植物源食品中葉酸的生物合成與調(diào)控及其 提取與檢測技術(shù)研究進(jìn)展

任文芳,楊潤強(qiáng),顧振新,王 沛

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院,江蘇南京 210095)

葉酸是指四氫葉酸(THF)及其衍生物,為一種水溶性B族維生素,是生物體的必需成分[1]。葉酸作為一碳代謝中一碳(C1)轉(zhuǎn)移反應(yīng)的輔因子,參與核苷酸生物合成,氨基酸代謝(如,絲氨酸轉(zhuǎn)換為甘氨酸、組氨酸的分解)和甲基化循環(huán)(如,同型半胱氨酸通過再甲基化轉(zhuǎn)變?yōu)榧琢虬彼?,其中在甲基化循環(huán)時(shí)提供了許多甲基及甲基化反應(yīng)。因此,葉酸及其合成通路對細(xì)胞代謝至關(guān)重要。人體自身無合成葉酸的能力,只能通過飲食攝取。為滿足正常生命活動(dòng)的需要,成年人每天應(yīng)補(bǔ)充400 μg的葉酸,而孕婦每天應(yīng)補(bǔ)充600 μg[2]。業(yè)已證實(shí)葉酸攝入不足則引發(fā)巨幼紅細(xì)胞貧血和胎兒神經(jīng)管發(fā)育缺陷(NTD)[3],且低水平的葉酸攝入與老年癡呆癥、心血管疾病和多種癌癥的發(fā)生密切相關(guān)[4]。因此,葉酸對人體正常生命活動(dòng)十分重要。

為緩解世界范圍內(nèi)普遍存在著的人體葉酸缺乏狀況,提高植物性食品原料中葉酸的含量具有現(xiàn)實(shí)意義。近年來,植物中葉酸生物合成途徑研究,以及通過基因工程和發(fā)芽調(diào)控手段提高葉酸含量已成為研究熱點(diǎn),隨之,植物源食品中葉酸的提取與檢測也要求更高的準(zhǔn)確度及精確度。本文綜述了植物源食品中葉酸的類型與結(jié)構(gòu)、葉酸合成途徑及相關(guān)酶、葉酸代謝調(diào)控、發(fā)芽富集技術(shù)、葉酸提取與檢測技術(shù),以期為開發(fā)富含葉酸的健康食品提供理論依據(jù)。

1 葉酸類型及其結(jié)構(gòu)

葉酸分子由2-氨基-4-羥基蝶啶(蝶呤)、對氨基苯甲酸(pABA)和谷氨酸[5]三部分組成(圖1)[10]。葉酸分子存在多種形式,

圖1 葉酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structure of folate

理論上達(dá)150種之多[6],在植物和動(dòng)物組織中僅發(fā)現(xiàn)不到50種。蝶呤環(huán)有完全氧化及部分還原、完全還原形式[1],各種氧化水平的C1基團(tuán)(甲?；喖谆?、甲基等)可以連接于蝶呤的N-5位置或pABA的N-10位置,或是連接在二者之間(表1)[7],產(chǎn)生的C1取代的葉酸經(jīng)酶促反應(yīng)可以相互轉(zhuǎn)化,并且可用作各種反應(yīng)的C1基團(tuán)供體。

表1 葉酸常見種類Table 1 The common species of folate

植物體內(nèi)谷氨酸尾數(shù)從1～8個(gè)不等[2],谷氨酸殘基通過γ位通常連接到第一個(gè)谷氨酸上。其中,單谷氨酸尾形式的葉酸是葉酸轉(zhuǎn)運(yùn)體所偏好的形式,多谷氨酸尾形式的葉酸則是葉酸依賴型酶所偏好的形式[8]。此外,由于尾部促進(jìn)葉酸與酶的結(jié)合,而葉酸對于氧化裂解在結(jié)合時(shí)比在游離時(shí)更穩(wěn)定,所以多聚谷氨酰化可以直接增強(qiáng)葉酸穩(wěn)定性[9]。

2 葉酸合成途徑及相關(guān)酶

葉酸存在于植物細(xì)胞的液泡、細(xì)胞質(zhì)、線粒體和質(zhì)體中[11],但葉酸僅在線粒體中合成,蝶呤和pABA前體則分別在細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中形成(圖2)[12]。

圖2 植物中葉酸的合成Fig.2 The biosynthesis of folate in plant

2.1 蝶呤合成

尿苷三磷酸(GTP)在GTP環(huán)化水解酶I(GTP cyclohydrolase I,GCHI)作用下轉(zhuǎn)化為二氫新蝶呤三磷酸,該反應(yīng)是喋呤合成的第一步,也是其合成的限速反應(yīng)。在植物體中,GCHI是具有兩個(gè)串聯(lián)結(jié)構(gòu)域的同二聚體,其中每個(gè)結(jié)構(gòu)域類似于典型的GCHI單體[13-14],然后GCHI催化產(chǎn)生的二氫新蝶呤三磷酸產(chǎn)物在兩個(gè)步驟中被去磷酸化形成二氫蝶呤,后又被二氫蝶呤醛縮酶水解成6-羥甲基二氫蝶呤(HMDHP)和乙醇醛[15]。

2.2 pABA合成

pABA在葉綠體中合成,并在線粒體中作為前體合成葉酸。pABA合成的前體物質(zhì)是分支酸,該物質(zhì)只能在質(zhì)體中合成,是莽草酸途徑的重要中間代謝產(chǎn)物。在氨基脫氧分支酸合成酶(aminodeoxychorismate synthase,ADCS)和氨基脫氧分支酸裂解酶(aminodeoxychorismate lyase,ADCL)催化下,分支酸生成pABA。pABA可在胞質(zhì)中葡萄糖醛轉(zhuǎn)移酶的催化下可逆地轉(zhuǎn)化成其葡萄糖脂,且植物中全部或大多數(shù)pABA發(fā)生了酯化反應(yīng),以致酯化形式的pABA通常比游離的pABA多,通過合成反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)或酯酶作用,酯可以再轉(zhuǎn)化為pABA[16]。盡管這一酯化反應(yīng)的生理作用尚不清楚,但是植物特有,可能為pABA提供了一種貯存形式,也可能是pABA在植物細(xì)胞中的特殊運(yùn)輸形式[12]。

2.3 葉酸的生物合成

合成的喋呤復(fù)合物HMDHP和pABA前體被轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體中,其中HMDHP首先在羥甲基二氫喋呤焦磷酸化酶的作用下通過焦磷酸化活化,然后經(jīng)二氫蝶酸合成酶催化偶聯(lián)到pABA以產(chǎn)生二氫蝶酸。二氫蝶酸進(jìn)一步在二氫葉酸合成酶(dihydrofolate synthase,DHFS)催化下形成單谷氨酸二氫葉酸。二氫葉酸還原酶(dihydrofolate reductase,DHFR)在煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)協(xié)助下將二氫葉酸還原為單谷氨酸四氫葉酸,最后通過葉酰多谷氨酸合成酶(folypolyglutamate synthase,FPGS)的作用與谷氨酸結(jié)合,合成多谷氨酰四氫葉酸。其中,羥甲基二氫喋呤焦磷酸化酶和二氫蝶酸合成酶是植物中單個(gè)雙功能蛋白的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域[17]。DHFS是特殊的植物葉酸合成酶,其功能已經(jīng)由突變體研究確定,編碼DHFS的擬南芥基因的破壞會(huì)導(dǎo)致葉酸缺乏,并且有胚胎致死效應(yīng)[18]。

3 葉酸代謝調(diào)控

植物性食品原料,如大豆、水稻、番茄中含有微量的葉酸,可以通過基因工程、種子萌發(fā)等方法使葉酸得以富集,以此提高植物源食品的營養(yǎng)與保健價(jià)值。

3.1 基因工程

利用基因工程手段可有效地增加植物中的葉酸。目前已在大豆、水稻、番茄等植物中導(dǎo)入外源編碼的GCHI、ADCS等基因,葉酸富集效果顯著[19]。

3.1.1 過表達(dá)GCHI 在番茄[20]和擬南芥[21]]的研究中,使用非植物基因(基于哺乳動(dòng)物或細(xì)菌基因)過表達(dá)葉酸合成途徑中蝶啶分支的第一個(gè)酶,即GCHI,該酶無反饋抑制,轉(zhuǎn)基因番茄和擬南芥中的蝶啶水平分別是野生型對照組的140和1250倍;然而,葉酸含量僅分別是野生型對照組的2和4倍,說明僅過表達(dá)一個(gè)分支的酶只是使該途徑產(chǎn)物大量積累,并不能使葉酸產(chǎn)量大幅增加。當(dāng)增加外源性pABA到過表達(dá)GCHI的轉(zhuǎn)基因番茄和擬南芥中,葉酸含量則在此基礎(chǔ)上增加2.5～10倍。此結(jié)果不僅指出增加葉酸前體物質(zhì)—蝶呤和pABA的必要性,同時(shí)也表明在植物細(xì)胞內(nèi)提高葉酸具有較大的生物潛力。

3.1.2 聯(lián)合過表達(dá)GCHI與ADCS 在番茄[22]中過表達(dá)與pABA分支途徑中的第一個(gè)酶-ADCS的相關(guān)基因,與野生型相比較,轉(zhuǎn)基因果實(shí)中含有約19倍的pABA,葉酸水平?jīng)]有增加,然而通過雜交將pABA過量產(chǎn)生性狀與蝶呤過量產(chǎn)生性狀相結(jié)合,得到的雙轉(zhuǎn)基因果實(shí)中葉酸含量比對照多19倍,達(dá)到840 μg/100 g,完全滿足一個(gè)成人的日常需要量。但是,這也導(dǎo)致了高劑量的蝶呤和pABA,約為野生型的20倍。雖然轉(zhuǎn)基因番茄中高pABA水平對人體健康無害,但蝶呤的作用并不清楚[23]。

在水稻胚乳單個(gè)遺傳基因組上的強(qiáng)特異性啟動(dòng)子控制下,擬南芥中編碼GCHI和ADCS的基因得到過表達(dá),可實(shí)現(xiàn)葉酸的生物強(qiáng)化[24]。選用可能存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)的植物GCHI,可避免非理想型中間體的高積累。與野生型相比,過表達(dá)擬南芥基因的轉(zhuǎn)基因水稻葉酸含量高達(dá)100倍,且生物合成中間體—蝶呤和pABA的水平顯著低于轉(zhuǎn)基因番茄。在強(qiáng)化葉酸的番茄和水稻中,葉酸:pABA:蝶呤的摩爾比分別為1∶2.5∶0.75和1∶0.5∶0.013[25],說明在強(qiáng)化水稻中沒有像在強(qiáng)化番茄中高劑量的中間產(chǎn)物的積累。因此,植物GCHI的使用可能保留了其固有的負(fù)反饋調(diào)節(jié),而與植物ADCS聯(lián)用,可使酶活趨向于平衡,能獲得蝶呤和pABA的最佳通量。

在雙子葉植物(番茄)和單子葉植物(水稻)進(jìn)行的葉酸生物強(qiáng)化實(shí)驗(yàn)證明同時(shí)增強(qiáng)蝶呤和pABA分支可能適用于其他植物強(qiáng)化葉酸。

3.2 發(fā)芽調(diào)控

種子萌發(fā)后,生命代謝活動(dòng)開始,植物體內(nèi)大量酶原被激活,其內(nèi)部發(fā)生一系列生理生化變化,如在豆類植物中,脂類物質(zhì)在酶的作用下被分解成甘油和脂肪酸,最后生成能夠被人體吸收的糖類;蛋白質(zhì)水解為多肽和氨基酸[26],這有利于人體吸收;維生素[27]、γ-氨基丁酸[28]、異黃酮[29]等生理活性成分含量相應(yīng)提高。因此,芽類食品的保健功能在食品行業(yè)獨(dú)樹一幟,頗受人們歡迎。

植物種子在發(fā)芽后,葉酸含量明顯增加。據(jù)Koehler等[30]的研究發(fā)現(xiàn),小麥在20 ℃下發(fā)芽102 h后,每100 g干物質(zhì)中增加了200 μg葉酸,比未發(fā)芽者增加了3.6倍;100 g干麥芽含有每日建議攝入葉酸量(400 μg)的50%。Hefni等[31]發(fā)現(xiàn)小麥發(fā)芽4 d后,其葉酸含量是原來的4倍,黑麥?zhǔn)窃瓉淼?倍,說明發(fā)芽對黑麥葉酸含量影響更為顯著。黑麥比小麥、大麥和燕麥等其他谷物含有更多的葉酸[32]。Kariluot[33]研究了發(fā)芽溫度對黑麥中葉酸的影響,發(fā)現(xiàn)在一定溫度范圍內(nèi),葉酸含量隨發(fā)芽溫度升高而升高,提示合適的發(fā)芽條件有利于植物富集葉酸。Shohag等[34]的研究結(jié)果表明,發(fā)芽對2個(gè)大豆品種及2個(gè)綠豆品種葉酸含量的差異是由遺傳因素決定的;各品種的葉酸含量在發(fā)芽4 d時(shí)達(dá)到最大值,之后下降。由此看來,高葉酸濃度僅出現(xiàn)在發(fā)芽的早期階段。Hefni等[35]研究了蠶豆和鷹嘴豆在發(fā)芽期間的葉酸含量變化,發(fā)現(xiàn)浸泡后葉酸含量下降,而發(fā)芽4 d后葉酸增加2.5倍,且葉酸總量的增加主要來源于還原形式葉酸含量的增加,其余形式的葉酸未見增長。谷物及豆類在發(fā)芽期間對甲基(一碳單位)的需求增加從而使葉酸合成加快[36]。從這些研究結(jié)果中我們不難發(fā)現(xiàn),調(diào)控發(fā)芽條件是植物富集葉酸的有效方式,且發(fā)芽富集葉酸的效果顯著,方法簡便易行,在實(shí)際生產(chǎn)中具有較大的應(yīng)用潛力。

3.3 其他調(diào)控方法

除基因工程、發(fā)芽調(diào)控等手段提高植物中葉酸含量外,還可從認(rèn)識葉酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、增強(qiáng)葉酸穩(wěn)定性、加強(qiáng)葉酸補(bǔ)救途徑等方面入手[10]。

認(rèn)識和鑒定葉酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,可將葉酸合成前體物質(zhì)高效率地轉(zhuǎn)入線粒體中,以及促進(jìn)葉酸在液泡等不含有葉酸合成相關(guān)酶的亞細(xì)胞區(qū)域內(nèi)儲(chǔ)存,從而避免葉酸大量積累造成的反饋抑制,最終增加植物中葉酸含量。由于5-甲酰四氫葉酸較其他葉酸形式具有高穩(wěn)定性,阻斷將其轉(zhuǎn)化為其他形式葉酸的酶相關(guān)基因的表達(dá),可增強(qiáng)5-甲酰四氫葉酸及葉酸的積累。植物果實(shí)成熟后蝶啶大量氧化[37],引入外源蝶啶還原酶可使其再度用于葉酸合成,有助于增強(qiáng)葉酸補(bǔ)救能力。

4 葉酸提取和檢測技術(shù)研究

植物性食品原料中葉酸含量較低,并受植物種類、收獲季節(jié)、氣候及采后處理等因素的影響[38]。同時(shí)由于葉酸性質(zhì)不穩(wěn)定性[39],極易被熱、光和氧氣氧化降解,且葉酸包埋在基質(zhì)中,不利于提取[40],而且許多生物材料含有內(nèi)源性共軛酶和能夠引起各種形式葉酸相互轉(zhuǎn)化及分布變化的酶類,影響葉酸檢測結(jié)果[41],因而分析植物源食品中葉酸具有挑戰(zhàn)性。

4.1 葉酸的提取

抗氧化劑、α-淀粉酶、蛋白酶及結(jié)合酶、料液比、pH等均影響葉酸的提取效果。

4.1.1 抗氧化劑 在提取葉酸時(shí),由于大部分還原型葉酸穩(wěn)定性差,因此萃取過程中一般都要加用抗氧化劑,通常為抗壞血酸和還原型硫醇單獨(dú)使用或聯(lián)用。Jastrebova等[42]研究了抗壞血酸鹽水平對葉酸穩(wěn)定性的影響,在同樣添加0.1% 2-巰基乙醇的基礎(chǔ)上,分別添加0.5%、1%、2%的抗壞血酸鹽,四氫葉酸的損失率分別為42%、18%、8%,說明2%的抗壞血酸鹽能更好地保證四氫葉酸的穩(wěn)定性。同時(shí),De Brouwer V[43]發(fā)現(xiàn)巰基乙醇通過去除熱處理過程中由抗壞血酸釋放的甲醛來穩(wěn)定四氫葉酸?？寡趸瘎ΡＷC葉酸的穩(wěn)定性很重要,在提取葉酸時(shí)應(yīng)加入適當(dāng)比例的抗壞血酸、巰基乙醇等。

4.1.2 蛋白酶和淀粉酶 對于富含淀粉和蛋白質(zhì)的大豆、小麥、乳制品等須用α-淀粉酶、蛋白酶及結(jié)合酶三酶聯(lián)合處理,將葉酸從富含蛋白質(zhì)和淀粉的樣品中釋放出來,提高可測定的葉酸含量[44]。對于水果和蔬菜而言,添加淀粉酶、蛋白酶則是不必要的,Shohag[45]發(fā)現(xiàn)這兩種酶的添加對葉酸含量測定的結(jié)果無顯著性影響。

4.1.3 料液比 Patring等[46]研究了料液比對提取酵母中葉酸的影響,對5-甲基四氫葉酸而言，不同的料液比下其提取量無顯著差異。對四氫葉酸而言,一定的提取液所包含的樣品越少,檢測到的葉酸含量越高,這表明樣品組織影響檢測結(jié)果,可能是由于四氫葉酸結(jié)合在樣品組織中,較大的料液比限制了它的釋放。Shohag[47]研究了料液比對提取菠菜時(shí)葉酸回收率的影響,5 g菠菜加入5～40 mL提取液,發(fā)現(xiàn)葉酸回收率先隨著提取液的增加而增加,當(dāng)提取液為15 mL時(shí)達(dá)到最大,之后并沒有顯著的增加,表明合適的料液比可獲得最大的葉酸提取量。

4.1.4 pH 不同形式葉酸在不同pH條件下穩(wěn)定性不同,De Brouwer V[43]研究了pH對不同形式葉酸穩(wěn)定性的影響,結(jié)果表明蝶酰谷氨酸和5-甲基四氫葉酸在pH2～10時(shí)無論加熱與否均相對穩(wěn)定;除去在pH2條件下加熱時(shí)降解25%,10-甲酰葉酸在多數(shù)pH下均呈現(xiàn)較強(qiáng)的穩(wěn)定性;四氫葉酸在pH<5時(shí)呈現(xiàn)不穩(wěn)定性。Zhang等[48]研究了提取液pH對菠菜中葉酸的影響,發(fā)現(xiàn)受pH影響最大的是四氫葉酸,在低pH下,其回收率較低,但隨著pH的升高使提取液達(dá)到中性或堿性時(shí)其回收率可增加至原來的2倍;5-甲基四氫葉酸在酸性條件下則更為穩(wěn)定;5-甲酰四氫葉酸的回收率在pH為5處達(dá)到最大值。因此,在測定葉酸時(shí)應(yīng)選擇pH合適的提取液。

4.1.5 去谷氨酸化 無論是用微生物法還是高效色譜法均無法測出多聚谷氨酸葉酸,故必須使用結(jié)合酶將其降解為單谷氨酸葉酸或雙谷氨酸葉酸。Patring[46]發(fā)現(xiàn),酵母的質(zhì)量和大鼠血清的體積比對于是否能實(shí)現(xiàn)葉酸的完全軛合起至關(guān)重要的作用,但在使用前必須先除去內(nèi)源性葉酸。在去谷氨酸化過程中,經(jīng)常使用的軛合酶有大鼠血漿、大鼠血清、豬腎、雞胰、人類血漿等。酶的選擇取決于應(yīng)用何種分析方法,若使用微生物法,由于雞胰較易獲得,且活性高而廣泛使用。若使用高效液相色譜法,由于該方法分離葉酸單谷氨酸形式,所以選擇最終產(chǎn)物為葉酸單谷氨酸的酶,如豬腎和血漿。

綜上所述,在提取葉酸時(shí),應(yīng)注意選擇合適的料液比,使葉酸充分溶解在中性及偏堿性提取液中,同時(shí)添加抗氧化劑維持葉酸的穩(wěn)定性。對于富含淀粉及蛋白質(zhì)的大豆、小麥、乳制品等樣品,應(yīng)添加蛋白酶及淀粉酶,使葉酸釋放出來。對所有樣品而言,最終都應(yīng)添加結(jié)合酶,將多谷氨酸葉酸降解為單谷氨酸葉酸或雙谷氨酸葉酸,以此提高葉酸檢測量的準(zhǔn)確度。

4.2 葉酸的純化

在樣品經(jīng)過高效液相色譜分析葉酸含量前,固相萃取技術(shù)是常用的凈化處理技術(shù),其中強(qiáng)陰離子交換柱(SAX)被廣泛使用[49-50],Nilsson等[51]探討了固相萃取技術(shù)對樣品中雜質(zhì)的去除作用,結(jié)果表明SAX、苯基封端柱(PH EC)結(jié)合使用時(shí)最大程度地降低了干擾組分,而二者單獨(dú)使用時(shí)對清除5-甲酰四氫葉酸附近的雜質(zhì)并沒有效果。固相萃取技術(shù)效果好,但操作繁瑣,Zhang等[48]使用截留分子量為5 kDa的膜進(jìn)行超濾,可去除部分雜質(zhì),純化效果好。

4.3 葉酸的檢測技術(shù)

4.3.1 微生物法 測定葉酸的國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 5009.211-2014)方法為微生物法,其主要原理是:葉酸是鼠李糖乳桿菌生長所必需的營養(yǎng)素,在一定控制條件下,將鼠李糖乳桿菌液接種至含有試樣液的培養(yǎng)基中,培養(yǎng)一段時(shí)間后測定透光率或吸光度值,根據(jù)葉酸含量與透光率(或吸光度值)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出樣品中葉酸含量。張旭等[52]比較了酪乳酸桿菌和糞鏈球菌測定葉酸含量的效果,發(fā)現(xiàn)兩種微生物檢測結(jié)果均有良好的重復(fù)性。微生物法有應(yīng)用范圍廣、樣品前處理簡單等優(yōu)點(diǎn),但是有一定的局限性[53],如樣品中其他成分以及環(huán)境添加容易干擾結(jié)果、操作過程復(fù)雜、操作周期長、僅能對葉酸總量進(jìn)行測定,而不能測定單一葉酸。

4.3.2 高效液相色譜法 高效液相色譜法因其對不同形式的葉酸進(jìn)行分離并進(jìn)行定量分析而在葉酸的檢測中得到廣泛應(yīng)用[54]。而且,高效液相色譜法具有適用范圍廣、分離效果好、操作簡便、分析速度快等特點(diǎn)。

高效液相色譜法的常用檢測器包括熒光檢測器、電化學(xué)檢測器及紫外檢測器等,其中熒光檢測器和電化學(xué)檢測器檢測靈敏度高,但由于葉酸結(jié)構(gòu)的多樣性并不適用于所有的葉酸檢測,UV檢測器可以檢測到所有形式的葉酸,但靈敏度低,以致不能檢測到樣品中含量較低的葉酸[48]。Shohag[55]首次使用LC-UV/FLD獲得發(fā)芽大豆和綠豆葉酸含量和組成數(shù)據(jù),所得出的總?cè)~酸含量與穩(wěn)定同位素稀釋測定法一致,表明該方法可靠性較高。

4.3.3 高效液相色譜-質(zhì)譜法 LC-MS及LC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用于天然產(chǎn)物成分的分析研究,不需要對樣品進(jìn)行繁瑣和復(fù)雜的前處理,具有高效快速、靈敏度高等特點(diǎn),尤其適于含量少、不易分離或在分離過程中容易丟失的組分。因此,該方法自誕生以來便得到了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。迄今,同位素稀釋法結(jié)合LC-MS檢測被認(rèn)為是檢測葉酸最精確的方法,因?yàn)槭褂猛凰貥?biāo)記的類似物作為內(nèi)標(biāo),糾正了樣品在提取與凈化處理過程中葉酸的損失[55]。

使用LC-MS及LC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)時(shí),不同的實(shí)驗(yàn)條件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響較大,Zhang等[48]研究了不同緩沖液對實(shí)驗(yàn)靈敏度的影響,結(jié)果表明,在其中添加0.1%的乙酸,獲得了葉酸和甲氨蝶呤最佳的離子化效果。

5 展望

由于葉酸對人體健康的重要性,且植物源食品是人體獲取葉酸的主要方式,提高植物源食品中葉酸含量一直是研究熱點(diǎn)。目前,對于植物中葉酸的生物合成途徑有了一定的認(rèn)識,同時(shí)通過基因工程、發(fā)芽調(diào)控手段富集葉酸也取得一定進(jìn)展,但擴(kuò)大基因工程在提高植物源食品中葉酸含量的應(yīng)用范圍及開發(fā)更有效的發(fā)芽調(diào)控富集葉酸技術(shù)仍有待進(jìn)一步研究。鑒于葉酸測定方法較為復(fù)雜,且測定結(jié)果準(zhǔn)確性受眾多因素影響。因此,亟待開發(fā)快速而準(zhǔn)確的葉酸測定方法,同位素稀釋法結(jié)合LC-MS檢測葉酸雖已取得良好進(jìn)展,但仍有待繼續(xù)提高,以滿足研究及生產(chǎn)的需要。掌握葉酸的生物合成途徑,進(jìn)一步開展植物性食品中葉酸的富集與提取技術(shù)研究,將有助于改善世界范圍內(nèi)葉酸缺乏狀況,對消除人體因葉酸缺乏引起的巨幼紅細(xì)胞性貧血、胎兒神經(jīng)發(fā)育缺陷等疾病的發(fā)生,降低心血管疾病、癌癥等發(fā)病率具有重大的意義。

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