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    脂肪源性干細(xì)胞促進(jìn)大鼠神經(jīng)施萬細(xì)胞增殖和分泌功能

    2018-05-30 23:09:40宋起濱王哲王宇令李楊林爽
    關(guān)鍵詞:施萬共培養(yǎng)引物

    宋起濱,王哲,王宇令,李楊,林爽

    (中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 1. 整形美容科; 2. 病理科,沈陽 110004)

    雖然周圍神經(jīng)損傷后具有一定的再生潛能,但是一般情況下?lián)p傷的周圍神經(jīng)很難實現(xiàn)完全的再生[1]。周圍神經(jīng)損傷后,施萬細(xì)胞可以快速地從成髓鞘狀態(tài)向生長支持的形態(tài)轉(zhuǎn)換,損傷的神經(jīng)遠(yuǎn)端會有大量的施萬細(xì)胞增殖,增殖的同時施萬細(xì)胞會向近端遷移構(gòu)成基底膜束或者形成Bungner帶,一般情況下,在損傷3 d后施萬細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)換會達(dá)到高峰。施萬細(xì)胞能夠分泌大量的神經(jīng)營養(yǎng)因子、細(xì)胞因子和細(xì)胞外基質(zhì)分子,刺激周圍神經(jīng)再生,促進(jìn)軸突生長。但因施萬細(xì)胞自體來源有限,作用時間較短,導(dǎo)致神經(jīng)損傷難以完全再生[2-4]。

    干細(xì)胞是組織工程與再生醫(yī)學(xué)中常用的種子細(xì)胞,具有快速自我更新和多向分化的能力。其中,脂肪源性干細(xì)胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)因具有產(chǎn)量高、獲取過程損傷小等優(yōu)勢而被廣泛應(yīng)用。研究[5]發(fā)現(xiàn)促有絲分裂和分化因子可以誘導(dǎo)ADSCs向類似施萬細(xì)胞分化,分化后的細(xì)胞能夠表達(dá)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物和營養(yǎng)因子受體。但也有研究[6-7]指出ADSCs很難分化成完全的施萬細(xì)胞,其旁分泌功能對周圍神經(jīng)再生的作用要遠(yuǎn)大于分化功能。

    本研究將大鼠神經(jīng)施萬細(xì)胞用ADSCs條件培養(yǎng)基培養(yǎng)或與ADSCs共培養(yǎng)后,發(fā)現(xiàn)ADSCs條件培養(yǎng)基及ADSCs共培養(yǎng)均能促進(jìn)大鼠神經(jīng)施萬細(xì)胞的增殖及分泌功能,為周圍神經(jīng)再生的研究提供了新的思路。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 實驗動物:4周齡健康成年SD大鼠,體質(zhì)量90~130 g,用于分離培養(yǎng)ADSCs,由我院實驗動物中心提供。本實驗獲得我院動物倫理委員會審批。

    1.1.2 主要試劑:大鼠神經(jīng)施萬細(xì)胞(沈陽匯佰生物有限公司);Ⅱ型膠原酶(美國Sigma公司),胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司),DMEM培養(yǎng)基(美國Hyclone公司),胰蛋白酶(美國Corning公司),四甲基偶氮唑藍(lán)(北京匯佰生物有限公司),F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗大鼠CD31、CD90、CD45和CD44(美國BD公司),神經(jīng)生長因子(nerve growth factor,NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(glial cell line derived neurotrophic factor,GDNF)、血 管 內(nèi) 皮 生 長因 子(vascular endothelial growth factor,VEGF) 和GAPDH抗體(美國Santa Cruz公司),二抗、ELISA試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),SYBR試劑盒(日本TaKaRa公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 ADSCs分離培養(yǎng):用Hanks液清洗SD大鼠雙側(cè)腹股溝區(qū)脂肪,剪碎脂肪,加入Ⅱ型膠原酶,37℃消化40 min。培養(yǎng)基終止消化后1 000 r/min離心5 min,用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,吹打均勻,置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。此后每2~3 d換液1次,待細(xì)胞融合至90%時用胰蛋白酶消化傳代。

    1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng):將大鼠神經(jīng)施萬細(xì)胞接種于含10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    1.2.3 ADSCs表面標(biāo)記物鑒定:取第三代ADSCs消化離心計數(shù)后,用PBS將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)為5×105/mL。取500 μ L細(xì)胞懸液,分別加入FITC標(biāo)記的CD31、CD90、CD45和CD44抗體(PBS作為對照),4 ℃孵育30 min,PBS洗1次,PBS重懸細(xì)胞,使用流式細(xì)胞儀檢測。

    1.2.4 ADSCs條件培養(yǎng)基獲?。捍谌鶤DSCs在完全培養(yǎng)基中達(dá)到90%融合時,更換為含1%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集培養(yǎng)液,0.22 μ L濾器過濾,獲得ADSCs條件培養(yǎng)基。

    1.2.5 ADSCs與大鼠神經(jīng)施萬細(xì)胞的間接培養(yǎng):將大鼠神經(jīng)施萬細(xì)胞接種于transwell下室中,實驗組在transwell上室中接種200 μ L濃度為5×105/mL的ADSCs,對照組則不添加ADSCs。

    1.2.6 ELISA:按照ELISA試劑盒說明書,使用雙抗體夾心法,包被上樣,加抗體,底物顯色,通過酶標(biāo)儀分析結(jié)果。

    1.2.7 MTT實驗:將用ADSCs條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)施萬細(xì)胞以1×104/mL濃度接種于96孔培養(yǎng)板中,終體積200 μ L,以正常培養(yǎng)基培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)施萬細(xì)胞作為對照。待細(xì)胞貼壁后,于0、12、24、36和48 h(每個濃度、每個時間點分別設(shè)3個復(fù)孔)分別加入5 mg/mL MTT溶液10 μ L,置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后,棄上清,每孔中加入200 μ L DMSO,震蕩10 min,在490 nm處記錄吸光值。于0、12、24、36和48 h(每個濃度、每個時間點分別設(shè)3個復(fù)孔)在與ADSCs共培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)施萬細(xì)胞中加入5 mg/mL MTT溶液10 μ L,置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后,棄上清,每孔中加入200 μ L DMSO,震蕩10 min,在490 nm處記錄吸光值。

    1.2.8 Western blotting:細(xì)胞培養(yǎng)48 h后使用RIPA裂解液搜集并裂解細(xì)胞,提取蛋白,通過G250定量后,取30 μ g蛋白進(jìn)行電泳(80~120V)、轉(zhuǎn)膜(100 V,1 h)后,用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。加入一抗4 ℃過夜后,TBST清洗3次。二抗室溫孵育1 h后,TBST清洗3次。ECL發(fā)光。

    1.2.9 實時PCR:TRIZOL法提取培養(yǎng)48 h的大鼠神經(jīng)施萬細(xì)胞RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,進(jìn)行實時PCR反應(yīng)。NGF正向引物序列為5’-ATGTCCATGTTGTTCT AC-3’,反向引物序列為5’-CAGCCTCTTCTTGCAGC C-3’;BDNF 正向引物序列為5’-GACCATCCTTTTC CTTAC-3’,反向引物序列為5’-CTATCTTCCCCTTTT AATGG-3’;GDNF 正向引物序列為5’-GAACCAAGC CAGTGTATCTCC-3’,反向引物序列為5’-CGTCTCT GCCTTTGTCCTC-3’;VEGF正向引物序列為5’-GAT GAAGCCCTGGAGTGC-3’,反向引物序列為5’-GGT GGTGTGGTGGTGACAT-3’;GAPDH 正向引物序列為5’-GGCAAATTCAACGGCACAGT-3’,反向引物序列為5’-TAGGGCCTCTCTTGCTCAGT-3’。

    1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

    采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,用非配對t檢驗比較2組數(shù)據(jù),P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 ADSCs細(xì)胞鑒定

    流式分析結(jié)果顯示,所提取的細(xì)胞CD31陰性(0.38%),CD45陰 性(17.53%),CD44陽 性(92.31%),CD90陽性(96.42%),證明ADSCs細(xì)胞提取培養(yǎng)成功。見圖1。

    圖1 ADSCs表面抗原標(biāo)記物檢測Fig.1 Detection of surface antigen markers on ADSCs

    2.2 ADSCs條件培養(yǎng)基中神經(jīng)營養(yǎng)因子的檢測

    通過ELISA檢測發(fā)現(xiàn),ADSCs條件培養(yǎng)基中含有大量常見的與神經(jīng)再生相關(guān)的因子,其中,NGF、BDNF、GDNF、VEGF的含量分 別為(85.12±1.92)、(184.22±18.32)、(96.97±1.39)、(488.18±4.82)pg/mL,均明顯高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05)。見圖2。

    圖2 不同培養(yǎng)基中神經(jīng)營養(yǎng)因子的含量Fig.2 Contents of neurotrophic factors in different mediums

    2.3 ADSCs條件培養(yǎng)基及ADSCs對大鼠神經(jīng)施萬細(xì)胞增殖的影響

    MTT檢測結(jié)果顯示,ADSCs條件培養(yǎng)基可以明顯促進(jìn)大鼠神經(jīng)施萬細(xì)胞增殖(圖3A);與ADSCs共培養(yǎng)也可促進(jìn)大鼠神經(jīng)施萬細(xì)胞的增殖(圖3B)。

    2.4 不同濃度ADSCs對大鼠神經(jīng)施萬細(xì)胞中神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)的影響

    Western blotting與實時PCR結(jié)果顯示,與對照組相比,使用ADSCs條件培養(yǎng)基培養(yǎng)或與ADSCs共培養(yǎng)的實驗組大鼠神經(jīng)施萬細(xì)胞中NGF、BDNF、GDNF和VEGF蛋白及mRNA表達(dá)水平均增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P < 0.05),提示用條件培養(yǎng)基培養(yǎng)或與ADSCs共培養(yǎng)大鼠神經(jīng)施萬細(xì)胞能夠促進(jìn)細(xì)胞中神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá),見圖4、5。

    3 討論

    圖3 ADSCs條件培養(yǎng)基及ADSCs共培養(yǎng)對大鼠神經(jīng)施萬細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effects of medium conditioned with ADSCs or co-cultured with ADSCs on the proliferation of Schwann cells

    圖4 ADSCs條件培養(yǎng)基對大鼠神經(jīng)施萬細(xì)胞中神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)的影響Fig.4 Effects of medium conditioned with ADSCs on the expression of neurotrophic factor in rat Schwann cells

    圖5 ADSCs共培養(yǎng)對大鼠神經(jīng)施萬細(xì)胞中神經(jīng)營養(yǎng)因子表達(dá)的影響Fig.5 The expression of neurotrophic factors in rat Schwann cells when co-cultured with ADSCs

    干細(xì)胞能夠促進(jìn)周圍神經(jīng)的再生,但其作用機(jī)制目前尚不清楚[8]。研究[9-11]表明,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及ADSCs可以分化為施萬細(xì)胞,進(jìn)而在神經(jīng)修復(fù)中發(fā)揮重要作用,但也有研究認(rèn)為干細(xì)胞所分化出的施萬細(xì)胞僅為類施萬細(xì)胞,僅具有施萬細(xì)胞的表型,并不能夠在體內(nèi)發(fā)揮施萬細(xì)胞的生理功能。體內(nèi)實驗[12]證明,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及ADSCs移植到坐骨神經(jīng)損傷處后,僅有極小部分能夠分化成施萬細(xì)胞,對整體的神經(jīng)修復(fù)作用不大。目前,大多數(shù)研究[13]認(rèn)為,在促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷修復(fù)中發(fā)揮重要作用的是干細(xì)胞的旁分泌作用,為了明確ADSCs在外周神經(jīng)損傷修復(fù)中的作用,本研究在獲取大鼠ADSCs后,分別將大鼠神經(jīng)施萬細(xì)胞用ADSCs條件培養(yǎng)基培養(yǎng)或與ADSCs共培養(yǎng),并檢測了ADSCs對大鼠神經(jīng)施萬細(xì)胞的影響。

    很多細(xì)胞因子能夠在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。周圍神經(jīng)受損后NGF表達(dá)上調(diào),可以促進(jìn)信號的傳遞以及軸突的生長;周圍神經(jīng)損傷后,BDNF的表達(dá)也有一定程度的上升,BDNF可以促進(jìn)周圍神經(jīng)髓鞘的形成;周圍神經(jīng)受損后,GDNF表達(dá)大量增加,促進(jìn)感覺神經(jīng)等的再生[14];新生血管能夠為神經(jīng)再生提供營養(yǎng),VEGF的表達(dá)可以促進(jìn)血管的再生,也可以刺激軸突的生長,促進(jìn)施萬細(xì)胞的增殖并抑制其凋亡[15-16]。本研究通過ELISA檢測發(fā)現(xiàn)ADSCs條件培養(yǎng)基中含有大量的神經(jīng)營養(yǎng)因子,這些成分都可以促進(jìn)周圍神經(jīng)的再生,促進(jìn)大鼠神經(jīng)施萬細(xì)胞的增殖。

    本研究還發(fā)現(xiàn),ADSCs條件培養(yǎng)基和ADSCs細(xì)胞共培養(yǎng)均可促進(jìn)大鼠神經(jīng)施萬細(xì)胞的增殖,并促進(jìn)該細(xì)胞中NGF、BDNF、GDNF和VEGF的表達(dá)。提示ADSCs不僅自身能夠分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子,還能促進(jìn)大鼠神經(jīng)施萬細(xì)胞增殖并分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子。

    綜上所述,ADSCs可以分泌大量有利于周圍神經(jīng)再生的生長因子,ADSCs及其條件培養(yǎng)基能促進(jìn)大鼠神經(jīng)施萬細(xì)胞增殖并分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子,從而有助于周圍神經(jīng)的再生。

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