蛹蟲草速溶粉對(duì)環(huán)磷酰胺 致小鼠肝損傷的保護(hù)作用

邵 穎,陳安徽,*,張 明,鄭 義,陳宏偉,夏振榮

(1.徐州工程學(xué)院食品(生物)工程學(xué)院,江蘇徐州 221008;2.江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇徐州 221008;3.江蘇康能生物工程股份有限公司,江蘇儀征 221100)

蛹蟲草(Cordycepsmilitaris(L.)Link)又名北蟲草,是真菌寄生于昆蟲的蛹形成的蟲菌復(fù)合體,為我國(guó)傳統(tǒng)滋補(bǔ)性中藥?，F(xiàn)代研究表明,蛹蟲草富含蟲草多糖、腺苷、蟲草素等多種生物活性成分,具有止咳、鎮(zhèn)痛、降壓、抗疲勞、抗菌消炎、抗癌、增強(qiáng)免疫、延緩衰老等多種生理活性[1-10]。因其與冬蟲夏草生物活性成分及生理活性相似,蛹蟲草一直被用作冬蟲夏草的替代品,并在2009年被批準(zhǔn)為新資源食品。隨著生活水平的提高,人們保健意識(shí)的增強(qiáng),保健品特別是藥食兩用資源得到了普遍關(guān)注,而蛹蟲草作為具有特定保健功效的新資源食品也得到了廣泛的認(rèn)可。

目前圍繞蛹蟲草的研究主要集中于蛹蟲草無(wú)性型代謝產(chǎn)物的活性成分及藥理作用層面,針對(duì)蛹蟲草子實(shí)體的研究則主要是蛹蟲草高產(chǎn)栽培技術(shù)領(lǐng)域[11-16]。蛹蟲草子實(shí)體中纖維素含量較高,若直接食用則其中的活性成分無(wú)法充分發(fā)揮功效,通過(guò)速溶技術(shù)利用酶解方法處理蛹蟲草獲得速溶粉會(huì)最大限度地減少蛹蟲草資源的浪費(fèi),且對(duì)打破蛹蟲草子實(shí)體傳統(tǒng)應(yīng)用方法的局限及迎合現(xiàn)代快節(jié)奏生活的需求具有特定的現(xiàn)實(shí)意義。以蛹蟲草為資源的便捷食品的加工工藝及相關(guān)產(chǎn)品的生物學(xué)功效的研究已成為廣大食品從業(yè)人員的關(guān)注焦點(diǎn)。但目前關(guān)于蛹蟲草深加工技術(shù)及其制品的系統(tǒng)分析研究報(bào)道尚少。

環(huán)磷酰胺是臨床上治療惡性腫瘤最常用的烷化劑代表藥物,具有光譜抗癌作用[17]。因?yàn)榄h(huán)磷酰胺的主要代謝產(chǎn)物丙烯醛的肝臟毒性會(huì)引起受治患者藥物性肝損傷,而表現(xiàn)為血清轉(zhuǎn)氨酶升高及肝組織防御性抗氧化系統(tǒng)的抗氧化功能降低[18]。為了探討蛹蟲草速溶粉的生物學(xué)功能,名確蛹蟲草速溶粉對(duì)肝損傷的保護(hù)作用,本研究使用環(huán)磷酰胺構(gòu)建小鼠肝損傷模型,考察了蛹蟲草速溶粉對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的改善作用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實(shí)驗(yàn)小鼠120只,雌雄各半,體重(20±2) g,7～8周齡,購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司(許可證編號(hào)SCXK魯2014 0007);蛹蟲草速溶粉 江蘇康能生物工程股份有限公司;環(huán)磷酰胺 山西普德藥業(yè)股份有限公司;水飛薊賓 天津天士力圣特制藥有限公司;谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、還原型谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GSH-Px)、白細(xì)胞介素2(IL-2)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)檢測(cè)試劑盒 均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

LGJ-18A 型冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)科學(xué)儀器廠;FA2104N型電子分析天平、723C型可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;TGL-16型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器有限公司;SENCO R-502B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申勝生物技術(shù)公司;5804多功能臺(tái)式離心機(jī) Eppendorf公司;Synergy2型多功能酶標(biāo)儀 BioTek公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛹蟲草速溶粉的生產(chǎn)方法 參照專利一種蛹蟲草速溶粉的制備方法(ZL201310207185.9),并根據(jù)具體生產(chǎn)條件作適當(dāng)調(diào)整[19]。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 120只小鼠雌雄各半分開飼養(yǎng)。雌、雄小鼠分別隨機(jī)分為正常對(duì)照組(10只)、模型組(50只)。模型組小鼠每天按照80 mg/kg的劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺,正常對(duì)照組使用生理鹽水代替,連續(xù)注射3 d。造模后的小鼠隨機(jī)分為5組,每組10只,分別為肝損傷模型組、陽(yáng)性對(duì)照組(150 mg/kg水飛薊賓)、蛹蟲草速溶粉高劑量組(80 mg/kg)、中劑量組(40 mg/kg)和低劑量組(20 mg/kg),小鼠連續(xù)灌胃14 d,肝損傷模型組和正常對(duì)照組每天等量給予生理鹽水。

1.2.3 小鼠血清的制備及血清中ALT、AST、IL-2、TNF-α測(cè)定 末次給藥后禁食24 h,采取挖眼取血的方法收集小鼠血液并于4 ℃、3000 r/min條件下離心10 min收集血清于-20 ℃保存?zhèn)溆?。血清中各指?biāo)測(cè)定操作步驟按照試劑盒的要求進(jìn)行。

1.2.4 小鼠肝組織勻漿的制備及生化指標(biāo)的測(cè)定 小鼠快速頸椎脫臼處死后對(duì)死亡小鼠進(jìn)行解剖,取出小鼠肝臟并用已預(yù)冷的生理鹽水進(jìn)行漂洗,臟器上多余水分用濾紙吸干,手術(shù)剪剪碎肝臟并取0.1 g于玻璃勻漿管中,加入0.9 mL預(yù)冷生理鹽水于冰水浴中手動(dòng)勻漿制成10%組織勻漿液,勻漿液于4 ℃、3000 r/min條件下離心15 min后,收集上清液于-20 ℃保存?zhèn)溆?。按照試劑盒說(shuō)明書的方法分別測(cè)定肝組織中SOD、CAT、GSH-Px活力和MDA含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用DPS7.05版軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛹蟲草速溶粉對(duì)肝損傷小鼠血清AST和ALT活性的影響

蛹蟲草速溶粉對(duì)環(huán)磷酰胺致肝損傷小鼠血清中AST和ALT的影響見表1。由表1可知,腹腔注射環(huán)磷酰胺(80 mg/kg)后,雄性和雌性小鼠血清中的AST和ALT活力單位均顯著高于未注射環(huán)磷酰胺的正常對(duì)照組(p<0.01),表明造模成功。

表1 蛹蟲草速溶粉對(duì)環(huán)磷酰胺致肝損傷小鼠血清AST和ALT活性的影響Table 1 Effects of instant powder of Cordyceps militaris on serum AST and ALT in cyclophosphamide-treated mice

對(duì)造模成功小鼠給與不同劑量的蛹蟲草速溶粉后,各劑量組小鼠血清中AST和ALT活力雖仍高于正常對(duì)照組,但卻極顯著地低于模型組(p<0.01)。另外,各劑量組雄性、雌性小鼠血清中AST和ALT的活力與攝入蛹蟲草速溶粉的劑量間還呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系,隨著速溶粉攝入劑量的增加,小鼠血清中AST和ALT的活力呈降低趨勢(shì)。高劑量組雌性小鼠血清中AST和ALT的活力甚至低于陽(yáng)性對(duì)照組。肝臟受損時(shí),動(dòng)物血漿中AST、ALT會(huì)升高,而攝入蛹蟲草速溶粉后其活力明顯降低,說(shuō)明蛹蟲草速溶粉對(duì)不同性別的小鼠均具有降低血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶活力,有效改善肝臟受損的作用。

2.2 蛹蟲草速溶粉對(duì)環(huán)磷酰胺致肝損傷小鼠肝組織生化指標(biāo)的影響

蛹蟲草速溶粉對(duì)環(huán)磷酰胺致肝損傷小鼠肝組織中抗氧化酶活性及丙二醛含量的影響結(jié)果如表2和表3所示。

表2 蛹蟲草速溶粉對(duì)環(huán)磷酰胺致肝損傷小鼠(雄)肝組織SOD、CAT、GSH-Px、MDA的影響Table 2 Effects of instant powder of Cordyceps militaris on SOD,CAT,GSH-Px，and MDA in liver tissue of cyclophosphamide-treated mice(male)

表3 蛹蟲草速溶粉對(duì)環(huán)磷酰胺致肝損傷小鼠(雌)肝組織SOD、CAT、GSH-Px、MDA的影響Table 3 Effects of instant powder of Cordyceps militaris on SOD,CAT,GSH-Px and MDA in liver tissue of cyclophosphamide-treated mice(female)

由表2可知,模型組雄性小鼠攝入環(huán)磷酰胺后肝組織中SOD、CAT、GSH-Px的活力均顯著低于正常對(duì)照組,而MDA的含量顯著高于正常對(duì)照組(p<0.01),說(shuō)明環(huán)磷酰胺造成了雄性小鼠肝臟抗氧化系統(tǒng)的損傷。

灌胃蛹蟲草速溶粉后,各劑量組小鼠肝組織中SOD、GSH-Px活力均極顯著高于模型組,MDA的含量極顯著低于模型組(p<0.01)。僅中、高劑量組小鼠肝組織中CAT活力顯著高于模型組,且達(dá)到了極顯著水平(p<0.01)。高劑量組小鼠的SOD活力甚至還顯著高于正常對(duì)照組,MDA含量顯著低于正常對(duì)照組(p<0.01)。說(shuō)明蛹蟲草速溶粉具有較好的改善雄性小鼠肝組織過(guò)氧化的能力。

表3為蛹蟲草速溶粉對(duì)環(huán)磷酰胺致肝損傷雌性小鼠肝組織中SOD、CAT、GSH-Px活力和MDA含量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知,模型組小鼠肝組織中SOD、CAT和GSH-Px活力均顯著低于正常對(duì)照組,而MDA含量則顯著高于正常對(duì)照組(p<0.01),說(shuō)明造模成功。

與模型組相比,各劑量組小鼠肝組織中CAT活力極顯著增加(p<0.01),且中、高劑量組甚至高于陽(yáng)性對(duì)照;各劑量組小鼠肝臟中MDA的含量顯著低于模型組和正常對(duì)照組(p<0.01),高劑量組中MDA含量還低于陽(yáng)性對(duì)照;中、高劑量組小鼠肝臟中SOD活力顯著高于模型組(p<0.01),且在數(shù)值上還高于陽(yáng)性對(duì)照;另外,與模型組相比較,中、高劑量組小鼠肝組織中GSH-Px活力存在極顯著差異(p<0.01),但在本實(shí)驗(yàn)條件下低劑量組與模型組之間差異不顯著。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明蛹蟲草速溶粉同樣可以改善雌性小鼠肝組織過(guò)氧化狀況。

2.3 蛹蟲草速溶粉對(duì)小鼠血清IL-2、TNF-α的影響

白細(xì)胞介素-2(IL-2)是趨化因子家族中的一種細(xì)胞生長(zhǎng)因子,大多通過(guò)活化T細(xì)胞生成。IL-2能夠促使T細(xì)胞發(fā)生免疫反應(yīng),這種反應(yīng)具有依賴性,也可以有效地治療由自身抗體引起的疾病。腫瘤壞死因子(TNF-α)作為一類通過(guò)巨噬細(xì)胞與單核細(xì)胞生成的單核因子,能夠借助于機(jī)體的免疫功能,對(duì)同一腫瘤起到直接和間接的雙重抗癌活性[20]。環(huán)磷酰胺作為抗癌藥物,使用過(guò)程中不僅存在因?yàn)榄h(huán)磷酰胺主要代謝物丙烯醛引起的肝臟毒性作用,還會(huì)造成機(jī)體免疫系統(tǒng)的抑制作用[21]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定各組小鼠血清中IL-2、TNF-α的含量,初步考察了經(jīng)環(huán)磷酰胺處理后蛹蟲草速溶粉對(duì)小鼠機(jī)體免疫的影響。具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示。

表4 蛹蟲草速溶粉對(duì)環(huán)磷酰胺致肝損傷小鼠血清中IL-2、TNF-α 含量的影響Table 4 Effects of instant powder of Cordyceps militaris on IL-2 and TNF-α in serum of cyclophosphamide-treated mice

由表4可知,模型組小鼠注射環(huán)磷酰胺后其血清中IL-2、TNF-α的含量均顯著低于未注射的正常對(duì)照組小鼠(p<0.01),說(shuō)明環(huán)磷酰胺顯著削弱了小鼠的免疫能力。小鼠攝入蛹蟲草速溶粉后,除低劑量組雄性小鼠血清中TNF-α指標(biāo)外,其他各組小鼠血清中IL-2、TNF-α的含量與模型組間均存在極顯著差異(p<0.01),說(shuō)明蛹蟲草速溶粉具有顯著提高環(huán)磷酰胺致肝損傷小鼠免疫功能的作用。比較各劑量組小鼠血清中IL-2、TNF-α的含量發(fā)現(xiàn),隨著蛹蟲草速溶粉攝入劑量的增加,小鼠血清中IL-2、TNF-α的含量也隨之增加。另外,高劑量組雌、雄小鼠血清中IL-2、TNF-α的含量接近陽(yáng)性對(duì)照組,說(shuō)明蛹蟲草速溶粉能夠有效提高雌、雄小鼠的免疫能力。

3 結(jié)論與討論

利用環(huán)磷酰胺腹腔注射的方式成功構(gòu)建了小鼠肝損傷模型,以水飛薊賓為陽(yáng)性對(duì)照,對(duì)造模成功小鼠灌胃不同劑量的蛹蟲草速溶粉,考察了蛹蟲草速溶粉對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的保護(hù)作用。

小鼠血清中ALT、AST活力測(cè)定結(jié)果表明,各劑量組雌、雄小鼠血清中AST和ALT活力均顯著低于模型組(p<0.01),且高劑量組雌性小鼠血清中AST、ALT的活力甚至低于陽(yáng)性對(duì)照。蛹蟲草速溶粉對(duì)肝損傷小鼠肝組織中抗氧化酶活性及丙二醛含量的影響結(jié)果顯示,各劑量組雄性小鼠肝組織中SOD、GSH-Px活力均顯著高于模型組,MDA的含量顯著低于模型組(p<0.01),中、高劑量組雄性小鼠肝組織中CAT活力顯著高于模型組,且達(dá)到了極顯著水平(p<0.01);對(duì)于雌性小鼠而言,各劑量組小鼠肝組織中CAT活力與模型組間存在極顯著差異(p<0.01),且高劑量組甚至高于陽(yáng)性對(duì)照;各劑量組小鼠肝臟中MDA的含量顯著低于模型組和正常對(duì)照組(p<0.01),高劑量組中MDA含量還低于陽(yáng)性對(duì)照;中、高劑量組小鼠肝臟中SOD、GSH-Px活力顯著高于模型組(p<0.01)。小鼠注射環(huán)磷酰胺后其血清中IL-2、TNF-α的含量均顯著降低,但在攝入蛹蟲草速溶粉后,除低劑量組雄性小鼠血清中TNF-α指標(biāo)外,其他各組小鼠血清中IL-2、TNF-α的含量均極顯著地高于模型組(p<0.01)。

ALT、AST是動(dòng)物血清中重要的轉(zhuǎn)氨酶,正常機(jī)體血清中含量為零或者很少,當(dāng)機(jī)體肝組織損傷時(shí),肝細(xì)胞漿內(nèi)的ALT、AST會(huì)因?yàn)楦渭?xì)胞膜通透性的增加而被釋放入血使得血液中ALT和AST含量增加[22]。本實(shí)驗(yàn)中,環(huán)磷酰胺致肝損傷小鼠攝入蛹蟲草速溶粉后,小鼠血清中ALT和AST的活性與模型組比較均極顯著降低(p<0.01),且活性與蛹蟲草速溶粉的攝入劑量間存在著劑量效應(yīng)關(guān)系。在肝組織抗氧化防御系統(tǒng)中,SOD、CAT和GSH-Px是機(jī)體重要的抗氧化酶,具有清除自由基的作用。MDA是機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化的代謝產(chǎn)物,是反映脂質(zhì)過(guò)氧化的敏感指標(biāo),也可間接反映肝細(xì)胞的損傷程度[23]。本實(shí)驗(yàn)中,蛹蟲草速溶粉顯示了明顯的改善小鼠肝組織過(guò)氧化的能力,同時(shí)顯著地降低了小鼠肝組織中MDA的含量,提示了蛹蟲草速溶粉具有肝損傷改善作用。另有學(xué)者發(fā)現(xiàn)了蛹蟲草多糖對(duì)CCl4導(dǎo)致的小鼠急性肝損傷的顯著保護(hù)作用及蛹蟲草基質(zhì)多糖對(duì)酒精所致的小鼠急性肝損傷的明顯改善作用,兩種多糖均能有效降低小鼠血漿中AST和ALT活力,降低肝組織中MDA含量,提高肝組織中SOD、GSH-Px活力[24-25]。分析其改善小鼠肝損傷的機(jī)制可能是由于蛹蟲草及其基質(zhì)的多糖可以直接捕捉、清除自由基,阻斷或終止自由基連鎖反應(yīng)鏈,加快體內(nèi)自由基的清除,增加SOD活性,穩(wěn)定生物膜結(jié)構(gòu),抑制MDA產(chǎn)生,從而減輕干細(xì)胞變性,促進(jìn)損傷肝組織結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)。本研究中蛹蟲草速溶粉對(duì)小鼠肝損傷的保護(hù)作用與上述兩種多糖的保護(hù)作用保持一致,至于蛹蟲草速溶粉的肝損傷保護(hù)作用是否是通過(guò)其改善小鼠過(guò)氧化狀態(tài)實(shí)現(xiàn)的值得深入探討,另外起到肝損傷保護(hù)作用的物質(zhì)基礎(chǔ)是源于蛹蟲草速溶粉中的多糖還是其他的活性成分也值得進(jìn)行進(jìn)一步研究。

環(huán)磷酰胺導(dǎo)致小鼠肝損傷的同時(shí),模型組小鼠血清中IL-2及TNF-α的含量顯著降低,研究過(guò)程中通過(guò)測(cè)定小鼠血清中TNF-α及IL-2的含量初步分析了蛹蟲草速溶粉對(duì)因?yàn)榄h(huán)磷酰胺的使用可能造成的免疫抑制小鼠的免疫增強(qiáng)作用。結(jié)果表明,與模型組相比,除低劑量組雄性小鼠血清中TNF-α指標(biāo)無(wú)差異外,其他各組中TNF-α及IL-2的含量均顯著提高(p<0.05),且含量與蛹蟲草速溶粉的劑量間呈現(xiàn)正相關(guān)性。

以新資源食品蛹蟲草為原料通過(guò)速溶加工技術(shù)制作的蛹蟲草速溶粉對(duì)于環(huán)磷酰胺導(dǎo)致的小鼠肝損傷具有明顯的保護(hù)作用,同時(shí)也對(duì)因?yàn)榄h(huán)磷酰胺攝入引起的機(jī)體免疫低下起到了一定的免疫增強(qiáng)作用。蛹蟲草速溶粉明顯的肝損傷改善功效的驗(yàn)證為其在保健品、保健食品、藥品開發(fā)等領(lǐng)域的應(yīng)用提供了參考。

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