9種夾竹桃科和大戟科植物抗菌和抗氧化活性測定

張偉豪 翁道玥 宋慧云 崔澤華 孫堅 吳玉婷 單體江

摘要：【目的】篩選具有抗菌和抗氧化活性的植物次生代謝產(chǎn)物，為夾竹桃科和大戟科植物資源的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。【方法】以華南地區(qū)常見的5種夾竹桃科植物和4種大戟科植物為研究對象，采用甲醇冷浸提取和乙酸乙酯萃取方法制備植物提取物，以薄層層析（TLC）一生物自顯影法測定9種植物提取物的體外抗細菌和抗氧化活性，通過斑點及斑點的遷移率（R_f）初步評價樣品中化合物的極性和活性，根據(jù)抑菌斑大小評價化合物的活性?！窘Y(jié)果】除銀柴外，其余8種植物提取物對供試細菌均表現(xiàn)出一定的抑制活性，其中紅背桂、紅背山麻桿和蝴蝶果對7種供試細菌均表現(xiàn)出較強的抑菌活性，且紅背桂和蝴蝶果提取物的抑菌斑直徑超過10mm，R_f集中在0～0.13，說明活性化合物極性偏大。除夾竹桃科的羊角坳外，其余8種植物提取物均表現(xiàn)出一定的抗氧化活性，其中紅背山麻桿的抗氧化活性最強，風(fēng)為0～0.52，抗氧化斑直徑為5-10mm。【結(jié)論】TLC-生物自顯影法能夠快速檢測和篩選具有抗菌和抗氧化活性的植物提取物。紅背山麻桿、紅背桂和蝴蝶果可作為抗細菌的候選植物資源利用，紅背山麻桿可同時作為優(yōu)良的抗氧化植物資源利用。

關(guān)鍵詞：夾竹桃科；大戟科；抗菌活性；抗氧化活性；薄層層析（TLC）一生物自顯影法

0引言

【研究意義】自然界中植物資源豐富，從植物中尋找生物活性物質(zhì)一直是國內(nèi)外研究的重點，也是藥物研發(fā)的最佳來源。植物的各個部位如葉、樹皮和花等均含有豐富的次生代謝產(chǎn)物，部分次生代謝產(chǎn)物具有優(yōu)良的抗菌活性，尤其對一些耐藥性細菌具有較強的拮抗活性，如生物堿類、糖苷類、萜類、黃酮類、鞣酸類、醌類和香豆素類等（Momin et al，2012；Srivastava et al，2014；Elisha et al，2017）。夾竹桃科和大戟科植物化學(xué)成分豐富，具有廣泛的藥理活性，若能從中篩選出具有抗細菌和抗氧化的活性成分，可為新型生物源藥物的開發(fā)及夾竹桃科和大戟科植物資源的開發(fā)和利用打下基礎(chǔ)。【前人研究進展】目前，針對夾竹桃科和大戟科植物的研究主要集中于醫(yī)學(xué)和藥理學(xué)方面。夾竹桃科植物含有豐富的三萜類、生物堿類和油脂類化學(xué)成分，夾竹桃科植物中的強心苷類化合物具有強心、毒性、抗腫瘤、作用中樞神經(jīng)、利尿、滅螺等活性（姚元成等，2013；苗智等，2016）；大戟科植物大都含有具生理活性的二萜類、酯類和生物堿類成分（李同琴等，2003）；此外，夾竹桃科和大戟科植物具有很好的殺蟲和驅(qū)蚊活性（Meisner et al，1981；Rahuman et al，2008）。夾竹桃科植物羅布麻原麻揮發(fā)油對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和大腸桿菌均具有較強的抑菌活性（Li et al，2012），從其乙醇提取物中分離鑒定得到槲皮素、山奈酚、異槲皮素和木犀草素等11種化合物（李明華，2011），其中的黃酮類化合物具有較強的抗氧化活性，而酚羥基是黃酮類化合物抗氧化作用的主要活性基因（陶笑等，2017）。劉韶松等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，夾竹桃科植物非洲馬鈴果種子總生物堿對3種癌細胞表現(xiàn)出很強的抑制活性，且以正丁醇層提取物的抗氧化活性最強，IC₅₀為0.268±0.002 mg/mL（DPPH法）。陳芳芳等（2017）研究了兩種大戟科植物小返魂和葉下株不同層析層的抗氧化活性，結(jié)果表明不同層析層的抗氧化活性與總多酚含量呈正相關(guān)。在本研究選取的9種植物中，對夾竹桃、雞蛋花和紅背山麻桿的研究相對較多，前人有對夾竹桃和枝葉化學(xué)成分分析和抗菌殺蟲活性的研究（王萬賢等，2006），以及雞蛋花不同部位提取物對各種致病菌的抑菌活性（Baghel et al，2010；高則睿等，2012），對于紅背山麻桿則進行了成分分析，并從葉中分離得到具有強氧化活性的奎寧酸類化合物（黃永林等，2015a，2015b）；但針對其他6種植物的研究較少，如羊角拗根的甲醇洗脫物具有一定的體外抑菌活性（程紋等，2013）；紅背桂、酸葉膠藤和蝴蝶果3種植物的化學(xué)成分雖已闡明（朱向東等，2011；李東，2012；陳兵祥和王小玲，2015），但對于其生物活性報道較少；銀柴目前已報道的研究主要集中在中藥應(yīng)用方面；Khan等（2003）發(fā)現(xiàn)糖膠樹的葉、莖和根皮提取物對革蘭氏陽、陰性細菌均有抑制作用；本課題組也曾對糖膠樹花次生代謝產(chǎn)物及其抗細菌活性進行研究（張偉豪等，2017），但抗氧化活性未曾報道。【本研究切入點】目前對夾竹桃科和大戟科植物抗細菌和抗氧化活性尤其是對植物病原菌抑制活性的研究報道較少?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以華南地區(qū)常見的5種夾竹桃科植物和4種大戟科植物為研究對象，采用薄層層析（TLC）一生物自顯影法測定9種植物提取物的體外抗細菌和抗氧化活性，篩選具有開發(fā)和利用價值的植物提取物，為抗細菌和抗氧化活性化合物的分離提供候選植物。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試植物：供試植物詳見表1，采自廣東省廣州市天河區(qū)華南農(nóng)業(yè)大學(xué)（華農(nóng)）和廣州市火爐山森林公園（火爐山），標(biāo)本由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院鄭明軒老師鑒定。

供試細菌：黃瓜角斑病菌、大腸桿菌、根癌土壤桿菌、番茄瘡痂病菌、桉樹青枯病菌、枯草芽孢桿菌和溶血葡萄球菌，均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院森林保護教研室提供。

儀器和試劑：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化器械株式會社），電子稱（美國雙杰電子科技有限公司），三洋高壓滅菌鍋（松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社），三用紫外儀（上海安亭科學(xué)儀器廠），海爾醫(yī)用冷藏箱（海爾生物醫(yī)療有限公司），超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司），移液器（Eppendorf生命科技公司）。甲醇、乙酸乙酯、二氯甲烷和無水乙醇均為分析純（天津市富宇精細化工有限公司），硫酸鏈霉素（美國Sigrna公司），LB培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司），噻唑藍[3-（4，5-Dimethylthiazol-2-y1）-2，5-diphenyl tetrazoli-um bromide，MTT，美國Sigma-Aldrich集團公司]，2，2'-二.苯基-1-硝基苯肼（2，2'-Diphenyl-1-picryhydra-zyl，DPPH，美國Sigma-Aldricb集團公司），薄層層析硅膠（青島海洋化工廠分廠）。

1.2植物提取物制備

采用甲醇冷浸提取法制備植物提取物：將采集的植物材料剪碎后分別裝入三角瓶中，加入甲醇冷浸提取3次，每次7d。濃縮提取液，以水混懸后用等體積的乙酸乙酯萃取3次，濃縮乙酸乙酯萃取液即得到各植物的乙酸乙酯層提取物，將其轉(zhuǎn)入西林瓶中，4℃冷藏備用。

1.3抗細菌活性測定

各植物提取物對供試細菌抗菌活性的測定采用伍慧雄等（2016）的TLC-MTT-生物自顯影法，通過薄層層析板上抗菌斑點遷移率（R_t）初步評價樣品中抗菌化合物的極性，根據(jù)抗菌斑點大小初步評價化合物的活性。薄層層析后在薄層板的一側(cè)原點處點5μL硫酸鏈霉素（0.2 mg/mL）作陽性對照，所有試驗相同條件重復(fù)3次，取平均值。

1.4抗氧化活性測定

采用TLC-DPPH-生物自顯影法測定各植物提取物的抗氧化活性（古扎力努爾·艾爾肯等，2016），根據(jù)本研究中化合物性質(zhì)薄層層析條件略有改進。使用二氯甲烷和甲醇（v/v=10：1）為展開劑進行薄層層析，待溶劑揮發(fā)后，噴灑0.1%DPPH乙醇溶液顯色，1-2 min后即可觀察。具有抗氧化活性的區(qū)域呈熒光黃色，不具有抗氧化活性的區(qū)域為原色。通過抗氧化活性化合物的R_t