetics公司，美國(guó)）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以目的蛋白與β-actin光密度的比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本文所有數(shù)據(jù)資料均使用SPSS for Windows 20.0軟件處理。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，計(jì)量資料采用兩樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析（One-Way ANOVA）比較組間均數(shù)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)、χ2連續(xù)校正或者Fisher確切概率法進(jìn)行分類資料分析，以雙側(cè)檢驗(yàn)P＜0. 05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、PLAGL2在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況

免疫組化染色結(jié)果需要兩位病理科醫(yī)生通過半定量方法進(jìn)行評(píng)估。細(xì)胞陽(yáng)性染色強(qiáng)度評(píng)分：分為無色0，淡黃色1、棕黃色2和暗褐色3；每高倍視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，判斷陽(yáng)性細(xì)胞比例：分為無陽(yáng)性細(xì)胞0，陽(yáng)性細(xì)胞＜15%為1，15～50%為2，51～75%為3，＞75%為4。細(xì)胞陽(yáng)性染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞比例乘積為免疫反應(yīng)評(píng)分（immunoreactivity score，IS）：0為陰性、1～4為弱陽(yáng)性、5～8為中陽(yáng)性，9～12為強(qiáng)陽(yáng)性，陰性和弱陽(yáng)性定義為低表達(dá)，反之則為高表達(dá)（圖1）。

40例免疫組化標(biāo)本中，14例為Ⅰ～Ⅱ期結(jié)腸癌組織，26例為Ⅲ～Ⅳ期，同時(shí)配對(duì)40例癌旁組織。比較免疫反應(yīng)評(píng)分（IS值），PLAGL2蛋白在Ⅲ～Ⅳ期結(jié)腸癌組織中表達(dá)明顯高于Ⅰ～Ⅱ期結(jié)腸癌組織，更高于癌旁組織，分別為8.120±2.997、5.710±2.494、2.170±0.984。三組之間比較以及兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表1）。

二、PLAGL2的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

按照IS評(píng)分，陰性和弱陽(yáng)性（0～4分）為低表達(dá)，中陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性（5～12分）為高表達(dá)，將40例病例按照PLAGL2的表達(dá)水平分為高低兩組，進(jìn)行對(duì)照分析?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果提示PLAGL2表達(dá)增高的患者臨床分期較晚（χ2=5.700，P=0.017）、腫瘤較大（χ2=8.174，P=0.008）以及更易發(fā)生遠(yuǎn)隔臟器轉(zhuǎn)移（χ2=13.610，P＜0.001）（表2）。

三、pcDNA3.1-PLAGL2質(zhì)粒的成功構(gòu)建

對(duì)構(gòu)建好的pcDNA3.1- PLAGL2質(zhì)粒進(jìn)行電泳及鑒定測(cè)序，泳道1（M）為D2000 marker，泳道2（質(zhì)粒）為重組質(zhì)粒pcDNA3.1-PLAGL2，泳道3（單酶切）為用BamHI對(duì)質(zhì)粒pcDNA3.1-PLAGL2進(jìn)行單酶切，泳道4（雙酶切）為用BamHI/EcoRI對(duì)質(zhì)粒pcDNA3.1-PLAGL2進(jìn)行雙酶切（圖2）。PLAGL2目的基因片段大小約為1 900 bp，測(cè)序結(jié)果與Genebank上公布的序列基本吻合。

圖1 PLAGL2在不同分期結(jié)腸癌和癌旁組織中的表達(dá)情況（400×）：1A圖為癌旁組織、1B～E圖為Ⅰ～Ⅳ期結(jié)腸癌組織，PLAGL2表達(dá)依次升高且表達(dá)位置主要在細(xì)胞漿中

表1 結(jié)腸癌組織和癌旁組織中IS值的比較

四、PLAGL2高表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)SW480細(xì)胞系的建立

質(zhì)粒pcDNA3.1-PLAGL2轉(zhuǎn)染至SW480結(jié)腸癌細(xì)胞株，經(jīng)過穩(wěn)定生長(zhǎng)、傳代、凍存、復(fù)蘇之后，通過Western-blot檢測(cè)PLAGL2的表達(dá)情況，結(jié)果顯示PLAGL2組細(xì)胞株P(guān)LAGL2蛋白表達(dá)明顯高于SW480組和Vector組，證明轉(zhuǎn)染成功（圖3）。同樣分SW480、Vector、PLAGL2三組進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)并觀察，細(xì)胞為單層貼壁生長(zhǎng)，同樣呈上皮細(xì)胞形態(tài)，三組細(xì)胞形態(tài)無顯著變化，觀察7日內(nèi)的細(xì)胞增殖變化，PLAGL2組比SW480、Vector兩組略高，但差異尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（圖4）。

表2 PLAGL2與臨床病理因素的相關(guān)性

五、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果

用倒置顯微鏡觀察侵襲的細(xì)胞，并分組計(jì)算細(xì)胞個(gè)數(shù)的平均值，SW480、Vector和PLAGL2三組分別為84.60、81.00和122.60，經(jīng)兩兩比較，PLAGL2組與另兩組差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=27.997，P＜0.01）（圖5）。

圖2 酶切片段電泳結(jié)果（泳道1為D2000 marker；泳道2為重組質(zhì)粒pcDNA3.1-ILE1；泳道3為用BamHI對(duì)質(zhì)粒pcDNA3.1-ILE1進(jìn)行單酶切；泳道4為用BamHI/EcoRI對(duì)質(zhì)粒pcDNA3.1-ILE1進(jìn)行雙酶切）

圖3 穩(wěn)轉(zhuǎn)后SW480細(xì)胞行Western-blot結(jié)果

圖4 細(xì)胞增殖曲線

圖5 Transwell法觀察三組細(xì)胞的侵襲能力：上圖為遷移至微孔膜下層的細(xì)胞情況，由左到右依次為SW480、Vector和PLAGL2（200×）；下圖為穿透細(xì)胞個(gè)數(shù)比較（**P＜0.01）

六、EMT標(biāo)志物的表達(dá)情況

應(yīng)用Western-blot對(duì)SW480、Vector和PLAGL2三組細(xì)胞進(jìn)行5次獨(dú)立樣本實(shí)驗(yàn)，計(jì)算目的蛋白E-cadherin、vimentin和MMP-7與β-actin的灰度比值（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，E-cadherin表達(dá)顯著下降（F=38.461，P＜0.01）而vimentin（F=28.741，P＜0.01）和MMP-7（F=24.520，P＜0.01）均有升高，表達(dá)差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖6）。

討 論

PLAGL2是多形性腺瘤基因鋅指蛋白家族成員之一，其他成員包括PLAGl和PLAGLl。PLAG蛋白家族作為細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，在多種基因表達(dá)中起到重要調(diào)控作用，比如細(xì)胞的生理性增殖以及病理性的腫瘤發(fā)生。Zheng H等［8］通過在神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cell，NSC）和神經(jīng)膠質(zhì)瘤啟動(dòng)細(xì)胞（GIC）細(xì)胞株中增強(qiáng)PLAGL2表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PLAGL2基因能夠強(qiáng)烈抑制細(xì)胞分化，增強(qiáng)其自我更新的能力，并賦予惡性腫瘤細(xì)胞某些干細(xì)胞的特性，具體機(jī)制可能與通過調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路而阻礙細(xì)胞分化有關(guān)。PLAGL2蛋白與結(jié)直腸癌相關(guān)的研究文獻(xiàn)不多，Liu等［9］通過對(duì)225例臨床結(jié)直腸癌標(biāo)本以及66例癌旁組織進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)回顧性分析225例患者的臨床病理學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸中PLAGL2的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織，且與腫瘤浸潤(rùn)深度密切相關(guān)。除此之外，還有很多研究已經(jīng)闡明PLAGL2是作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，其過表達(dá)可能會(huì)促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展［10-12］。在我們的研究中，我們首先通過40例患者的病例資料及組織學(xué)標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。免疫組化結(jié)果證明隨著結(jié)腸癌臨床分期增加，PLAGL2 的表達(dá)顯著增加，晚期癌患者的上調(diào)尤為明顯。分析PLAGL2的表達(dá)與臨床病理因素之間的關(guān)系，與腫瘤分期、腫瘤大小以及有無轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而與組織學(xué)類型并無關(guān)系。以上結(jié)果，從病理學(xué)檢測(cè)以及臨床病理因素的回顧性分析兩個(gè)層面說明PLAGL2在結(jié)腸癌的細(xì)胞增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移等方面起到重要作用，但與結(jié)腸癌細(xì)胞本身生物學(xué)惡性程度關(guān)系不大。PLAGL2很可能會(huì)成為新的判斷結(jié)腸癌分期及預(yù)后的標(biāo)記物，同時(shí)也進(jìn)一步確認(rèn)和驗(yàn)證了之前文獻(xiàn)對(duì)PLAGL2的研究結(jié)果［9］。

接著我們的研究從組織水平進(jìn)入到細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過穩(wěn)轉(zhuǎn)高表達(dá)PLAGL2的SW480細(xì)胞株成功建立并穩(wěn)定傳代，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了技術(shù)支持。Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)非常直觀的說明PLAGL2表達(dá)上調(diào)的結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯增強(qiáng)，這很可能與誘發(fā)EMT機(jī)制相關(guān)。近年來，EMT機(jī)制廣泛應(yīng)用于腫瘤學(xué)的研究，而越來越被人所重視。2002年法國(guó)腫瘤學(xué)家Thiery［13］提出腫瘤發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的、多基因參與的多階段過程，其中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是個(gè)非常重要的步驟。Tiwari N等［14］通過研究表明，從良性腺瘤到惡性癌、以及癌的侵襲和轉(zhuǎn)移的過渡過程中，上皮性腫瘤細(xì)胞獲得去分化，遷移行為和侵襲的特征與EMT相關(guān)。而且EMT過程伴隨著細(xì)胞形態(tài)的巨大變化，同時(shí)伴隨細(xì)胞與細(xì)胞之間、細(xì)胞與基質(zhì)之間連接物質(zhì)的丟失和重塑，使得腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲的能力。Gu G等［15］通過對(duì)散發(fā)性結(jié)直腸癌和Lynch綜合癥的侵襲轉(zhuǎn)移能力進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)Lynch綜合癥侵襲能力弱于散發(fā)性結(jié)直腸癌，主要就是跟EMT機(jī)制強(qiáng)弱相關(guān)，其中EMT機(jī)制的發(fā)生包括上皮標(biāo)志丟失，如黏附蛋白E-cadherin、β-catenin以及細(xì)胞角蛋白的丟失，同時(shí)伴隨著許多間質(zhì)性標(biāo)志表達(dá)增加，如N-cadherin、Vimentin以及MMP家族蛋白等。

圖6 Western-blot檢測(cè)三組細(xì)胞株的E-cadherin、vimentin和MMP-7的表達(dá)情況及光密度比值的對(duì)比分析（**P＜0.01）

由于經(jīng)費(fèi)有限，我們只選擇了與EMT相關(guān)的三個(gè)分子E-cadherin、Vimentin以及MMP-7從上皮細(xì)胞、間質(zhì)、細(xì)胞外基質(zhì)三方面進(jìn)行研究。E-cadherin對(duì)細(xì)胞與細(xì)胞及細(xì)胞與基質(zhì)之間的粘附及組織結(jié)構(gòu)的維持起到重要作用。多種惡性腫瘤的分化程度降低、侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)以及預(yù)后不良和E-cadherin的表達(dá)缺失密切相關(guān)［16-19］。Vimentin是細(xì)胞支架的重要成分，能夠固定細(xì)胞器的位置，保持細(xì)胞的完整性［20］。在結(jié)直腸癌中vimentin常以甲基化形式存在，并且已被證實(shí)是結(jié)腸癌的生物標(biāo)志物，同時(shí)也是EMT的標(biāo)志物之一［21］。MMP-7是MMP家族中結(jié)構(gòu)最小的成員，除了與MMP家族成員一樣能降解細(xì)胞外基質(zhì)，還可以調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移［22］。正常機(jī)體極少表達(dá)MMP-7，而主要在病理或生理過程中表達(dá)，如炎癥愈合、胚胎發(fā)育等等［23］。Sun等［24］通過對(duì)17個(gè)研究的2 985例結(jié)直腸癌患者進(jìn)行薈萃分析，總結(jié)了MMP-7表達(dá)增高提示不良的總生存期和無病生存期，同時(shí)降低5年生存率。因此，MMP-7是結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良和高復(fù)反風(fēng)險(xiǎn)的重要指標(biāo)。我們的研究結(jié)果證實(shí)，PLAGL2高表達(dá)的SW480細(xì)胞株侵襲能力增強(qiáng)，EMT相關(guān)的上皮標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)顯著下降，間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin以及細(xì)胞外基質(zhì)標(biāo)志物MMP-7表達(dá)明顯升高，尤其在MMP-7的表達(dá)中可以看到，SW480和Vector兩組表達(dá)很低，說明PLAGL2能夠促進(jìn)MMP-7分子的轉(zhuǎn)錄并發(fā)揮生物學(xué)作用促進(jìn)EMT形成。

綜上所述，本研究揭示了PLAGL2的表達(dá)上調(diào)與結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，并且能夠提高結(jié)腸癌細(xì)胞的侵襲能力，故認(rèn)為PLAGL2是結(jié)腸癌細(xì)胞EMT形成的重要調(diào)節(jié)因子，其表達(dá)上調(diào)以后影響EMT相關(guān)分子的表達(dá)。但目前確切的作用機(jī)制、所涉及的信號(hào)傳導(dǎo)通路等問題將在我們的課題中進(jìn)一步研究。

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