轉(zhuǎn)化生長因子-β1對MC3T3-E1小鼠成骨細(xì)胞骨形成的影響

晉 瑞，李 嫚，雷 喆，金迎迎

1)西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科 西安 710004 2)西安市第三醫(yī)院科教科 西安 710018 3)西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科 西安 710004

骨形成的過程主要依靠成骨細(xì)胞，并由多種細(xì)胞和生長因子協(xié)同完成。轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)是一類在骨形態(tài)發(fā)生、干細(xì)胞分化、細(xì)胞凋亡等生理過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用的細(xì)胞因子[1]，包含TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、Activin A等多個成員，通過與其受體TGF-β超家族信號傳導(dǎo)Type 1受體(activin like kinase, ALK5)的結(jié)合激活下游信號通路，在骨形成過程中起著重要的調(diào)控作用[2-4]。硬骨素(sclerostin, SOST)由骨細(xì)胞特異性表達(dá)，參與調(diào)節(jié)骨代謝，是骨形成的負(fù)性調(diào)控因子。大量動物和臨床研究[5-6]表明，SOST在2型糖尿病、甲狀腺功能亢進(jìn)癥等多種疾病的骨代謝異常的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著一定作用。有研究[7]報(bào)道：SOST可經(jīng)TGF-β及其受體通路抑制成骨細(xì)胞分化和骨形成，但具體的作用機(jī)制尚不清楚。本研究以MC3T3-E1小鼠成骨細(xì)胞系為研究對象，檢測TGF-β1誘導(dǎo)下細(xì)胞中SOST的表達(dá)變化。

1 材料與方法

1.1材料MC3T3-E1小鼠成骨細(xì)胞系(中科院上海細(xì)胞庫)、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)液(ATCC 公司)，以ALK5基因?yàn)榘谢虻奶禺愋詓iRNA及陰性對照(Dharmacon Inc公司)，Trizol(Invitrogen公司)，ECL發(fā)光試劑盒、RIPA細(xì)胞蛋白裂解液、瓊脂糖(BioWest公司)，β-actin、兔抗小鼠Smad2/3 抗體及HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(Sigma公司)，BSA及BCA總蛋白定量試劑盒(Thermo Scientific公司)，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時熒光定量PCR反應(yīng)試劑盒(TaKaRa公司)；定點(diǎn)誘變試劑盒(Stratagene公司)。

1.2TGF-β1處理對MC3T3-E1細(xì)胞中SOST、ALK5mRNA表達(dá)的影響采用快速融化法復(fù)蘇細(xì)胞，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、青霉素(100 g/L)、鏈霉素(50 g/L)的DMEM完全培養(yǎng)液將細(xì)胞配成2×106/mL的懸浮液，置于6孔板中，每孔2 mL。37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2常規(guī)培養(yǎng)48 h后更換為無血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。然后分別加入終質(zhì)量濃度為10 μg/L的甲狀旁腺激素(parathyroid hormone, PTH)(PTH處理組)或終質(zhì)量濃度為10 μg/L的TGF-β1(TGF-β1處理組)處理細(xì)胞6、12、24 h，然后取細(xì)胞，用實(shí)時熒光定量PCR法進(jìn)行SOST、ALK5 mRNA水平的檢測。以等量DMSO處理組為空白對照組。每組均設(shè)6個復(fù)孔。

1.3ALK5siRNA轉(zhuǎn)染對MC3T3-E1細(xì)胞中SOSTmRNA和Smad2/3蛋白表達(dá)的影響取生長至對數(shù)期的MC3T3-E1細(xì)胞進(jìn)行ALK5-siRNA轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染成功后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組：對照組(不加任何處理)，ALK5 siRNA處理組(單純ALK5 siRNA轉(zhuǎn)染)，TGF-β1處理組(終質(zhì)量濃度為10 μg/L的TGF-β1處理24 h)，TGF-β1+ALK5 siRNA處理組(終質(zhì)量濃度為10 μg/L的TGF-β1處理轉(zhuǎn)染ALK5 siRNA的細(xì)胞24 h)。每組均設(shè)6個復(fù)孔。①SOST mRNA：采用Trizol抽提法提取細(xì)胞總RNA。按說明書步驟進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR。PCR反應(yīng)體系：10×擴(kuò)增緩沖液10 μL，dNTP混合物(各200 μmol/L)，引物(各100 pmol)，模板DNA 2 μg，Taq DNA聚合酶 2.5 μL，加雙蒸水至100 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 1.5 min；94 ℃ 1 min，64 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min 40個循環(huán)；最后在72 ℃下延伸10 min，然后，根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因的Ct值求得各樣本中SOST、ALK5 mRNA的表達(dá)水平。②Smad2/3蛋白：用RIPA細(xì)胞蛋白裂解液提取細(xì)胞蛋白，BCA法測定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE電泳，后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜進(jìn)行如下處理：BSA封閉過夜，兔抗小鼠Smad2/3一抗(按11 00稀釋)室溫孵育2 h，PBS洗滌3次，HRP-IgG(按1200稀釋)室溫孵育2 h，ECL顯色，暗室曝光。應(yīng)用Scion Image圖像分析系統(tǒng)對所得條帶進(jìn)行分析，蛋白質(zhì)的相對含量以目的蛋白與β-actin條帶光密度的比值表示。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0進(jìn)行分析，應(yīng)用單因素方差分析比較TGF-β1處理后MC3T3-E1細(xì)胞中SOST、ALK5 mRNA表達(dá)的差異，應(yīng)用析因設(shè)計(jì)的方差分析比較ALK5 siRNA轉(zhuǎn)染對MC3T3-E1細(xì)胞中SOST mRNA和Smad2/3蛋白表達(dá)的影響，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1TGF-β1處理后MC3T3-E1細(xì)胞中SOST、ALK5mRNA的表達(dá)結(jié)果見表1。不同處理方式對MC3T3-E1細(xì)胞中SOST及ALK5表達(dá)水平均有顯著影響， TGF-β1處理24 h后SOST及ALK5 mRNA相對表達(dá)量顯著升高。

2.2ALK5siRNA轉(zhuǎn)染對MC3T3-E1細(xì)胞中SOSTmRNA和Smad2/3蛋白表達(dá)的影響見圖1和表2。由表2可知，ALK5 siRNA處理可部分抑制TGF-β1誘導(dǎo)的SOST mRNA和Smad2/3蛋白表達(dá)上調(diào)。

表1 TGF-β1處理后MC3T3-E1細(xì)胞中SOST、ALK5 mRNA的表達(dá)結(jié)果

1：對照組；2：TGF-β1處理組；3：ALK5 siRNA處理組；4：TGF-β1+ALK5 siRNA處理組圖1 不同處理?xiàng)l件對Smad2/3蛋白表達(dá)水平的影響

表2 ALK5-siRNA轉(zhuǎn)染對MC3T3-E1細(xì)胞中SOST mRNA和Smad2/3蛋白表達(dá)的影響

3 討論

骨的形成是一個復(fù)雜的生理過程, 受到多種細(xì)胞因子的調(diào)控。TGF-β是一類在細(xì)胞的增殖分化中發(fā)揮重要作用的調(diào)控因子，在骨的形成與代謝中也起關(guān)鍵作用。TGF-β1是TGF-β超家族成員中最具有代表性的成員，TGF-β受體(TGF-βR)屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶受體家族，包括 TGF-βRⅠ、TGF-βRⅡ、TGF-βRⅢ，其中TGF-βRⅠ又稱ALK5，在TGF-β信號傳導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用。

SOST是骨形態(tài)發(fā)生中的負(fù)性調(diào)控因子，位于常染色體17q12-21處，其表達(dá)具有高度的組織特異性。SOST僅存在于人和小鼠的骨組織中，且其分泌僅局限于骨細(xì)胞[8]。既往有研究[5]指出，TGF-β超家族在成骨細(xì)胞中可通過調(diào)節(jié)SOST基因的表達(dá)，影響成骨細(xì)胞分化。本研究結(jié)果顯示，使用TGF-β1處理細(xì)胞可顯著上調(diào)MC3T3-E1細(xì)胞中ALK5和SOST mRNA的表達(dá)，沉默ALK5后TGF-β1誘導(dǎo)的SOST mRNA的表達(dá)上調(diào)受到抑制，提示ALK5可能是TGF-β1上調(diào)SOST mRNA表達(dá)的必要因素。

Smad2/3為TGF-β信號通路中重要的中介體，能夠參與調(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生理活動，例如細(xì)胞增殖、分化、凋亡等。研究表明，TGF-β/Smad信號通路是實(shí)現(xiàn)骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的信號通路之一[9]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)TGF-β1處理后Smad2/3蛋白表達(dá)水平升高，沉默ALK5后TGF-β1處理的MC3T3-E1細(xì)胞中Smad2/3蛋白化水平被顯著抑制，提示TGF-β1與其受體ALK5結(jié)合后對Smad2/3蛋白水平進(jìn)行調(diào)控。

既往研究[10]發(fā)現(xiàn)，在SOST基因上存在一個 250 bp 的進(jìn)化保守序列——進(jìn)化保守位點(diǎn)5 (evolutionarily con-served region 5, ECR5)，為SOST基因的骨特異增強(qiáng)子元件。ECR5可被多種轉(zhuǎn)錄因子激活，進(jìn)而促進(jìn)SOST基因的表達(dá)。另有研究[11]發(fā)現(xiàn)，在增強(qiáng)子ECR5區(qū)含有Smad基因序列的特異性結(jié)合位點(diǎn)，而Smad2/3為TGF-β下游的重要信號蛋白，據(jù)此，結(jié)合本研究結(jié)果，作者推測，TGF-β通過調(diào)控Smad2/3表達(dá)從而影響Smad2/3與SOST增強(qiáng)子ECR5區(qū)的Smad特異性結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對SOST的正向調(diào)控。因既往研究[12-13]已知SOST是骨形成中的負(fù)性調(diào)控因子，不利于成骨細(xì)胞分化，因此有效的降低SOST的表達(dá)，可為促進(jìn)骨折愈合以及治療骨質(zhì)疏松等骨科疾病提供參考。

綜上所述，該研究結(jié)果顯示，TGF-β1與其受體ALK5結(jié)合后可上調(diào)Smad2/3蛋白表達(dá)，Smad2/3可能通過與SOST增強(qiáng)子ECR5區(qū)Smad特異性結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，上調(diào)SOST表達(dá)，從而影響成骨細(xì)胞骨形成。

[1] LI Y, JIE L, TIAN AY, et al. Transforming growth factor beta is regulated by a glucocorticoid-dependent mechanism in denervation mouse bone[J]. Sci Rep, 2017, 7(1): 9925

[2] GUGJOO MB, AMARPAL, ABDELBASET-ISMAIL A, et al. Mesenchymal stem cells with IGF-1 and TGF-β1 in laminin gel for osteochondral defects in rabbits[J].Biomed Pharmacother,2017, 93: 1165

[3] KALINICHENKO SG, MATVEEVA NY, KOSTIV RE, et al. Role of vascular endothelial growth factor and transforming growth factor-β2 in rat bone tissue after bone fracture and placement of titanium implants with bioactive bioresorbable coatings[J]. Bull Exp Biol Med, 2017, 162(5): 671

[4] WANG T, MUHETAER H, LI J.Experimental study of transforming growth factor-beta3 combined with dental pulp stem cells in promoting the implant′s osseointegration[J].Zhonghua Kou Qiang Yi Xue Za Zhi, 2017, 52(6): 367

[5] 熊雪松, 余顯霞. 2型糖尿病與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)性研究進(jìn)展[J]. 中國骨質(zhì)疏松雜志, 2017, 23(1): 130

[6] 張夢媛, 任安. 甲狀腺功能亢進(jìn)患者硬骨素與骨代謝的關(guān)系[J]. 天津醫(yī)藥, 2014, 42(9): 908

[7] MANOKAWINCHOKE J, SUMREJKANCHANAKIJ P, PAVASANT P, et al. Notch signaling participates in TGF-β induced SOST expression under intermittent compressive stress[J]. J Cell Physiol, 2017, 232(8): 2221

[8] POOLE KE, VAN BEZOOIJEN RL, LOVERIDGE N, et al. Sclerostin is a delayed secreted product of osteocytes that inhibits bone formation[J]. FASEB J, 2005, 19(13): 1842

[9] 林凱, 虞德兵, 解曉東, 等. TGF-β/Smad信號通路在Follistatin調(diào)節(jié)鴨骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖過程中的作用機(jī)制[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 48(12): 2460

[10]LOOTS GG, KNEISSEL M, KELLER H, et al. Genomic deletion of a long-range bone enhancer misregulates sclerostin in Van Buchem disease[J]. Genome Res, 2005, 15(7): 928

[11]LOOTS GG, KELLER H, LEUPIN O, et al. TGF-β regulates sclerostin expression via the ECR5 enhancer[J]. Bone, 2012,50(3):663

[12]陳聰, 康權(quán), 羅慶, 等. 骨形成蛋白家族成員2、7對小鼠胚胎肝干細(xì)胞分化的體外研究[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2013, 38(4): 260

[13]喬松, 許琦, 葉子青, 等. 骨保護(hù)素對高齡骨質(zhì)疏松癥患者骨代謝的影響[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2015, 40(6): 472