酯提除雜法高效提取分離芒果葉芒果苷

韋會平 鄭毅 韓洪波 尚遠宏

摘要：【目的】優(yōu)化酯提除雜法提取分離芒果葉芒果苷工藝，為芒果苷相關產品的開發(fā)利用提供原料和技術支持。【方法】采用原料粉碎→酯提除雜→甲醇提取→濃浸膏洗滌→結晶沉淀的五步法從芒果葉中提取分離芒果苷，通過單因素試驗和L₉（3⁴）正交試驗對提取時間、超聲波功率、提取次數(shù)和提取溫度等工藝參數(shù)進行優(yōu)化。【結果】酯提除雜法提取分離芒果葉中芒果苷的最佳工藝：將芒果葉粉碎過篩；按3 mL/g加入乙酸乙酯，密封浸泡4 h，超聲波振蕩提取20min（50℃，350w），室溫100目過濾，反復提取3次；在殘渣中按3 mL/g加入100%甲醇，超聲波振蕩提取4次（20min，350 w，55℃），趁熱100目抽濾；將各次提取液合并，真空減壓濃縮得濃浸膏產品；按4 mL/g加入100%甲醇，室溫攪拌洗滌5 min，靜置10 min，100目過濾，反復洗滌3次，濾渣60℃干燥得芒果苷粗品；按4 mL/g加入100%甲醇，50℃攪拌洗滌5 min，6℃靜置8 h，取出過濾，濾渣60℃干燥，反復結晶2次。按照上述工藝可獲得芒果苷粗品和純品2種產品，粗品的芒果苷純度>64.00%，總回收率83.90%，純品的芒果苷純度>98.00%，總回收率約66.40%?！窘Y論】優(yōu)化后的酯提除雜法提取分離芒果苷工藝操作簡便、成本低廉、效率高，可用于芒果苷實際生產。

關鍵詞：芒果苷；芒果葉；提??；分離；酯提除雜法

0引言

【研究意義】芒果苷（Mangiferin）為帶四羥基吡酮的碳酮苷類物質，分子式C₁₉H₁₈O₁₁，具有抗氧化、抗炎、降血糖、降尿酸、抗病毒、抗腫瘤、祛痰止咳等藥理作用（黃瀟和彭志剛，2007；Lee et al，2009；Viswanadh et al，2010），是我國藥典中多種傳統(tǒng)中藥材和中成藥的藥效成分和質量指標控制成分（國家藥典委員會，2015），具有極高的藥用價值。近年來，對芒果苷的藥理作用機制及藥用安全性評價已成為研究熱點（鄧幸運，2017；胡小勤等，2017；李霞等，2017；劉穎等，2017；王勤等，2017a，2017b，2017c，2017d），充分展示出芒果苷良好的開發(fā)利用前景。芒果葉是至今發(fā)現(xiàn)芒果苷含量最高的植物資源（胥秀英等，2011；韋會平等，2016），因此，探究芒果葉芒果苷的高效提取工藝，對降低其生產成本、促進新型產品開發(fā)及提高芒果產業(yè)經濟效益均具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】國內外對芒果苷提取分離工藝的研究主要集中于2008～2014年，近年來對其相關研究報道較少。鄧家剛和李學堅（2008）采用高濃度乙醇回流提取法提取芒果葉中的芒果苷，再以D101和D296兩種大孔樹脂柱層析分離得到純度為97.04%的芒果苷，回收率為58.92%；李學堅等（2011，2012）對上述工藝進行改進，采用弱堿性水提取芒果苷，再以D101和D301兩種大孔樹脂柱層析分離得到純度93.96%的芒果苷純品，回收率為65.64%；謝黎崖等（2010）采用乙醇微波提取法從芒果葉中提取芒果苷，結果顯示微波提取法相對于傳統(tǒng)回流提取法在提取時間和速率等方面更具優(yōu)勢；劉昊（2014）通過乙醇加熱回流提取芒果葉中的芒果苷，以AB-8大孔樹脂柱層析分離得到芒果苷純品，回收率僅為54.60%；鄧幸運（2017）以250%乙醇為溶劑，采用超聲波提取法從白木香葉中提取芒果苷，再用AB-8大孔樹脂柱層析分離得到芒果苷，純度為80.00%?！颈狙芯壳腥朦c】現(xiàn)有的芒果苷提取工藝均需經過復雜的柱層析分離才能獲得芒果苷純品，但芒果葉中膠質含量極高，粗提濃縮液十分黏稠，極易堵塞色譜柱或過濾裝置，分離純化操作難度極高，導致芒果苷提取分離工藝復雜、效率低、成本高，亟需改進以提高芒果苷的提取分離效率，降低生產成本?！緮M解決的關鍵問題】基于芒果葉中芒果苷含量變化規(guī)律（韋會平等，2016），以乙酸乙酯去除芒果葉中的部分雜質（包括大部分膠質）（簡稱酯提除雜法），利用芒果苷在冷熱甲醇中的溶解度差異來提取分離芒果苷，為芒果苷相關產品的開發(fā)利用提供原料和技術支持。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試芒果葉采自攀枝花市仁和區(qū)農家芒果園，自然陰干，粉碎過20目篩。芒果苷標準品（批號100268-200401，純度98.2%）購自中國藥品生物制品檢定所。高效液相色譜（HPLC）流動相用乙腈為色譜純，水為重蒸水，其余試劑為分析純。主要儀器設備：FW100高速萬能粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）、YM-2000CT多用途恒溫超聲波提取器（上海豫民儀器有限公司）、R-1005Ex真空旋轉蒸發(fā)儀（鄭州長城科工貿有限公司）、Agilent 1200高效液相色譜儀及化學工作站（安捷倫科技有限公司）、XS205DU電子天平（梅特勒一托利多儀器有限公司）、電熱恒溫鼓風干燥箱（上?，槴\實驗設備有限公司）等。

1.2芒果葉中芒果苷含量測定

參照韋會平等（2016）的標準曲線法精密測定芒果葉中芒果甘含量。Eelipse XDB-C₁₈色譜柱（4.6nlnqx150mm，5μm）；流動相為乙腈和0.2%冰醋酸水溶液（15/85，v/v）；檢測波長258nm；柱溫為室溫；進樣量20μL。

1.3芒果苷提取工藝優(yōu)化

1.3.1提取溶劑選擇稱取芒果葉粉100g，共6份，分別加入300mL 6種提取溶劑[堿水（pH9NaOH溶液）、100%甲醇、50%甲醇、無水乙醇、50%乙醇和乙酸乙酯]，室溫密封浸泡8h，超聲波振蕩提取30min（50℃，350w），趁熱100目抽濾，反復提取5次，合并提取液，真空減壓濃縮得到濃浸膏產品，稱重，并取樣測定其芒果苷純度及提取率（提取后所得產品和提取前原料中所含芒果苷的質量百分比），確定最佳提取溶劑。

1.3.2除雜工藝優(yōu)化根據1.3.1試驗結果，選擇純度和提取率均較低的溶劑為除雜溶劑，除去芒果葉中的部分雜質，并對該工藝進行優(yōu)化。提取次數(shù)優(yōu)化：稱取芒果葉100 g，加入除雜溶劑300 mL，室溫密封浸泡4 h，超聲波振蕩提取30 min（50℃，350 w），100目過濾，反復提取5次，將每次提取液分別真空減壓濃縮得到濃浸膏雜質，稱重，并測定其芒果苷含量即芒果苷損失量，計算每次提取的芒果苷損失率（每次提取的芒果苷損失量占提取前芒果苷總量的百分比），以確定最佳提取次數(shù)。提取時間優(yōu)化：分別稱取芒果葉粉100g，共3份，加入除雜溶劑300 mL，室溫密封浸泡4 h，超聲波振蕩提取30 min（50℃，350 w），100目過濾，各提取3次，每次提取時間分別為10、20和30 min，將3次提取液合并進行真空減壓濃縮得到濃浸膏雜質，稱重，并測定其芒果苷含量即芒果苷損失量，計算各提取時間的芒果苷損失率，確定最佳提取時間。

1.3.3提取工藝優(yōu)化稱取芒果葉100g，按1.3.1最佳除雜工藝進行除雜，取除雜后的殘渣，加入最佳提取溶劑進行超聲波振蕩提取，每次提取均加入300 mL最佳提取溶劑，提取后趁熱100目抽濾，將每次的提取液合并進行真空減壓濃縮得到濃浸膏產品，稱重，并計算芒果苷純度及提取率。固定上述條件，以每次提取時間（A）、超聲波功率（B）、提取次數(shù)（C）和提取溫度（D）為考察因素，以提取率作為考察指標，設計L₉（3⁴）正交試驗，確定最佳提取工藝條件，并開展3次驗證試驗（表1）。

1.4濃浸膏洗滌工藝優(yōu)化

1.4.1洗滌溶劑選擇稱取1.3.3最佳提取工藝條件下獲得的濃浸膏產品10 g，共4份，分別加入40 mL 4種洗滌溶劑（100%甲醇、無水乙醇、蒸餾水和乙酸乙酯），室溫攪拌洗滌5 min，靜置10 min，100目過濾，反復洗滌5次，濾渣60℃干燥得到芒果苷粗品，稱重，并計算芒果苷純度及回收率（芒果苷粗品和洗滌前濃浸膏產品中芒果苷的質量百分比），確定最佳洗滌溶劑。

1.4.2洗滌次數(shù)優(yōu)化稱取1.3.3最佳提取工藝條件下獲得的濃浸膏產品10 g，加入最佳的洗滌溶劑按1.4.1方法進行5次洗滌，對每次的洗滌濾液進行取樣，測定其芒果苷含量，并將每次的洗滌濾液進行減壓濃縮得到濃浸膏雜質，稱重，計算每次洗滌洗去的雜質質量及芒果苷的損失率（洗滌液和洗滌前濃浸膏產品中芒果苷的質量百分比），確定最佳洗滌次數(shù)。

1.5結晶工藝優(yōu)化

1.5.1結晶溶劑選擇稱取1.4最佳提取工藝條件下獲得的芒果苷粗品5 g，共5份，分別加入20 mL5種結晶溶劑（100%甲醇、50%甲醇、無水乙醇、50%乙醇和蒸餾水），50℃下攪拌洗滌5 min，6℃靜置8 h，取出趁冷過濾，濾渣60℃干燥得到結晶產品，稱重，并計算結晶產品中芒果苷純度及回收率（結晶前后產品中芒果苷的質量百分比）。

1.5.2結晶次數(shù)優(yōu)化稱取按1.4最佳提取工藝條件所得芒果苷粗品5 g，加入20 mL 100%甲醇，按1.5.1方法進行結晶處理，反復重結晶3次，測定每次結晶所得產品的純度及回收率。

1.6統(tǒng)計分析

以SPSS19.0（LSD法）對試驗數(shù)據進行差異顯著性分析。

2結果與分析

2.1芒果葉中芒果苷含量測定結果

經1.2方法精密測定，本研究所用芒果葉原料中芒果苷含量為2.61%。

2.2提取溶劑對芒果苷純度及提取率的影響

由表2可知，使用堿水、100%甲醇、50%甲醇、無水乙醇和50%Z，醇均能從芒果葉提取出芒果苷，其中，堿水的提取率高達92.3%，顯著高于其他提取溶劑（P<0.05，下同），但提取的芒果苷純度較低，僅7.60%；100%甲醇和50%乙醇提取的芒果苷純度均顯著高于其他提取溶劑，提取率均顯著高于除堿水以外的其他提取溶劑，雖然二者的提取率和芒果苷純度均無顯著差異（P>0.05，下同），但50%乙醇所得濃浸膏產品更黏稠，濃縮過程的耗能更大，因此100%甲醇為提取溶劑提取效果較50%乙醇優(yōu)，確定100%甲醇為最佳提取溶劑。此外，乙酸乙酯作為提取溶劑提取的浸膏產品質量高達20.1g，僅次于堿水（31.7g），但芒果苷純度和提取率均顯著低于其他提取溶劑，可利用該特性來除去芒果葉中大量雜質。

2.3提取次數(shù)和提取時間對除雜效果的影響

根據上述試驗結果，選用乙酸乙酯除去芒果葉中的部分雜質。由表3可知，在酯提除雜過程中，除去的雜質質量隨提取次數(shù)增加急劇減少，前3次除去的雜質總量占5次除去雜質總量的90%以上，每次提取的芒果苷損失量為25.0 mg左右，損失率約1%。綜合考慮，除雜提取次數(shù)以3次為宜。由表4可知，與提取時間20 min相比，提取時間30 min去除的雜質質量無顯著增加，但芒果苷損失量顯著增加。綜合考慮，提取時間以20 min為宜。

2.4正交試驗結果

如表5所示，提取時間、超聲波功率、提取次數(shù)和提取溫度均對提取率有顯著影響，其影響程度排序為：提取溫度>提取次數(shù)>超聲波功率>提取時間。雖然提取溫度對提取率的影響最大，提取溫度越高，

2.5洗滌溶劑對芒果苷純度及回收率的影響

由表6可知，不同溶劑洗滌所得粗品中芒果苷純度和回收率均存在顯著差異，其中100%甲醇洗滌所得粗品中芒果苷純度顯著高于其他溶劑，達64.50%，回收率達85.20%。因此，100%甲醇為最佳的洗滌溶劑。

2.6洗滌次數(shù)對芒果苷純度及回收率的影響

如表7所示，隨著洗滌次數(shù)增加，每次洗去的雜提取率越高，但甲醇沸點低、揮發(fā)性大，從生產安全考慮，提取溫度以不超過55℃為宜；其余3個因素均是1水平顯著低于2水平和3水平，2水平和3水平間無顯著差異。因此，從耗時、成本及安全等因素考慮，最佳方案是A282C2D3，即提取時間20 min，超聲波功率350w，提取次數(shù)4次，提取溫度55℃。對其進行3次驗證試驗，結果顯示平均提取率為95.1%，芒果苷純度高達25.50%。

質質量急劇降低，前3次洗去的雜質總質量占5次洗去雜質總量的95%以上；每次洗滌的芒果苷損失量為76.0 mg左右，損失率約3%。綜合考慮，確定最佳洗滌次數(shù)為3次，可洗去濃浸膏產品60%以上的雜質，芒果苷總損失率約9%，芒果苷純度在64.00%以上。

2.7結晶溶劑對芒果苷純度及回收率的影響

如表8所示，100%甲醇作結晶溶劑所得產品的芒果苷純度顯著高于其他溶劑，回收率顯著高于除蒸餾水以外的其他3種溶劑，但以蒸餾水作結晶溶劑所得產品的芒果苷純度最低。綜合考慮，以100%甲醇為最佳結晶溶劑。

2.8結晶次數(shù)對芒果苷純度及回收率的影響

如表9所示，隨著結晶次數(shù)的增加，產品的芒果苷純度也逐漸升高，但結晶次數(shù)超過2次后，產品的芒果苷純度升高不顯著。考慮到結晶次數(shù)越多，芒果苷損失量越大，因此，以結晶2次為宜，此時產品的芒果苷純度達98.23%，回收率達88.13%。

2.9驗證試驗結果

綜上所述，從芒果葉中提取分離芒果苷的最佳工藝為：（1）原料粉碎：芒果葉干燥，粉碎過20目篩；（2）酯提除雜：在芒果葉中按3 mL/g加入乙酸乙酯，密封浸泡4 h，超聲波振蕩提取20 min（50℃，350w），100目過濾，反復提取3次得到芒果葉殘渣；（3）甲醇提取：在芒果葉殘渣中按3 mL/g加入100%甲醇，超聲波振蕩提取4次（20 min，350 w，55℃），趁熱100目抽濾，將每次提取液合并進行真空減壓濃縮得到濃浸膏產品；（4）濃浸膏洗滌：在濃浸膏產品中按4 mL/g加入100%甲醇，室溫攪拌洗滌5 min，靜置10 min，100目過濾，反復洗滌3次，濾渣60℃干燥得到芒果苷粗品；（5）結晶干燥：在芒果苷粗品中按4 mL/g加入100%甲醇，50℃攪拌洗滌5 min，冰箱6℃靜置8 h，取出趁冷過濾，濾渣60℃干燥，反復結晶2次。按照上述工藝可得芒果苷粗品和純品2種產品，粗品的芒果苷純度>64.00%，總回收率83.90%；純品的芒果苷純度>98.00%，總回收率約66.40%。

3討論

目前，從芒果葉或其他植物中提取芒果苷的工藝均需進行柱層析分離純化（鄧家剛和李學堅，2008；李學堅等，2011，2012；鄧幸運，2017），但芒果苷在單一強極性、弱極性和非極性溶劑中溶解度均較差，且芒果葉中膠質含量高，對芒果苷提取分離干擾大，提取后的濃縮液黏度高，過濾難度大，分離時易堵塞色譜柱，因此，整個提取過程耗時、耗資、效率低。李學堅等（2012）采用弱堿性水提取芒果苷，經過2次柱層析分離純化后，僅得到純度93.96%的芒果苷純品，總回收率65.64%。本研究從芒果葉中提取芒果苷工藝中，無需進行柱層析分離純化，僅在甲醇提取芒果苷前利用酯提除雜法除去部分雜質（包括大部分膠質），所得的提取液中芒果苷純度高，且濃縮后其黏度較低，提取率較高，后續(xù)僅利用芒果苷在冷熱甲醇中溶解度差異的原理，通過結晶和重結晶手段實現(xiàn)芒果苷的高效分離，大幅度簡化其分離純化工藝，得到純度>98.00%的芒果苷純品，總回收率約66.40%，表明本研究的芒果苷提取分離效率更高。綜上所述，本研究不僅大幅度簡化芒果苷提取分離工藝，降低工藝要求和生產成本，還明顯提高提取分離的效率，可應用于實際生產，但不足的是總回收率偏低，需對工藝條件進一步優(yōu)化，將每個工藝步驟中產生的雜質廢棄物進行回收和重復提取分離，提高提取效率。

4結論

優(yōu)化后的酯提除雜法提取分離芒果苷工藝操作簡便、成本低廉、效率高，可用于芒果苷實際生產。