雙殼貝類消化系統(tǒng)中微塑料的分離鑒定及應(yīng)用研究

丁金鳳 李景喜 孫承君 何昌飛 蔣鳳華 高豐蕾 鄭立

摘 要 通過比較10% KOH和30% H2O2消解體系，建立了分離貝類消化系統(tǒng)中微塑料的前處理技術(shù)，采用傅里葉變換顯微紅外光譜儀（μ-FT-IR）和體式顯微鏡實(shí)現(xiàn)了微塑料的定性與定量分析，并用于檢測櫛孔扇貝和紫貽貝中的微塑料。結(jié)果表明，10% KOH消解體系的消解效率較高，聚丙烯（Polypropylene，PP）、聚乙烯（Polyethylene，PE）、聚苯乙烯（Polystyrene，PS）和聚氯乙烯（Polyvinyl chloride，PVC）加標(biāo)回收率為96.7%～98.6%，方法精密度較好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤ 3.2%，能夠滿足檢測要求。檢測了青島5個(gè)大型水產(chǎn)品市場采集的市售櫛孔扇貝（50個(gè)）和紫貽貝（50個(gè)），以及野生紫貽貝（15個(gè)）中的微塑料，貝類中微塑料的個(gè)體檢出率達(dá)80%以上，野生貝類中微塑料的個(gè)體檢出率僅為40%。不同市區(qū)市售櫛孔扇貝中微塑料平均豐度變化范圍為5.2～19.4 個(gè)/個(gè)體和3.2～7.1 個(gè)/g（消化系統(tǒng)組織濕重），不同市區(qū)市售紫貽貝中微塑料平均豐度變化范圍為1.9～9.6 個(gè)/個(gè)體和2.0～12.8 個(gè)/g，其中，市售紫貽貝中微塑料的平均豐度（1.9個(gè)/個(gè)體，3.17個(gè)/g）高于野生紫貽貝中微塑料的平均豐度（0.53 個(gè)/個(gè)體，2.0 個(gè)/g）。在貝類中分離到纖維、碎片和顆粒3種形狀的微塑料，其中，纖維狀微塑料的豐度最高且平均粒徑最大。不同市區(qū)貝類消化系統(tǒng)中的微塑料隨著粒徑增大，數(shù)量呈遞減的總體趨勢，其中，小于500 μm的微塑料占微塑料總量的26%～84%。貝類中豐度最高的微塑料的聚合物成分是賽璐玢（Cellophane，CP），其次是聚丙烯（Polypropylene，PP）。本方法具有簡單、高效、對樣品中微塑料損害低等優(yōu)點(diǎn)，適用于海產(chǎn)品中微塑料的檢測分析。

關(guān)鍵詞 微塑料；雙殼貝類；消化系統(tǒng)；微塑料污染；紅外光譜

1 引 言

塑料及其制品被人類廣泛使用，它在給人類的生活和社會(huì)生產(chǎn)帶來便利的同時(shí)，廢棄塑料垃圾大量累積，也對環(huán)境造成了污染。據(jù)報(bào)道，全球每年生產(chǎn)的塑料超過3 億噸，其中約有10%的塑料會(huì)通過河流輸入等方式進(jìn)入海洋[1]，在物理、化學(xué)、生物等共同作用下[2]，大片塑料被分解成較小的碎片，當(dāng)形成粒徑<5 mm的顆粒時(shí)，可稱之為微塑料[3]。由于塑料的化學(xué)性質(zhì)較為穩(wěn)定，可在海里留存上百年甚至數(shù)千年[4]。微塑料具有顆粒比表面積大、疏水性強(qiáng)等特點(diǎn)，易吸附持久性有機(jī)物[5，6]及重金屬[7]等污染物。微塑料在海洋中或漂浮于海水中，或沉降于海底成為沉積物的組分[8]，吸附污染物的微塑料被浮游動(dòng)物和底棲動(dòng)物攝食后，對生物有直接的毒害作用，并且可通過食物鏈傳遞效應(yīng)在生物體內(nèi)富集[9～12]。在生物腸道條件下，微塑料吸附的污染物解吸速度比在單獨(dú)的海水中高30 倍[13]，因此，海洋環(huán)境中的微塑料最終可能會(huì)危及人類的健康。

雙殼貝類是底棲濾食性生物的優(yōu)勢類群，經(jīng)常被作為污染的指示生物，用于海洋環(huán)境監(jiān)測； 同時(shí)，雙殼貝類味道鮮美，是主要的海產(chǎn)品，貝類攜帶的微塑料極易進(jìn)入人體內(nèi)。盡管到目前為止，攝入的微塑料對生物和人體的影響尚不明確，但研究生物體內(nèi)微塑料的分布情況對正確評價(jià)其影響有重要意義，因而調(diào)查監(jiān)測市售貝類產(chǎn)品微塑料含量，保證海產(chǎn)品安全，具有一定的研究意義和實(shí)際價(jià)值。目前，國內(nèi)已經(jīng)有針對市售貝類整體軟組織中微塑料含量的調(diào)查[14，15]，但是探究多種貝類消化系統(tǒng)中微塑料含量的研究較少，且樣品的處理方法還有待改進(jìn)，而雙殼貝類的消化系統(tǒng)組織是微塑料的高密度聚集區(qū)，因此檢測雙殼貝類消化系統(tǒng)中的微塑料可以反映整個(gè)貝類軟組織中微塑料的含量，具有一定的科學(xué)意義。

生物樣品中分離微塑料的關(guān)鍵在于有效的消解有機(jī)質(zhì)，且不影響微塑料的定性與定量分析。目前，應(yīng)用于生物樣品預(yù)處理的方法主要有：酸性消解、堿性消解及酶消解[16]。酸性消解在消解生物樣品的同時(shí)也會(huì)消解部分類型的微塑料[16]，如van Cauwenberghe等[17]使用69% HNO3溶液分離貽貝體內(nèi)的微塑料，檢出微塑料的豐度僅有0.36 個(gè)/g，并且沒有觀察到纖維狀的微塑料； Catarino等[18]發(fā)現(xiàn)使用HNO3溶液過夜消解后，尼龍纖維類的微塑料消失。堿性消解需控制合適的堿濃度，既能消解有機(jī)質(zhì)，而且不影響微塑料的定性與定量分析，如Cole等[19]發(fā)現(xiàn)1 mol/L NaOH在室溫條件下對海水中浮游生物的消解率可達(dá)90%，但當(dāng)NaOH濃度達(dá)到10 mol/L時(shí)，會(huì)損壞部分微塑料。酶消解的成本較高，使用較少。分離收集的微塑料需進(jìn)一步通過鑒定，以明確微塑料的成分。目前微塑料的鑒定方法有：高溫裂解氣相色譜/質(zhì)譜法、拉曼光譜法、傅立葉變換紅外光譜法。 前兩種方法鑒定微塑料成分時(shí)，容易受到塑料添加劑以及其它污染物的影響，并且高溫裂解氣相色譜/質(zhì)譜法進(jìn)行微塑料鑒定分析時(shí)，會(huì)完全破壞樣品，造成樣品的不可回收。傅里葉變換紅外光譜法是目前較為通用的方法，這種方法分析樣品前只需將樣品進(jìn)行干燥處理[1]。

本研究選取青島市5個(gè)大型水產(chǎn)品市場中的雙殼貝類及黃島區(qū)野生紫貽貝為調(diào)查對象，建立了分離貝類消化系統(tǒng)中微塑料的前處理技術(shù)，初步調(diào)研了市售櫛孔扇貝（Chlamys farreri）和紫貽貝（Mytilus galloprovincialis）消化系統(tǒng)中微塑料的累積情況，并與野生紫貽貝消化系統(tǒng)中的微塑料進(jìn)行對比，為青島沿岸水域的微塑料污染及生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)方面的調(diào)查研究提供了一定的方法學(xué)參考以及環(huán)境評估信息。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Nicolet iN 10MX傅里葉變換顯微紅外光譜儀（Thermo公司）； 尼康SMZ1270型體視顯微鏡（南京衡橋儀器有限公司）；ZQLY-180S型振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚儀器有限公司）； FSH-2A可調(diào)高速勻漿機(jī)（金壇市城西崢嶸實(shí)驗(yàn)儀器廠）； KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波儀（昆山市超聲儀器有限公司）；SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）； 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）； Milli-Q超純水（18.2 MΩ cm）處理系統(tǒng)（美國Millipore公司）； ME104/02型電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）。

PP、PE、PS、PVC微塑料標(biāo)準(zhǔn)品（粒徑 50 μm，上海陽勵(lì)機(jī)電科技有限公司）； KOH、 30% H2O2（分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）； 玻璃纖維素濾膜（Whatman GF/F）。

2.2 微塑料回收實(shí)驗(yàn)

為了考察方法的準(zhǔn)確度，在實(shí)驗(yàn)室中分別取15個(gè)較肥和較瘦弱的紫貽貝的消化系統(tǒng)部分，勻漿混勻后作為消解基質(zhì)，并以10% KOH溶液與30% H2O2溶液為消解體系， 對樣品進(jìn)行處理。選取粒徑為50 μm的海洋環(huán)境中常見的4種材質(zhì)的微塑料標(biāo)準(zhǔn)品（PP、PE、PS、PVC）進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每組做3個(gè)重復(fù)，同時(shí)每個(gè)消解體系做3個(gè)空白對照。具體步驟如下：（1）準(zhǔn)確稱取0.50 g勻漿后的消化系統(tǒng)組織和0.1000 g微塑料標(biāo)準(zhǔn)品于250 mL錐形瓶中。 （2）每個(gè)錐形瓶中加入50 mL 10% KOH溶液或30% H2O2溶液后密封。（3）超聲5 min完全混勻后，將錐形瓶放入60℃、90 r/min的振蕩培養(yǎng)箱中消解有機(jī)質(zhì)。（4）消解24 h后，立即將消解后的溶液抽濾至已稱重的玻璃纖維濾膜上（直徑為47 mm，孔徑為0.7 μm）。（5）將濾膜暫放于玻璃培養(yǎng)皿中，于50℃的烘箱中干燥后稱重，計(jì)算回收率。

2.3 雙殼貝類樣品采集及微塑料的分離

養(yǎng)殖的櫛孔扇貝和紫貽貝購于青島市區(qū)的5個(gè)大型水產(chǎn)品批發(fā)市場（2017年春季），野生紫貽貝采集于青島市黃島區(qū)的巖石海岸帶（2017年春季）。生物樣品采集完畢后，立即帶回實(shí)驗(yàn)室，測量其體長、體重并記錄，于20℃下冷凍保存至分析。

解剖取單個(gè)貝類消化系統(tǒng)部分，貝類的消化系統(tǒng)由消化道及消化腺組成，解剖時(shí)應(yīng)避免誤取其它組織。取出貝類消化系統(tǒng)組織稱重后置于250 mL錐形瓶中，加入100 mL 10% KOH溶液后密封。超聲5 min后，將錐形瓶置于振蕩培養(yǎng)箱消解24 h。樣品消解完成后，立即將消解后的溶液抽濾至玻璃纖維濾膜上。濾膜置于玻璃培養(yǎng)皿中，于50℃的烘箱中干燥待測。

每次實(shí)驗(yàn)時(shí)做一個(gè)空白對照， 以除去實(shí)驗(yàn)室環(huán)境對樣品的沾污，實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)避免接觸纖維類以及塑料器材。另外，所有使用的玻璃容器均用超純水沖洗3次。對于非使用中的樣品及溶液，應(yīng)覆蓋避免沾污。

2.4 微塑料樣品的定量與定性分析

將富集微塑料的濾膜放置在體視顯微鏡下對微塑料進(jìn)行觀察（放大20～80倍），將微塑料顆粒以及疑似為微塑料的顆粒進(jìn)行記錄，并用尼康Ds-Ri2照相系統(tǒng)拍攝微塑料照片。獲得的微塑料及疑似微塑料的顆粒利用傅里葉變換顯微紅外光譜儀進(jìn)行成分分析，確定聚合物的類型。紅外光譜儀選用透射模式，光譜范圍設(shè)定為4000～675 cm1，樣品采集時(shí)間為3 s，每次測量共進(jìn)行16次掃描，光譜分辨率設(shè)置為8 cm1。光闌大小視樣品中微塑料的具體尺寸確定。最后，將微塑料光譜圖與OMNIC picta軟件中的譜庫進(jìn)行檢索對比，結(jié)合官能團(tuán)的特征峰以確定聚合物的類型。

3 結(jié)果與討論

3.1 方法學(xué)考察結(jié)果

對10% KOH和30% H2O2溶液消解0.50 g消化系統(tǒng)組織的結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果表明，消解24 h后，10% KOH溶液可完全消解，溶液中無固體有機(jī)質(zhì)的存在，剩余有機(jī)質(zhì)的質(zhì)量僅為0.0033 g，殘余量為6.6‰； 30% H2O2溶液消解有機(jī)質(zhì)24 h后，溶液中仍有少量白色固體有機(jī)質(zhì)，剩余有機(jī)質(zhì)的質(zhì)量為0.0155 g，殘余量為3.1%，兩者在統(tǒng)計(jì)學(xué)分析上存在極顯著差異（p<0.01）。

通過計(jì)算回收率發(fā)現(xiàn)，以10% KOH溶液為消解體系，PP、PE、PS和PVC標(biāo)準(zhǔn)品回收率的范圍為96.7%～98.6%（PP>PE>PS>PVC）； 以30% H2O2溶液為消解體系，PP、PE、PS和PVC標(biāo)準(zhǔn)品回收率的范圍為93.7%～97.6%（PS>PP>PE>PVC）。不同消解體系，4種微塑料標(biāo)準(zhǔn)品的回收率均表現(xiàn)為10% KOH>30% H2O2，其中，PS標(biāo)準(zhǔn)品的回收率在兩種消解體系中差異不明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以10% KOH溶液作為消解體系， 4種材質(zhì)的微塑料回收精密度較好（RSD≤3.2%），說明測定結(jié)果具有良好的重現(xiàn)性和準(zhǔn)確度。加標(biāo)回收率及精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

3.2 生物樣品的形態(tài)學(xué)特征

測量了采集的貝類的殼長、帶殼濕重以及消化系統(tǒng)組織的濕重，結(jié)果見表2。不同市區(qū)同一物種的形態(tài)學(xué)特征差距不明顯，但同一市區(qū)不同物種形態(tài)學(xué)特征差距較大，其中，同一市區(qū)的貝類消化系統(tǒng)組織濕重的比較：市售櫛孔扇貝>市售紫貽貝>野生紫貽貝。

3.3 生物中微塑料的含量及分布特征

3.3.1 貝類中的個(gè)體微塑料檢出率 貝類（2種）消化系統(tǒng)中的微塑料檢測結(jié)果顯示（表2）： S1和S5市售紫貽貝的個(gè)體微塑料檢出率達(dá)到100%，其它3區(qū)均為90%； S1、S2及S4的市售櫛孔扇貝的個(gè)體微塑料檢出率為90%，而S3的個(gè)體微塑料檢出率是100%，S5較其它地點(diǎn)低，個(gè)體微塑料檢出率為80%。野生紫貽貝的個(gè)體微塑料檢出率只有40%。由此可見，養(yǎng)殖貝類中的個(gè)體微塑料檢出率高于野生貝類中的個(gè)體微塑料檢出率。

3.3.2 貝類中微塑料的豐度分布 在貝類樣品中，市售櫛孔扇貝消化系統(tǒng)中微塑料的平均豐度為5.2～19.4個(gè)/個(gè)體和3.2～7.1個(gè)/g，市售紫貽貝的平均豐度范圍為1.9～9.6個(gè)/個(gè)體和2.0～12.8 個(gè)/g （圖1），與Li等[15]檢測的紫貽貝整個(gè)軟組織中的微塑料平均豐度相差不大。其中，S1的紫貽貝消化系統(tǒng)組織中微塑料的平均豐度（9.6個(gè)/個(gè)體，12.8 個(gè)/g）在5個(gè)市區(qū)的紫貽貝中均表現(xiàn)為最高，這與貝類生長區(qū)環(huán)境污染嚴(yán)重密切相關(guān)。本研究為了排除空氣中微塑料的污染，每次實(shí)驗(yàn)設(shè)置一組空白對照，結(jié)果表明，空白組的微塑料含量只有（0.67±0.58）個(gè)/濾膜，并且在統(tǒng)計(jì)結(jié)果中均已扣除了背景值。

本研究發(fā)現(xiàn)，市售紫貽貝消化系統(tǒng)中微塑料的平均豐度（1.9個(gè)/個(gè)體，3.17 個(gè)/g）高于野生紫貽貝消化系統(tǒng)中微塑料的平均豐度（0.53個(gè)/個(gè)體，2.0個(gè)/g），兩者體內(nèi)微塑料積累量差異顯著，這與Mathalon等的研究結(jié)果一致[20]。這可能與養(yǎng)殖紫貽貝附著在聚丙烯塑料線上生長有關(guān)，養(yǎng)殖水域內(nèi)可能含有較短、老化的聚丙烯塑料線，增加了養(yǎng)殖紫貽貝誤食的幾率。而Li等[15]的研究指出野生紫貽貝體內(nèi)微塑料的含量高于養(yǎng)殖紫貽貝體內(nèi)微塑料的含量。文獻(xiàn)[21，22]的結(jié)果表明， 養(yǎng)殖紫貽貝與野生紫貽貝體內(nèi)微塑料含量差異不明顯。可見，不同地區(qū)紫貽貝中微塑料含量差異大，這可能與不同地區(qū)受微塑料污染的程度大小相關(guān)。

3.3.3 貝類中不同形狀微塑料的含量 貝類樣品中存在纖維、碎片和顆粒3種不同形狀的微塑料，其含量高低順序?yàn)槔w維狀>碎片狀>顆粒狀，分別占微塑料總數(shù)的84.11%、14.94%和0.95%。其中，顆粒狀微塑料僅在S3和S5市售櫛孔扇貝中檢出，且數(shù)量較少，S2和S3市售紫貽貝中檢出碎片狀的微塑料數(shù)量較其它市區(qū)偏高（表3）。由此說明，不同市區(qū)的微塑料污染情況具有較大的空間差異性。

3.4 貝類中微塑料的顏色及粒徑特征

3.4.1 貝類中微塑料的顏色特征 貝類樣品中檢出的微塑料有多種顏色。其中，纖維狀的多為黑色和藍(lán)色，也有少量為綠色（圖2A～2C）。碎片狀的微塑料以透明和紅色為主（圖2D～2F）； 顆粒類的微塑料多為白色的小球（圖2G）。

3.4.2 貝類中微塑料的粒徑特征 貝類消化系統(tǒng)中檢出的微塑料的粒徑范圍是在25 μm～5 mm。其中，粒徑小于500 μm的微塑料占26%～84%， 500～1000 μm之間的微塑料占13%～53%，>1 mm的微塑料占3%～42%（圖3）。不同市區(qū)貝類中的微塑料隨著粒徑增大，數(shù)量呈現(xiàn)遞減的總體趨勢。

本實(shí)驗(yàn)中在測量不同形狀微塑料的粒徑時(shí)，纖維狀的微塑料是對其實(shí)際長度進(jìn)行的測量，碎片狀和顆粒狀的微塑料則通過測量其最長長度作為微塑料的粒徑。通過統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，不同形狀的微塑料粒徑分布也有所差異。纖維狀微塑料的平均粒徑最大，達(dá)到（0.66±0.70） mm； 其次是碎片狀微塑料，平均粒徑為（0.39±0.50） mm； 顆粒狀微塑料的平均粒徑最小，為（0.25±0.11）mm（圖4A）。另外，不同市區(qū)的纖維狀微塑料的平均粒徑均最大，碎片狀微塑料的平均粒徑空間差異性較大（圖4B）。可見，微塑料粒徑的大小差距較大且受空間差異的影響，可能與貝類生長區(qū)塑料不同的碎化程度有關(guān)。

3.5 貝類中微塑料的聚合物類型

通過μ-FT-IR 鑒定貝類中微塑料聚合物的成分，發(fā)現(xiàn)貝類中豐度最高的微塑料成分是賽璐玢（CP）（圖5A），其次是聚丙烯（PP）（圖5B）、聚四氟乙烯（PTFE）等。樣品中大部分纖維狀的微塑料為賽璐玢，少量碎片狀的微塑料也為賽璐玢。賽璐玢是一種再生纖維素薄膜，具有較低的生物降解性。許多塑料被貼上“可生物降解”的標(biāo)簽，但只有溫度達(dá)到50℃才會(huì)完全分解，可生物降解塑料似乎是解決海洋塑料垃圾問題的“虛假解決方案”[23]。文獻(xiàn)[23～25]中均將賽璐玢定義為微塑料。本研究也將賽璐玢認(rèn)定為微塑料。另外，本研究在養(yǎng)殖紫貽貝消化系統(tǒng)中檢測出聚丙烯塑料線，而在野生紫貽貝消化系統(tǒng)中檢出的微塑料多為纖維狀的賽璐玢。由此說明，養(yǎng)殖與野生貝類體內(nèi)的微塑料含量與其所在的環(huán)境密切相關(guān)，可通過檢測貝類體內(nèi)微塑料的類型，側(cè)面評估養(yǎng)殖水域的微塑料污染情況。

4 結(jié) 論

采用KOH消解體系對貝類消化系統(tǒng)組織進(jìn)行消解，不但消解徹底、節(jié)省了樣品前處理時(shí)間，而且加標(biāo)微塑料回收率高。結(jié)果表明，市售貝類消化系統(tǒng)中微塑料的豐度較高，并且微塑料的形狀和粒徑分布具有較大的空間差異性。另外，本研究發(fā)現(xiàn)市售貝類消化系統(tǒng)中微塑料的個(gè)體檢出率高于野生貝類中的個(gè)體微塑料檢出率，并且貝類消化系統(tǒng)中的微塑料的類型及含量與環(huán)境中的微塑料分布密切相關(guān)。本研究結(jié)果可為海洋環(huán)境微塑料污染狀況評價(jià)及海產(chǎn)品安全控制等提供技術(shù)支撐。

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