超臨界CO2萃取阿薩伊油的 工藝優(yōu)化及GC-MS分析

瞿 研,賀 成,張建軍,李 偉,王小花,王林元,*

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京,100029;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)北京中醫(yī)藥研究院,北京,100029;3.北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,北京,100029)

阿薩伊(A?aí)為棕櫚科植物阿薩伊棕櫚樹(EuterpeoleraceaeMart.)的新鮮果實,又名巴西莓,原產(chǎn)于南美地區(qū)[1],在巴西、秘魯、哥倫比亞、蘇里南等地使用非常廣泛[2],素有“紫色黃金”之稱。目前,我國廣東、香港、臺灣已有少量種植。阿薩伊營養(yǎng)豐富,當(dāng)?shù)鼐用癯Ｓ脕砉?同時它也具有很高的藥用價值。有研究記載阿薩伊油在原產(chǎn)地可用來治療痢疾[3],由果皮研磨制成的果粉可用于治療皮膚潰瘍,種子經(jīng)燒烘后可制成浸液,用于治療發(fā)燒。當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)醫(yī)學(xué)還用該植物治療糖尿病,脫發(fā),出血,肝炎、黃疸等肝臟疾病,腎臟疾病,瘧疾,月經(jīng)不調(diào),經(jīng)期疼痛和肌肉酸痛等[4]。

近10年來,阿薩伊由于良好的抗氧化能力而備受關(guān)注,以阿薩伊為原料的各類產(chǎn)品風(fēng)靡全球。2013年阿薩伊由衛(wèi)生部引入中國成為新資源食品[5]在我國使用。根據(jù)文獻[6]及預(yù)實驗結(jié)果,我們得知阿薩伊中油脂含量占絕大部分,同時富含花青素、原花青素等不穩(wěn)定成分。目前國內(nèi)外的研究均為使用有機溶劑法提取阿薩伊中的油脂類成分,該方法提取溫度較高,時間長,對阿薩伊油中的不飽和脂肪酸及花青素等成分易產(chǎn)生破壞。因此,本文選擇溫度較低的超臨界CO2流體萃取技術(shù)對阿薩伊油的提取工藝進行優(yōu)化。前期我們已對阿薩伊油中甾醇類成分進行了分析,并建立了含量測定方法。為了更好地對阿薩伊進行系統(tǒng)的研究,本文采用GC-MS法對阿薩伊油進行了較為全面的定性分析,以期為阿薩伊的綜合開發(fā)利用及質(zhì)量評價提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

阿薩伊凍干粉 蒙維(上海)貿(mào)易有限公司;14%三氟化硼-甲醇絡(luò)合物、石油醚(沸點為60～90 ℃)、正庚烷、甲醇、氫氧化鈉、無水硫酸鈉、氯化鈉 均為分析純;二氧化碳 純度≥99.0%,北京環(huán)宇京輝京城氣體科技有限公司。

HA220-50-07型超臨界CO2萃取設(shè)備 南通市華安超臨界有限公司;Agilent 7890-5977B GC/MS型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Agilent公司;BT-125D型電子天平 北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 超臨界CO2萃取阿薩伊油條件優(yōu)化

1.2.1.1 單因素實驗 將阿薩伊凍干粉混合均勻,固定每次投料量為100 g,設(shè)定萃取溫度為40 ℃,萃取時間60 min,分離釜Ⅰ壓力為8 MPa,溫度為35 ℃,分離釜Ⅱ壓力為4 MPa,溫度為33 ℃,考察不同的萃取壓力15、20、25、30、35 MPa對油脂得率的影響;設(shè)定萃取壓力為30 MPa,萃取時間60 min,分離釜Ⅰ壓力為8 MPa,溫度為35 ℃,分離釜Ⅱ壓力為4 MPa,溫度為33 ℃,考察不同的萃取溫度30、35、40、45、50 ℃對油脂得率的影響;設(shè)定萃取壓力為30 MPa,萃取溫度40 ℃,分離釜Ⅰ壓力為8 MPa,溫度為35 ℃,分離釜Ⅱ壓力為4 MPa,溫度為33 ℃,考察不同的萃取時間30、60、90、120、180 min對油脂得率的影響。按下式計算油脂得率。

油脂得率(%)=阿薩伊出油量(g)/阿薩伊凍干粉投料量(g)×100

1.2.1.2 正交實驗 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,確定合適的因素水平,以萃取壓力、萃取溫度、萃取時間3個因素為考察因素,以油脂得率為考察指標(biāo),進行3因素3水平的正交實驗,確定最佳工藝組合并進行直觀分析與方差分析,在最優(yōu)條件下進行驗證實驗。

表1 L9(34)正交實驗因素水平表Table 1 The table of levels and factors of L9(34)orthogonal experiment

1.2.2 GC-MS分析方法

1.2.2.1 供試品甲酯化處理 樣品的甲酯化采用AOAC法[7]。取阿薩伊油0.5 g置于50 mL錐形瓶中,加入6 mL 0.5 mol/L氫氧化鈉-甲醇溶液,振蕩混勻,水浴回流直至油滴全部溶解,再加入14%三氟化硼-甲醇溶液7 mL,繼續(xù)回流30 min,繼續(xù)加入5 mL正庚烷,取下冷凝器,取出燒瓶,加入飽和氯化鈉溶液至錐形瓶頸部,靜置,待分層清晰后取上清液,用無水硫酸鈉脫水,作為分析試樣。

1.2.2.2 GC-MS條件 GC條件:HP-88(100 m×0.25 mm,0.2 μm)型彈性石英毛細(xì)管色譜柱;進樣口溫度為240 ℃;升溫程序:從100 ℃開始,保持2 min,以5 ℃/min升至180 ℃,保持5 min,再以2 ℃/min升至240 ℃,保持10 min;載氣為高純度He,流速為1.0 mL/min;分流進樣,分流比為20∶1;進樣量1 μL;汽化室溫度為250 ℃。MS條件:電子轟擊(EI)離子源,電子能量70 eV;離子源溫度230 ℃;四級桿溫度為150 ℃,傳輸線溫度240 ℃;溶劑延時9.5 min;全掃描,掃描范圍m/z 45～450。采用Mass Hunter的“未知物分析”軟件對該數(shù)據(jù)進行定性分析。同時采用37種混合脂肪酸甲酯標(biāo)準(zhǔn)品對組分進行驗證。按峰面積歸一法進行定量分析,將每一個化合物色譜峰面積所占的相對分?jǐn)?shù)作為各組成化合物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

采用SPSS 20.0單因素方差、多因素方差分析進行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果與分析

2.1.1 萃取壓力對油脂得率的影響 由圖1可以看出隨著萃取壓力增大,油脂得率也隨之增加,但在25～35 MPa時油脂得率增加十分緩慢。萃取壓力對超臨界萃取效果有重要影響,超臨界流體的密度隨著壓力的增加而增大,從而提高了超臨界流體的溶解性能[8],但壓力增加到一定程度后,超臨界流體的可壓縮性變小,造成油脂得率增加緩慢[8],同時考慮到安全因素(該超臨界流體萃取裝置的最大萃取壓力為35 MPa)和設(shè)備成本,選擇20、25、30 MPa作為正交實驗中萃取壓力的三個水平。

圖1 萃取壓力對油脂得率的影響Fig.1 The effect of pressure on the extraction rate of A?aí oil

2.1.2 萃取溫度對油脂得率的影響 實驗結(jié)果如圖2所示,隨著萃取溫度升高,油脂得率呈現(xiàn)出先增長后下降的趨勢。萃取溫度作為超臨界CO2萃取過程的另一個重要參數(shù),升高溫度對萃取得率有兩種不同的影響趨勢。一方面,溫度升高會使分子熱運動加劇,超臨界流體與萃取成分的接觸機會增加,同時溫度升高也使傳質(zhì)速率提高,這些均有利于萃取;另一方面,溫度升高會導(dǎo)致超臨界流體密度降低,溶解能力下降,導(dǎo)致萃取率下降[9]。因此,當(dāng)其它條件一定時,存在著一個相對平衡的萃取溫度范圍,結(jié)合實驗結(jié)果,同時考慮到不破壞阿薩伊中的花青素、原花青素等不穩(wěn)定成分,選擇35、40、45 ℃作為正交實驗中萃取溫度的三個水平。

圖2 萃取溫度對油脂得率的影響Fig.2 The effect of temperature on the extraction rate of A?aí oil

2.1.3 萃取時間對油脂得率的影響 由圖3可以看出,隨著萃取時間的增加,油脂得率先緩慢增長后趨于平衡。從理論上講,萃取時間越長,萃取越完全。但同時會增加能耗,提高成本。另一方面,若萃取時間過短,導(dǎo)致萃取不完全,萃取率降低。實驗發(fā)現(xiàn),當(dāng)萃取時間大于90 min時,油脂得率幾乎不變。因此,選定30、60、90 min作為正交實驗中萃取時間的三個水平。

圖3 萃取時間對油脂得率的影響Fig.3 The effect of times on the extraction rate of A?aí oil

2.2 正交實驗設(shè)計結(jié)果與分析

根據(jù)單因素實驗結(jié)果,選取L9(34)正交表進行超臨界CO2流體萃取阿薩伊油正交實驗,結(jié)果見表2。

表2 正交實驗結(jié)果Table 2 The results of orthogonal experiment

由表2極差分析可知,各因素作用主次順序為C>A>B。最佳工藝為A2B3C3,即萃取壓力為25 MPa,萃取溫度為45 ℃,萃取時間90 min。但由于萃取溫度的2、3水平差距非常小,同時考慮到成本問題及保留阿薩伊凍干粉的活性成分,因此,選擇40 ℃作為最終萃取溫度。綜上,確定最佳提取工藝為A2B2C3,即萃取壓力為25 MPa,萃取溫度為40 ℃,萃取時間90 min，阿薩伊油得率為54.871%。

按優(yōu)選的工藝進行驗證實驗,當(dāng)各項參數(shù)達設(shè)定值時開始萃取,平行操作3次,出油率分別為54.802%、52.507%和53.625%,RSD值為2.139%,與正交結(jié)果相符,表明該工藝穩(wěn)定可行。

2.3 阿薩伊油的組成分析

采用GC-MS技術(shù)對阿薩伊油進行檢測,得到阿薩伊油的總離子流圖(見圖4),所得質(zhì)譜圖經(jīng)計算機質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫NIST14檢索,確定了樣品中譜庫匹配得分>70的34個化合物。其結(jié)果見表3。

表3 阿薩伊油氣質(zhì)聯(lián)用分析結(jié)果Table 3 The results of GC-MS analysis of A?aí oil

圖4 阿薩伊油的離子流圖Fig.4 Total ion chromatography of A?aí oil

由表3可知,阿薩伊油中成分主要為烷烴類、不飽和脂肪酸、飽和脂肪酸,另外,還含有少量的酮、醇等。

傳統(tǒng)的提取油脂類成分的方法,如索氏提取、有機溶劑萃取等,時間較長、產(chǎn)品純度不高,易殘留有害溶劑[10]。超臨界CO2流體萃取技術(shù)是以超臨界CO2流體為萃取劑,在臨界溫度與壓力條件下,從流體或固體物料中獲取分離組分的方法[11]。該技術(shù)提取率高、產(chǎn)品純度好、流程簡單,適合不穩(wěn)定、易氧化的揮發(fā)性成分和脂溶性成分的提取分離,為有效成分的提取提供了更好的方法[12]。近年來,超臨界CO2流體萃取技術(shù)發(fā)展迅速,已廣泛應(yīng)用于植物藥的提取。阿薩伊富含花青素、原花青素等不穩(wěn)定成分[13],在光線、熱、氧氣等存在情況下易發(fā)生變化。因此,本文選用超臨界CO2流體萃取法提取阿薩伊油,不僅可以防止油類成分受到破壞,同時可以最大限度的確保對其它成分的分析利用。

脂肪酸分為飽和脂肪酸(saturated fatty acid,SFA)、單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid,MUFA)和多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)。營養(yǎng)學(xué)和生物臨床醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為,脂肪酸在維持人體健康方面起著重要的作用,飲食中長鏈脂肪酸的組成及含量與各種疾病(如腫瘤、冠心病、心腦血管病和老年癡呆癥等)的發(fā)病率呈正相關(guān)性[14-16]。因此,脂肪酸的組成和含量也就成為衡量其營養(yǎng)價值的最重要指標(biāo)。從膳食中脂肪酸的平衡角度來說,中國營養(yǎng)學(xué)會建議,食用油脂中飽和脂肪酸(SFA)、單不飽和脂肪酸(MUFA)、多不飽和脂肪酸(PUFA)的比例以1∶1∶1為宜,日本的推薦標(biāo)準(zhǔn)是3∶4∶3。對于多不飽和脂肪酸中w-6型和w-3型脂肪酸的比例,營養(yǎng)學(xué)家提出,小于4∶1的理想比值是有益于保障人體健康的脂肪酸平衡模式[17]。ω-3脂肪酸具有防止動脈硬化,降低血壓,活化大腦細(xì)胞,防止老年癡呆病等優(yōu)點,當(dāng)ω-6脂肪酸相對于ω-3脂肪酸過多時,會合成人體的炎癥因子[18]。實驗結(jié)果表明,阿薩伊中主要成分為油酸、棕櫚酸、亞油酸、棕櫚油酸、硬脂酸、亞麻酸,相對百分含量分別為43.419%、19.028%、14.328%、6.702%、6.123%、2.067%,占總含量的92.855%。其中棕櫚酸、硬脂酸為飽和脂肪酸,棕櫚油酸、油酸為單不飽和脂肪酸,亞麻酸為ω-3型多不飽和脂肪酸,亞油酸為ω-6型多不飽和脂肪酸。具體見表4。其飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸及多不飽和脂肪酸的構(gòu)成比例為0.49∶1∶0.31。ω-6型與ω-3型多不飽和脂肪酸比例為6.93∶1,基本符合膳食平衡標(biāo)準(zhǔn)。

表4 阿薩伊油中脂肪酸的分類Table 4 The classification of fatty acids in A?aí

橄欖油由于營養(yǎng)成分豐富、保健功能突出而被公認(rèn)為綠色保健食用油,具有預(yù)防心腦血管疾病、糖尿病、防癌、抗衰老等功能,在西方有“植物油皇后”“液體黃金”之美稱。油茶籽油是我國特有的一種高級食用油,享有“油中珍品”的美稱。它富含單不飽和脂肪酸,其脂肪酸組成與橄欖油相似,有“東方橄欖油”之稱[19]。根據(jù)文獻統(tǒng)計[20],橄欖油與油茶籽油的主要成分見表5。與這兩種油相比,阿薩伊油中飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸比例更加均衡,其亞麻酸含量較橄欖油及油茶籽油偏高,更加有利于人體健康。

表5 橄欖油、油茶籽油及阿薩伊油的組成對比Table 5 The composition of olive oil，camellia seed oil and A?aí oil

3 結(jié)論

超臨界CO2流體萃取阿薩伊油的最佳提取工藝為萃取壓力為25 MPa,萃取溫度為40 ℃,萃取時間90 min,此時得率為54.871%。

經(jīng)GC-MS分析,阿薩伊油中共分離鑒定出34種化合物,其中含量較高的為油酸、棕櫚酸、亞油酸、棕櫚油酸、硬脂酸、亞麻酸,質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為44.607%、19.028%、14.328%、6.702%、6.123%、2.067%。

阿薩伊作為一種南美常用草藥,是一種純天然的藥食兩用資源,可應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、添加劑等領(lǐng)域[13],符合現(xiàn)代的消費理念、營養(yǎng)需求及發(fā)展趨勢。本研究對阿薩伊的油脂類成分進行了較為系統(tǒng)的研究,為阿薩伊的綜合開發(fā)利用及質(zhì)量評價提供了理論依據(jù),為后期藥效實驗的開展及探討成分與藥效的相關(guān)性奠定基礎(chǔ)。

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