五倍子提取物在南美白對蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用研究

（長沙學(xué)院 生物與環(huán)境工程學(xué)院，湖南長沙 410000）

五倍子是癭棉蚜科（Pemphigidae）五節(jié)根蚜亞科（Fordinae）某些蚜蟲寄生在漆樹科（Anacadi-aceae）鹽膚木屬（Rhus L.）幾種樹的復(fù)葉上形成的一類蟲癭[1]。其主要的化學(xué)成分為1分子葡萄糖和6～8個分子沒食子酸縮合的五倍子鞣質(zhì)，含量大多為60%～70%，有一些可以高達(dá)80%，而且含沒蠟質(zhì)、食子酸2%～4%、樹脂、脂肪等，還有若干縮合沒食子鞣質(zhì)[2]。藥理學(xué)表明，除了抗氧化、抗菌等提到的作用，五倍子的提取物對很多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用[3]。

南美白對蝦是目前世界上養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的三大蝦類之一[4]。其肉質(zhì)具有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，如高蛋白質(zhì)，多種氨基酸，肉質(zhì)元素組成非常理想，種類繁多的礦物元素，還含有許多種必需的維生素，具有較高的營養(yǎng)價值[5]。所以南美白對蝦是一種有著非常好的養(yǎng)殖前景的對蝦種類，并且值得大力推廣開發(fā)利用與養(yǎng)殖。近年來由于沿海病毒的危害，造成南美白對蝦的減產(chǎn)，嚴(yán)重影響了其養(yǎng)殖效益。其中副溶血弧菌是最主要的病毒。副溶血弧菌在鹽水中的生長繁殖狀態(tài)最好，所以又叫嗜鹽菌，通常會在海水、淤泥以及水產(chǎn)動物體內(nèi)生長繁殖。主要感染海產(chǎn)魚、蝦、蟹、貝等的水產(chǎn)動物，引起魚類皮膚潰爛、蝦紅體病等，是水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中最主要的致病菌之一，人體食用的水產(chǎn)動物如果被副溶血弧菌感染，可引起腹瀉、腸痙攣等急性腸胃病，甚至死亡[6]。副溶血弧菌已成為人類食用海產(chǎn)品導(dǎo)致食物中毒的主要病因[7]。本文采用水提和醇提兩種方法提起五倍子有效成分，并研究其對副溶血弧菌的抑制作用，為南美白對蝦的健康養(yǎng)殖提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)對蝦品種：南美白對蝦，由廣東粵海飼料集團(tuán)提供

南美白對蝦飼料：由廣東粵海飼料集團(tuán)提供

五倍子：市場藥店購買

試驗(yàn)菌株：副溶血弧菌ATCC17802

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 五倍子有效成分的提取

取洗凈干燥的五倍子粉碎，稱取25g五倍子粉末置于1000ml的燒杯中，加入500mL的75%乙醇，混勻。超聲萃取30min，功率240W。抽濾，棄濾渣，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至25ml，真空冷凍12h，得固態(tài)五倍子提取物，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 不同濃度梯度五倍子提取物的配制

取已滅菌的EP管，將水提和醇提五倍子提取物分別配制成1g/ml、0.5g/ml、0.25g/ml、0.125g/ml、0.0625g/ml、0.03125g/ml濃度梯度。

1.2.3 南美白對蝦養(yǎng)殖前期準(zhǔn)備

南美白對蝦的養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)在長沙學(xué)院室內(nèi)養(yǎng)殖基地進(jìn)行，養(yǎng)殖缸大小為120cm×80cm×80cm，用高錳酸鉀溶液消毒。用粗鹽將養(yǎng)殖缸中水體鹽度調(diào)配至與蝦苗場相同的鹽度。監(jiān)測及調(diào)節(jié)水體滲透壓、水體溫度、pH、溶氧、氨氮、亞硝酸鹽以及硫化氫等指標(biāo)。使水體達(dá)到最佳養(yǎng)殖條件，具體指標(biāo)如下：pH7.8～8.4、溶氧量＞6mg/L、水體溫度22℃～28℃。

餌料投喂方法：蝦片飼料用60～80目尼龍篩過濾，均勻潑灑投喂。每萬尾蝦苗每次投喂20～30g，100～150g/d，投喂4～6次/d，必要時可增投1～2次，每天遞增飼料15%-25%。根據(jù)蝦苗密度、規(guī)格大小、水質(zhì)、蝦苗的攝食情況和腸胃飽滿度以及蝦苗是否出現(xiàn)饑餓性浮頭等情況適當(dāng)調(diào)整。

1.2.4 副溶血弧菌的活化

將實(shí)驗(yàn)室保存的副溶血弧菌ATCC17802凍干粉，接種于2216E液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)活化處理，溫度28℃、轉(zhuǎn)速180r/min。

1.2.5 五倍子水、醇提取物飼料對副溶血弧菌的抑制作用

（1）副溶血弧菌最低致病濃度試驗(yàn)

在南美白對蝦養(yǎng)殖系統(tǒng)中，加入不同濃度的副溶血弧菌，形成相應(yīng)的濃度梯度（表1），試驗(yàn)副溶血弧菌最低致病濃度，通過統(tǒng)計(jì)南美白對蝦的生長狀況及成活率，得出弧菌對南美白對蝦的最低致病濃度。

表1 副溶血弧菌濃度梯度表

（2）五倍子水、醇提取物飼料的制備

將五倍子水、醇提取物均分別按照0.5%、1%、2%的濃度含量均勻地噴灑在飼料表面，然后混勻、烘干，保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）五倍子水、醇提取物不同濃度下對副溶血弧菌的抑制作用

五倍子提取物在殺死細(xì)菌的同時對南美白對蝦也具有毒副作用，為研究五倍子同一提取條件下，不同濃度中的最佳抑菌效果，并且毒副作用最小，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下。

將已經(jīng)制備好的五倍子水、醇提取物飼料分別分成4組（即：普通飼料、0.5%水提取飼料、1%水提取飼料、2%水提取飼料；普通飼料、0.5%醇提取飼料、1%醇提取飼料、2%醇提取飼料）進(jìn)行投喂，連續(xù)投喂5d、10d、20d后，將副溶血弧菌加入南美白對蝦養(yǎng)殖缸中，使養(yǎng)殖缸中的副溶血弧菌濃度達(dá)到1×10-8cfu/ml，此濃度是自然界副溶血弧菌治病的較高濃度，所以選用此濃度模擬自然界的弧菌治病濃度，能很好地體現(xiàn)出五倍子的抑制效果，統(tǒng)計(jì)7d內(nèi)南美白對蝦的生理情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 副溶血弧菌最低致病濃度結(jié)果

副溶血弧菌可以使南美白對蝦患病（表2）

由表2可知，從第5組（1×10-5濃度）開始出現(xiàn)對蝦的死亡。隨著副溶血弧菌的濃度升高，南美白對蝦的死亡數(shù)量增大，可以得知副溶血弧菌最低致病的濃度為1×10-5cfu/ml。

2.2 比較五倍子水、醇提取物飼料對副溶血弧菌的抑制作用

不同濃度五倍子水、醇提取物飼料投喂5d、10d、20d的效果：

圖1 不同濃度水提取物飼料投喂效果

圖2 不同濃度醇提取物飼料投喂效果

根據(jù)圖1，圖2中顯示的南美白對蝦死亡數(shù)量可得，五倍子水提取物飼料組中，含量為1%的抑菌效果最好；而五倍子醇提取物飼料組中，含量為0.5%的抑菌效果最好。連續(xù)喂養(yǎng)五倍子提取物飼料5d抑菌效果最佳。

2.3 五倍子提取物直接投放對副溶血弧菌的抑制作用

直接投放五倍子提取物所產(chǎn)生的抑菌效果如下（表3）

由表9可知，在養(yǎng)殖7天后，對照組死亡8只，活躍程度偏低。0.05%五倍子水提取物組死亡6只，活躍程度適中，沒有很大影響。0.1%五倍子水提取物組死亡6只，活躍程度偏低。0.2%五倍子水提取物組死亡8只，活躍程度偏低。0.3%五倍子水提取物組死亡9只，活躍程度偏低。0.4%五倍子水提取物組死亡10只，活躍程度偏低。0.5%五倍子水提取物組死亡10只，活躍程度偏低。0.6%五倍子水提取物組死亡10只，活躍程度偏低。

綜上所述，在養(yǎng)殖7d后，直接投放五倍子提取物對南美白對蝦的抑菌效果比將五倍子提取物混入飼料中的效果相對較差，并且大于0.05%五倍子水提取物組死亡率高?？梢钥闯?，五倍子直接投喂具有一定的毒副作用，并且毒副作用比將五倍子提取物混入飼料中投喂要大很多。

2.4 結(jié)論

（1）副溶血弧菌最低致病的濃度為105cfu/ml。

（2）五倍子水提取物飼料中，含量為1%的五倍子水提取物飼料具有最好的抑菌效果。而醇法提取中，含量為0.5%的提取物具有最佳的抑菌效果。

（3）五倍子提取物直接投入含副溶血弧菌的水體中，對弧菌有一定的抑制效果，但沒有拌喂飼料效果好。

（4）連續(xù)喂養(yǎng)五倍子提取物飼料5d抑菌效果最佳，連續(xù)喂養(yǎng)10d以上會產(chǎn)生毒副作用，可以連續(xù)投喂5d，間隔投喂。

3 討論

研究表明，五倍子具有非常好的防病殺菌的作用，具有清除自由基、抑菌、抗病毒、抑突變、抗氧化等藥理作用。主要起成效成分為單寧酸（Tannin Acid），又稱鞣質(zhì)、鞣酸、丹寧[8，9]。Sunny O.A 等研究沒食子酸可有效防止機(jī)體脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，可作為機(jī)體自由基的清道夫[10]。Nalan Yilmaz S等報道五倍子有治療抗蛇毒、白帶、帕金森病、腹瀉等作用，也作為皮革鞣、殺蟲劑、劑局部麻醉劑使用[11]，其所含的水解單寧可以在酶、堿、酸作用下水解成沒食子酸。而本實(shí)驗(yàn)所需提取的有效成分就是沒食子酸。由大量的體外實(shí)驗(yàn)表明，五倍子提取物對副傷寒桿菌、綠膿桿菌、肺炎球菌、鏈球菌、金黃色葡萄球菌以及傷寒桿菌、炭疽桿菌、痢疾桿菌、白喉?xiàng)U菌等均有明顯的殺菌或抑菌作用。臨床研究表明五倍子佐以甲硝哇、慶大霉素能增強(qiáng)殺菌效果，特別對厭氧菌、銅綠假單抱菌的作用非常顯著，五倍子還對羊毛樣抱子菌等等的真菌也是有較強(qiáng)的抑制作用[12]。

表2 副溶血弧菌濃度梯度效果表

表3 不同濃度五倍子提取物對弧菌的影響

本實(shí)驗(yàn)本試驗(yàn)采用純水和乙醇不同形式的方法提取五倍子，探討不同方法提取的五倍子提取物對副溶血弧菌的抑制效果及其在南美白對蝦養(yǎng)殖中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)首先探究出南美白對蝦感染副溶血弧菌的最低濃度為10^5cfu/mL。用兩種方法提取五倍子提取物來分別探究五倍子提取物濃度、是否直接投放、喂養(yǎng)天數(shù)對南美白對蝦的養(yǎng)殖影響，兩種方法對比并找出對南美白對蝦毒副作用最小的方法、抑制副溶血弧菌的最佳效果與濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：五倍子水提物和五倍子醇提物均能起到抑制副溶血弧菌生長繁殖的作用；五倍子水提物能更好地抑制副溶血弧菌的生長繁殖。五倍子水提取物飼料中，含量為1%的五倍子水提取物飼料抑菌效果最好。五倍子醇提取物飼料中，含量為0.5%的五倍子醇提取物飼料抑菌效果是最好的。相同條件下五倍子水提取物比純提取物抑制效果好。五倍子提取物直接投入含副溶血弧菌的水體中，對弧菌有一定的毒副作用，但沒有拌喂飼料效果好。在飼喂時間上，連續(xù)喂養(yǎng)五倍子提取物飼料5天抑菌效果最佳，連續(xù)喂養(yǎng)五倍子提取物飼料10天以上會產(chǎn)生毒副作用，可以連續(xù)投喂5天，間隔投喂。五倍子水提取在南美白對蝦養(yǎng)殖過程中具有很好的抑菌效果，能抑制副溶血弧菌生長繁殖從而應(yīng)用到水產(chǎn)養(yǎng)殖中，有效的控制疾病的發(fā)生。

[1]李志國，楊文云，夏定久.中國五倍子研究現(xiàn)狀[J].林業(yè)科學(xué)研究，2003，（6）：760-767.

[2]黃建軍.復(fù)方五倍子抗菌劑有效成分的提取、分離及藥效學(xué)研究[D].西南大學(xué)，2006..

[3]Hsu JD，Kao SH，Ou TT，et al.Gallic acid inhuces G2/M phase arrest of breast of breast cancer cell MCF-7 through stabilization of p27kip1 attributed to disruption of p27kip1/Skp2 complex [J].Aqric Food Chem，2011，59（5）：1996-2003.

[4]北京智水生物技術(shù)有限公司技術(shù)部.南美白對蝦咸淡水養(yǎng)殖要點(diǎn)[J].科學(xué)養(yǎng)魚，2011，（2）：84.

[5]潘英，王如才，羅永巨，等.海水和淡水養(yǎng)殖南美白對蝦肌肉營養(yǎng)成分的分析比較[J].青島海洋大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2001，（6）：828-834.

[6]祝儒剛.海產(chǎn)品中致病性副溶血弧菌 PCR 快速檢測體系建立及定量研究[D].沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，2011.

[7]陳瑞英，魯建章，蘇意誠，等.食品中副溶血性弧菌的危害分析、檢測與預(yù)防控制[J].食品科學(xué)，2007，（1）：341-347.

[8]向發(fā).五倍子溶液劑的安全性評價[D].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[9]閔凡芹.五倍子單寧酸的提取、降解菌株篩選及代謝產(chǎn)物研究[D].中國林業(yè)科學(xué)研究院，2014.

[10]Sunny O.A，Oghenetega F.A，et al.Selective induction of cell death in cancer cells by gallic acid[J].Biol Pharm Bu11，1995，18（11）：1526-1530.

[11]Nalan Yilmaz Sariozlu，Merih Kivanc.Gallnuts（Quercus Infectoria Oliv.andRhus chinensis Mill.）and Their Usage in Health[J].Nut and Seed in health and Disease Prevention，2011，（60）：505-511.

[12]邱慶連，潘清清，張友平，等.五倍子、烏梅等45種中草藥提取物對鋸緣青蟹致病弧菌的抑菌作用研究[J].浙江海洋學(xué)院學(xué)報（自然科學(xué)版），2010，（1）：34-38.