稻曲病菌薄壁分生孢子產(chǎn)孢平板培養(yǎng)基的篩選

蒲相君 王忠文 楊平 張麗麗 張君成

摘要：【目的】分析平板培養(yǎng)基的組分構(gòu)成對(duì)稻曲病菌薄壁分生孢子形成的影響，為薄壁分生孢子的制備培養(yǎng)提供便捷的技術(shù)手段?！痉椒ā恳?個(gè)常規(guī)稻曲病菌株Uv-34、Uv-105、Uv-110和Uv-111為試驗(yàn)材料，采取常規(guī)的固體培養(yǎng)技術(shù)程序，分別測(cè)試馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）的馬鈴薯含量及蔗糖含量對(duì)薄壁分生孢子形成的影響、在水（非糖）和4種糖（蔗糖、核糖、木糖和山梨糖）與馬鈴薯組配形成的固體培養(yǎng)基（PA、PSA、PRA、PXA和PSoA）上的產(chǎn)孢量、在固體培養(yǎng)基上形成孢子數(shù)量的時(shí)間變化動(dòng)態(tài)及在PA固體培養(yǎng)基上4個(gè)菌株的產(chǎn)孢表現(xiàn)?！窘Y(jié)果】在PSA培養(yǎng)基中，蔗糖含量為10g/L時(shí)產(chǎn)孢量最高（1.69x10⁶個(gè)/mL），馬鈴薯含量以50.0 g/L時(shí)的產(chǎn)孢量最高（1.18x10⁶個(gè)/mL）。在PA、PSA、PRA、PXA和PSoA等平板培養(yǎng)基上，菌株的產(chǎn)孢量分別為6.98x10⁶、4.63x10⁶、11.92x10⁶、0.84x10⁶和0.01x10⁶個(gè)/mL。在15 d的連續(xù)培養(yǎng)中，于PSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5d后產(chǎn)孢量開(kāi)始大幅下降，而在PA和PRA培養(yǎng)基上菌株產(chǎn)孢量基本穩(wěn)定或保持上升趨勢(shì)。在PA培養(yǎng)基上，4個(gè)供試稻曲病菌株均能正常大量產(chǎn)孢?！窘Y(jié)論】稻曲病菌能在含馬鈴薯的常規(guī)固體培養(yǎng)基上產(chǎn)孢；PA是日常制備培養(yǎng)稻曲病菌薄壁分生孢子的簡(jiǎn)單易用培養(yǎng)基；PRA是制備培養(yǎng)薄壁分生孢子的高產(chǎn)培養(yǎng)基。

關(guān)鍵詞：稻曲病菌；薄壁分生孢子；產(chǎn)孢；培養(yǎng)基

0引言

【研究意義】植物病原真菌的繁殖體在病害發(fā)生與流行中發(fā)揮著重要作用，因而在植物病害研究中經(jīng)常使用繁殖體材料來(lái)研究病菌一寄主的互作關(guān)系，以及探索病害的防控途徑。稻曲病是國(guó)內(nèi)外水稻生產(chǎn)的重大病害之一，其病原菌稻曲病菌[Usti-laginoidea virens（cooke）Takahashi]可產(chǎn)生子囊孢子、厚壁分生孢子和薄壁分生孢子3種形態(tài)的繁殖體（張君成等，2003；張俊喜等，2016），這3種形態(tài)孢子均能侵染水稻致病，可用于稻曲病的相關(guān)研究。研究工作使用的孢子材料一般需通過(guò)試驗(yàn)培養(yǎng)等方法獲取，但實(shí)驗(yàn)室內(nèi)培養(yǎng)獲取稻曲病菌子囊孢子尚無(wú)成功先例，培養(yǎng)獲取厚壁分生孢子也存在較大的技術(shù)困難，因而當(dāng)前的相關(guān)研究主要使用薄壁分生孢子（俞咪娜等，2013；Zheng et al，2016；Zheng et.al，2017）。培養(yǎng)獲取病原菌孢子最關(guān)鍵的技術(shù)物質(zhì)是培養(yǎng)基，適宜的培養(yǎng)基能起到事半功倍的效果。因此，探索稻曲病菌薄壁分生孢子制備的適合培養(yǎng)基，可為薄壁分生孢子的制備培養(yǎng)提供可靠便捷的技術(shù)手段，進(jìn)而保證相關(guān)研究工作的順利開(kāi)展?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】有關(guān)稻曲病菌薄壁分生孢子的制備培養(yǎng)，早期有采用液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)方法（陸凡等，1996）和靜止培養(yǎng)方法（王疏等，1998）的報(bào)道，當(dāng)前多數(shù)使用液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)方法（Han et al，2015；王宇秋等，2016；Yu et al，2016），即使開(kāi)展產(chǎn)孢基因研究或致病相關(guān)基因研究，涉及的孢子培養(yǎng)也是采用液體培養(yǎng)基振蕩培養(yǎng)方法（黃磊等，2013；Lu et al，2016）。此外，有研究報(bào)道振蕩培養(yǎng)的某些操作因素與產(chǎn)孢量有關(guān)（時(shí)婷婷等，2015）。至今報(bào)道振蕩培養(yǎng)方法所用的培養(yǎng)基幾乎都是PS（馬鈴薯蔗糖）液體培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基中的主要組分為馬鈴薯。最近有比較各種植物組織組配的培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)孢量的影響報(bào)道，結(jié)果仍是馬鈴薯組織與蔗糖組配的培養(yǎng)液（PS）更適宜薄壁分生孢子的形成（時(shí)婷婷等，2017）?？梢?jiàn)，稻曲病菌薄壁分生孢子制備培養(yǎng)技術(shù)至今仍是采用PS液體培養(yǎng)基的振蕩培養(yǎng)方法，其缺點(diǎn)主要是培養(yǎng)產(chǎn)物含有大量的菌絲體，且培養(yǎng)工作需要配備振蕩培養(yǎng)設(shè)備。許多植物病原菌孢子的制備培養(yǎng)是采用便捷可靠的固體平板培養(yǎng)方法（Ribas et al，2016；Wiseman et al，2016；高楊楊等，2017；Guiiar-ro et al，2017），然而針對(duì)稻曲病菌尚未發(fā)現(xiàn)應(yīng)用固體平板培養(yǎng)方法的報(bào)道。【本研究切入點(diǎn)】筆者在日常工作中發(fā)現(xiàn)，稻曲病菌也能在固體平板培養(yǎng)基上生長(zhǎng)發(fā)育形成薄壁分生孢子，且培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)狀況對(duì)孢子的形成影響較明顯，但哪些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)有利于孢子形成尚不清楚?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】用常規(guī)稻曲病菌菌株材料和常規(guī)的平板培養(yǎng)技術(shù)程序，通過(guò)測(cè)定常規(guī)PSA培養(yǎng)基各組分的含量與稻曲病菌產(chǎn)孢量的關(guān)系、比較蔗糖、核糖、木糖和山梨糖等糖物質(zhì)對(duì)產(chǎn)孢量的影響、觀察稻曲病菌在平板培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢動(dòng)態(tài)等，尋找能取得較高孢子產(chǎn)量的培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)組成，為稻曲病菌薄壁分生孢子的制備培養(yǎng)提供適宜平板培養(yǎng)基。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試常規(guī)稻曲病菌菌株Uv-34、Uv-105、Uv-110和Uv-111，均為廣西大學(xué)植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存的菌株。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1移植用孢子液制備取試管斜面培養(yǎng)的供試菌株，移植少量菌絲團(tuán)人PS液體培養(yǎng)基（馬鈴薯100g、蔗糖10g和蒸餾水1000mL），置于搖床進(jìn)行150r/min、28℃培養(yǎng)7 d，然后用1層滅菌紗布過(guò)濾培養(yǎng)產(chǎn)物混合液，除去菌絲體，將僅含孢子的液體離心沉淀，用無(wú)菌水將沉淀孢子懸浮洗滌1次，重新離心沉淀，再用無(wú)菌水將沉淀孢子懸浮和稀釋，并用血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行計(jì)數(shù)，再用無(wú)菌水調(diào)配成10⁶個(gè)/mL的孢子液，分裝于5mL冷凍管保存于25℃恒溫箱備用。

1.2.2 PSA培養(yǎng)基蔗糖含量對(duì)產(chǎn)孢量的影響用馬鈴薯煮出液、蔗糖、瓊脂和蒸餾水配制成背景基質(zhì)為馬鈴薯100.0g、瓊脂20g、蒸餾水1000 mL，而蔗糖含量分別為5.0、10.0、20.0和40.0g/L的培養(yǎng)基，常規(guī)高溫高壓滅菌后倒培養(yǎng)平板，植入菌株Uv-111貯備孢子液50μL進(jìn)行產(chǎn)孢培養(yǎng)。

1.2.3PSA培養(yǎng)基馬鈴薯含量對(duì)產(chǎn)孢量的影響用馬鈴薯煮出液、蔗糖、瓊脂和蒸餾水配制成背景基質(zhì)為蔗糖10 g、瓊脂20 g、蒸餾水1000 mL，分別含馬鈴薯50.0、100.0、200.0和400.0 g/L煮出液的培養(yǎng)基，常規(guī)高溫高壓滅菌后倒培養(yǎng)平板，植入菌株Uv-111貯備孢子液50μL進(jìn)行產(chǎn)孢培養(yǎng)。

1.2.4不同糖化合物培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)孢量的影響先用蒸餾水將糖化合物配成100g/L的糖溶液，用細(xì)菌過(guò)濾器過(guò)濾滅菌，再將滅菌糖溶液分別與經(jīng)高溫高壓滅菌的馬鈴薯瓊脂基質(zhì)混合，形成背景均是馬鈴薯瓊脂但糖化合物不同的培養(yǎng)基，配比為糖化合物10.0g、馬鈴薯100.0g、瓊脂20g、蒸餾水1000mL，其中糖化合物分別為水（非糖）、蔗糖、核糖、木糖和山梨糖，對(duì)應(yīng)形成的培養(yǎng)基分別為馬鈴薯瓊脂（PA）、馬鈴薯蔗糖瓊脂（PSA）、馬鈴薯核糖瓊脂（PRA）、馬鈴薯木糖瓊脂（PXA）和馬鈴薯山梨糖瓊脂（PSoA），倒培養(yǎng)平板后植入菌株Uv-111貯備孢子液35μL進(jìn)行產(chǎn)孢培養(yǎng)。

1.2.5孢子產(chǎn)量與培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)的關(guān)系按1.2.4方法操作配備背景均為馬鈴薯瓊脂，糖化合物分別為水（非糖）、蔗糖和核糖的培養(yǎng)基，倒培養(yǎng)平板后植入菌株Uv-111貯備孢子液35μL進(jìn)行產(chǎn)孢培養(yǎng)，分別在移植培養(yǎng)5、10和15d后，每種糖培養(yǎng)基處理各取出重復(fù)，測(cè)定新一代孢子產(chǎn)量。

1.2.6不同菌株在PA培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢表現(xiàn)用馬鈴薯100.0、瓊脂20g、蒸餾水1000 mL配備PA培養(yǎng)基，倒培養(yǎng)平板后，分別移植入菌株Uv-34、Uv-105、Uv-110和Uv-111的孢子液50μL進(jìn)行產(chǎn)孢培養(yǎng)。各菌株移植用的孢子液的貯備時(shí)長(zhǎng)不等同。

1.2.7產(chǎn)孢培養(yǎng)與后代孢子數(shù)量測(cè)定所有培養(yǎng)基均用9cm培養(yǎng)皿倒平板，所有測(cè)試處理均設(shè)3次重復(fù)，植入相應(yīng)的貯備孢子液后，用T形玻棒將孢子液均勻涂抹于平板面上，然后將測(cè)試平板轉(zhuǎn)置28℃的恒溫培養(yǎng)箱，除測(cè)試項(xiàng)有說(shuō)明外，均為培養(yǎng)5d后取出測(cè)定新一代孢子產(chǎn)量。每皿平板加入15mL蒸餾水，用小毛刷刷下平板表面孢子，用血球計(jì)數(shù)板檢測(cè)所得孢子液的孢子數(shù)量，每重復(fù)皿觀察80個(gè)中方格的孢子數(shù)，并換算成每毫升孢子液的孢子數(shù)量。

2結(jié)果與分析

2.1 PSA培養(yǎng)基蔗糖含量對(duì)產(chǎn)孢量的影響

在馬鈴薯瓊脂背景中添加不同含量的蔗糖，形成4個(gè)蔗糖含量處理的培養(yǎng)基，移植入菌株Uv-111進(jìn)行產(chǎn)孢培養(yǎng)，結(jié)果（圖1）發(fā)現(xiàn)蔗糖含量為10.0g/L的培養(yǎng)基產(chǎn)孢量最高，為1.69X10⁶個(gè)/mL，顯著高于蔗糖含量為5.0和40.0g/L的培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量（P<0.05，下同），但與蔗糖含量為20.0g/L的培養(yǎng)基產(chǎn)孢量差異不顯著（P>0.05，下同）。表明PSA培養(yǎng)基的蔗糖含量對(duì)稻曲病菌薄壁分生孢子產(chǎn)量影響較明顯。

2.2PSA培養(yǎng)基馬鈴薯含量對(duì)產(chǎn)孢量的影響

用馬鈴薯與背景相同的蔗糖瓊脂培養(yǎng)基組配，形成不同馬鈴薯含量的培養(yǎng)基，移植入菌株Uv-111進(jìn)行產(chǎn)孢培養(yǎng)，結(jié)果（圖2）發(fā)現(xiàn)馬鈴薯含量為50.0g/L的培養(yǎng)基產(chǎn)孢量最高，為1.18X10⁶個(gè)/mL，顯著高于馬鈴薯含量為200.0和400.0g/L培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量，但與馬鈴薯含量為100.0g/L的培養(yǎng)基產(chǎn)孢量差異不顯著。表明PSA培養(yǎng)基中馬鈴薯含量對(duì)稻曲病菌薄壁分生孢子產(chǎn)量影響較明顯，且在測(cè)試范圍內(nèi)馬鈴薯含量越少越好。

2.3不同糖化合物培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)孢量的影響

在馬鈴薯瓊脂背景中添加不同的糖組分，形成5種處理培養(yǎng)基，菌株Uv-111在5種處理培養(yǎng)基中均能生長(zhǎng)形成小菌落，但小菌落的產(chǎn)孢量表現(xiàn)差異較明顯。由圖3可知，添加蔗糖的培養(yǎng)基（PSA）產(chǎn)孢量為4.63x10⁶個(gè)/mL，添加核糖的培養(yǎng)基（PRA）產(chǎn)孢量（11.92x10⁶個(gè)/mL）遠(yuǎn)高于添加蔗糖的培養(yǎng)基產(chǎn)孢量，添加山梨糖的培養(yǎng)基（PSoA）產(chǎn)孢量非常少（0.01x10⁶個(gè)/mL），而沒(méi)有添加任何糖的PA培養(yǎng)基產(chǎn)孢量（6.98x10⁶個(gè)/mL）顯著高于蔗糖處理；以水處理作參照，含核糖的培養(yǎng)基能大幅增加產(chǎn)孢量，而含山梨糖、木糖和蔗糖的培養(yǎng)基不利于孢子形成。表明不同糖化合物對(duì)稻曲病菌薄壁分生孢子的形成發(fā)育有重大影響。

2.4孢子產(chǎn)量與培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)的關(guān)系

在糖化合物為水（非糖）、蔗糖和核糖的培養(yǎng)基上，隨培養(yǎng)時(shí)長(zhǎng)的增加，菌株Uv-111的產(chǎn)孢量變化存在明顯差異。在含蔗糖培養(yǎng)基（PSA）上，培養(yǎng)5 d的產(chǎn)孢量為4.63x10⁶個(gè)/mL，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，產(chǎn)孢量大幅下降，10d后產(chǎn)孢量只有1.33x10⁶個(gè)/mL，顯著低于培養(yǎng)5d時(shí)的產(chǎn)孢量；而在含核糖（PRA）或水（PA）的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)5～15 d的產(chǎn)孢量基本維持不變，或稍有上升的趨勢(shì)（圖4）。觀察相應(yīng)的產(chǎn)孢菌落外觀，在含蔗糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)10d后可見(jiàn)濃密的非產(chǎn)孢菌絲，而在含核糖或水處理的培養(yǎng)基上培養(yǎng)10～15d后未發(fā)現(xiàn)非產(chǎn)孢菌絲，表明在不同的糖營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上稻曲病菌的產(chǎn)孢習(xí)性不同。

2.5不同菌株在馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢表現(xiàn)

在PA培養(yǎng)基上，4個(gè)供試菌株均能形成大量的后代孢子，但菌株問(wèn)的產(chǎn)孢量存在明顯差異，其中以UV-111的產(chǎn)孢量最多，顯著高于其他3個(gè)菌株的產(chǎn)孢量（圖5）。菌株間產(chǎn)孢量存在差異的原因：一是菌株本身的產(chǎn)孢習(xí)性存在差異；二是初始移植菌體（活性孢子數(shù)量）存在差異。

3討論

PSA和PS同屬植物病理學(xué)日常培養(yǎng)的常用培養(yǎng)基，前者為固態(tài)，后者為液態(tài)，兩者主要組分均為馬鈴薯和蔗糖，其常規(guī)用量是馬鈴薯200 g/L、蔗糖20g/L。當(dāng)前稻曲病菌薄壁分生孢子制備慣用的液體培養(yǎng)均為常規(guī)用量的Ps培養(yǎng)基（俞咪娜等，2013；Han et al，2015；Zheng et al，2017），未見(jiàn)其2個(gè)主要組分與產(chǎn)孢數(shù)量關(guān)系的研究報(bào)道。本研究測(cè)定PSA組分對(duì)稻曲病菌產(chǎn)孢的影響，發(fā)現(xiàn)組分馬鈴薯為50g/L、蔗糖為10g/L的平板培養(yǎng)基稻曲病菌形成的孢子數(shù)量最多，說(shuō)明該培養(yǎng)基的常規(guī)用量并不是稻曲病菌產(chǎn)孢的最適用量，至少不是平板培養(yǎng)基的最適用量。

當(dāng)前稻曲病菌薄壁分生孢子制備多習(xí)慣應(yīng)用蔗糖組配的PS培養(yǎng)基，未見(jiàn)有關(guān)研究其他糖物質(zhì)對(duì)產(chǎn)孢數(shù)量的影響報(bào)道。本研究測(cè)試發(fā)現(xiàn)，在核糖組配的培養(yǎng)基上，稻曲病菌形成的孢子數(shù)量遠(yuǎn)高于在蔗糖組配的PSA培養(yǎng)基，表明PRA培養(yǎng)基更適合稻曲病菌產(chǎn)孢。試驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，沒(méi)有額外添加糖物質(zhì)的PA培養(yǎng)基比常規(guī)PSA培養(yǎng)基更適合菌株產(chǎn)孢，與當(dāng)前慣用的液體培養(yǎng)的表現(xiàn)不一致，在液體培養(yǎng)技術(shù)中，菌株在PS培養(yǎng)液的產(chǎn)孢量遠(yuǎn)高于沒(méi)有添加蔗糖的馬鈴薯培養(yǎng)液的產(chǎn)孢量（時(shí)婷婷等，2017）。

跟蹤產(chǎn)孢過(guò)程發(fā)現(xiàn)，在常規(guī)的PSA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5d后，稻曲病菌的產(chǎn)孢量呈大幅下降趨勢(shì)，意味著在實(shí)際工作中應(yīng)考慮培養(yǎng)時(shí)間問(wèn)題，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)不利于獲得高產(chǎn)的制備效果。而在PA培養(yǎng)基和PRA培養(yǎng)基上，稻曲病菌產(chǎn)孢量在15d內(nèi)基本保持平穩(wěn)或增長(zhǎng)的趨勢(shì)，這種表現(xiàn)有利于實(shí)際工作應(yīng)用時(shí)不必特別注意培養(yǎng)的時(shí)效問(wèn)題，使得孢子的準(zhǔn)備工作與需要使用孢子材料的研究工作環(huán)節(jié)比較容易銜接。

固體平板培養(yǎng)是普通實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)技術(shù)，其操作性和便捷性比液體培養(yǎng)優(yōu)越，長(zhǎng)期以來(lái)稻曲病菌一直使用液體培養(yǎng)技術(shù)制備培養(yǎng)薄壁分生孢子。本研究結(jié)果表明，稻曲病菌在平板培養(yǎng)基上能形成大量孢子，可為稻曲病菌孢子制備培養(yǎng)提供一種更為便捷的技術(shù)。特別明顯的是PA培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基是日常使用的PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂）或PSA培養(yǎng)基的基本組分，其容易配制且使用方便；同時(shí)，在PA培養(yǎng)基上稻曲病菌的產(chǎn)孢量比PSA培養(yǎng)基上的更高、更穩(wěn)定，經(jīng)測(cè)試多個(gè)菌株均能正常產(chǎn)孢，綜合技術(shù)操作性及產(chǎn)孢表現(xiàn)，可認(rèn)為PA是稻曲病菌薄壁分生孢子制備培養(yǎng)簡(jiǎn)單易用的理想培養(yǎng)基。而PRA培養(yǎng)基是本研究測(cè)試產(chǎn)孢量最高的培養(yǎng)基，可作為稻曲病菌產(chǎn)孢培養(yǎng)的高產(chǎn)培養(yǎng)基，有利于產(chǎn)孢量較低的菌株的孢子制備培養(yǎng)。

需要說(shuō)明的是，核糖、木糖和山梨糖的高溫滅菌培養(yǎng)基能強(qiáng)烈抑制稻曲病菌薄壁分生孢子的萌發(fā)（張君成等，2009），筆者研究發(fā)現(xiàn)這3種糖化合物本身對(duì)孢子萌發(fā)并無(wú)抑制作用，孢子在這3種糖的非高溫滅菌培養(yǎng)基上可正常萌發(fā)生長(zhǎng)并形成小菌落，產(chǎn)生抑制作用是由于高溫對(duì)糖作用的后果，因此實(shí)際使用馬鈴薯核糖培養(yǎng)基時(shí)核糖組分不能采取高溫滅菌。

4結(jié)論

稻曲病菌在含馬鈴薯的常規(guī)固體平板培養(yǎng)基上能形成大量的薄壁分生孢子；馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基（PA）是日常制備培養(yǎng)稻曲病菌薄壁分生孢子的簡(jiǎn)單易用培養(yǎng)基；馬鈴薯核糖瓊脂培養(yǎng)基（PRA）是制備培養(yǎng)稻曲病菌薄壁分生孢子的高產(chǎn)培養(yǎng)基。