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    PP242對人晶狀體上皮細胞凋亡的誘導(dǎo)及凋亡相關(guān)蛋白Bax表達的影響

    2018-05-30 23:10:00白雪寧宏
    關(guān)鍵詞:晶狀體線粒體引物

    白雪,寧宏

    (中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科,沈陽 110001)

    后發(fā)性白內(nèi)障(posterior capsule opacification,PCO)是晶體破損或晶體摘除術(shù)后,其殘余的皮質(zhì)或上皮細胞在后囊膜上發(fā)生的病理變化。研究[1]表明,PCO的發(fā)生是由眾多生長因子及細胞凋亡共同作用的。所以,現(xiàn)階段的重心是如何在促進人晶狀體上皮細胞 (human lens epithelial cells,HLECs) 凋亡的同時抑制其增殖。作為新型的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 (mammal target of rapamycin,mTOR) 抑制劑PP242,可以影響多種腫瘤細胞的發(fā)展[2]。既往的研究[3]已經(jīng)證明,PP242對HLECs的生長有抑制作用,同時有減弱促凋亡蛋白Bcl-2的作用。本研究用不同濃度PP242處理HLECs,觀察PP242對其凋亡的影響及凋亡蛋白Bax的變化,揭示 PP242對PCO的影響。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    PP242 (美國Sigma公司) ,人晶狀體上皮細胞系SRA01/04細胞株 (中國北京中國科學(xué)院腫瘤研究所) ,胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基 (美國Hyclone公司) ,Annexin V-FITC/PI 雙染流式細胞檢測試劑盒 (中國碧云天公司) ,細胞培養(yǎng)耗材 (美國Corning公司) ,兔抗人β-actin單克隆抗體、辣根酶標記的山羊抗兔lgG二抗 (美國Santa Cruz 公司) ,兔抗人Bax抗體 (美國Abcam 公司) ,β-actin mRNA引物、Bax引物 (中國上海生工生物工程有限公司) 。

    1.2 細胞分組

    對照組用含濃度為0 nmol/L PP242的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞;實驗組分別用含250、500、750、1 000 nmol/L PP242的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞,培養(yǎng)時間均為48 h。

    1.3 Annexin V/PI雙染流式細胞儀檢測細胞凋亡率

    用0.25%胰蛋白酶消化細胞,將制備的單細胞懸液加入15 mL離心管中,4 ℃的PBS洗2次。用250 μ L結(jié)合緩沖液將細胞懸浮,調(diào)整細胞數(shù)至1×106/mL,取100 μ L放入檢測管中,加5 μ L Annexin V/-FITC和10 μ L PI溶液,混勻、室溫避光、孵育15 min。加入400 μ L PBS,上流式細胞儀檢測。

    1.4 Western blotting 檢測經(jīng) PP242處理后SRA01/04的Bax蛋白表達情況

    將各實驗組細胞低溫加入裂解液,離心(13 000 r/min、4 ℃) 15 min,測蛋白濃度。每孔取50 μ L樣品行10%SDS-PAGE電泳。轉(zhuǎn)膜,封閉2 h,4 ℃封一抗 (兔抗人Bax單克隆抗體) 12 h。TBST洗15 min,3次。室溫封二抗 (辣根酶標記山羊抗小鼠抗體) 2 h,TBST洗15 min,3次。用 ECL化學(xué)發(fā)光法曝光膠片。

    1.5 實時定量PCR檢測經(jīng)PP242處理后SRA01/04的Bax mRNA表達情況

    用異硫氫酸胍-酚-氯仿法提取總RNA,測A260nm和A280nm,并計算RNA濃度。取濃度為500 ng/μ L RNA 2 μ L,逆轉(zhuǎn)錄cDNA,行實時定量PCR。β-actin 上游引物序列:5’-GTGGACATCCGCAAAGAC-3’,下游引物 序 列:5’-AAAGGG TGTAACGCAACTAA-3’;Bax上游引物序列:5’-CCGATTCATCTACCCTGCTG-3’,下游引物序列:5’- TGAGCAATTCCAGAGGCAGT-3’。取2 μ L cDNA模板,設(shè)3個復(fù)孔,兩步法擴增目的基因,40個循環(huán)行PCR反應(yīng)。計算各組 β-actin和Bax mRNA的相對表達量。

    1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

    采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件行統(tǒng)計分析,組間比較采用單因素方差分析,計量資料用x-±s表示,P <0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 Annexin V/PI雙染流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率

    如圖1所示,左下區(qū)為Annexin V-FITC和PI均陰性,表示活細胞;左上區(qū)為PI陽性,表示死亡細胞;右下區(qū)為Annexin V-FITC陽性、PI陰性,表示早期凋亡細胞;右上區(qū)為Annexin V-FITC和PI均陽性,表示死亡細胞及中晚期凋亡細胞。各實驗組(250、500、750、1 000 nmol/L) 早期凋亡率分別為7.20%±0.36%、13.77%±0.21%、16.31%±0.20%和18.67%±0.49%,與對照組(5.93%±0.61%)比較,實驗細胞早期凋亡率明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P <0.05) 。

    2.2 Western blotting法檢測經(jīng)PP242處理后SRA01/04的Bax蛋白表達情況

    如圖2所示,實驗組Bax蛋白表達水平隨PP242濃度的增加而增加。各實驗組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P < 0.05) 。

    2.3 實時定量PCR檢測經(jīng)PP242處理后SRA01/04的Bax mRNA表達情況

    各實驗組 (250、500、750、1 000 nmol/L) Bax mRNA相對表達量分別為2.157±0.125, 3.733±0.302,5.596±0.261和7.436±0.167,與對照組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P < 0.05) 。提示Bax mRNA表達量隨PP242濃度的增加而增加。

    3 討論

    圖1 各組HLEC Annexin V+PI 雙染流式細胞分析散點圖Fig.1 Flow cytometry analysis of apoptosis in HLEC after treatment with PP242

    圖2 免疫印跡法檢測經(jīng)PP242處理后SRA01/04的Bax蛋白表達情況Fig.2 Immunoblotting for Bax protein expression after treatment of cells with PP242

    PCO是晶體摘除術(shù)后最常見的并發(fā)癥[4]。目前公認的發(fā)病原因是由于手術(shù)中剩余的晶狀體上皮細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、晶狀體上皮細胞增生和移行造成后囊的皺縮,術(shù)后剩余的晶狀體上皮細胞移行過程中,形成微小細胞簇,導(dǎo)致了后囊膜的混濁和囊袋的皺縮和變形[3]。由于晶狀體手術(shù)的改良和人工晶狀體的更新,使PCO較前降低。目前治療PCO的主要方法是后囊膜截開術(shù),但手術(shù)局限性高,術(shù)后并發(fā)癥嚴重 (視網(wǎng)膜脫離、黃斑水腫等)[5]。保守治療PCO已經(jīng)成為基礎(chǔ)研究的重點。多種炎性細胞因子及生長因子可以影響晶狀體上皮細胞的凋亡,這跟腫瘤細胞相似。因此,抗腫瘤藥物是否可以用于PCO的防治是目前研究的熱點。

    磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 (phosphoinositide3-kinases/protein kinase B/mammal target of rapamycin,PI3K/AKT/mTOR) 通 路可以影響腫瘤細胞的生長[6]。激活mTOR通路對晶狀體上皮細胞有促進增殖誘導(dǎo)凋亡的作用[7]。經(jīng)典的PI3K/AKT/mTOR通路經(jīng)典的抑制劑雷帕霉素,僅影響mTORC1即可誘導(dǎo)細胞凋亡[8]。PP242對mTORC1和mTORC2均有影響,可以抑制mTOR的催化活性及其自身磷酸化[9]。因而,PP242誘導(dǎo)凋亡的作用更加顯著[10]。

    細胞凋亡是細胞程序性死亡,由多種基因影響控制[11]。促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白共同存在于細胞內(nèi),當?shù)蛲鲂盘柊l(fā)出時,2類蛋白的平衡模式被破壞,促調(diào)亡蛋白增多,細胞凋亡[12]。細胞凋亡由多種基因及細胞因子影響,主要有以下2種途徑:死亡受體通路和Bcl-2家族介導(dǎo)的線粒體通路[13]。本研究結(jié)果表明,進入早期凋亡的細胞比例隨PP242濃度的增加而逐漸增加,提示PP242可以誘導(dǎo)HLECs凋亡,并隨著濃度增加而增強。

    Bcl-2家族介導(dǎo)的線粒體通路在細胞凋亡中作用顯著[14]。在線粒體上,Bcl-2家族蛋白通過影響線粒體的穩(wěn)定性,從而影響細胞凋亡。Bcl-2家族有2種蛋白:一種是以Bax代表的促凋亡蛋白,一種是以Bcl-2為代表的抗凋亡蛋白[15]。Bax主要在線粒體外膜起破壞膜完整性的作用。細胞接到凋亡信號后,Bax增加線粒體膜通透性,促凋亡蛋白及細胞因子進入細胞質(zhì),細胞發(fā)生凋亡[16]。

    本研究結(jié)果表明,HLECs中Bax蛋白及Bax mRNA的表達隨PP242濃度的增加而逐漸增強。因此,PP242使促凋亡基因Bax的表達增高,增加了Bax對HLECs凋亡的促進作用。提示PP242是通過引起B(yǎng)ax的改變來促進HLECs的凋亡,既而表明在PP242誘導(dǎo)的HLECs凋亡過程中有Bcl-2家族介導(dǎo)的線粒體通路的參與。

    PP242可以誘導(dǎo)HLECs的凋亡,通過使促凋亡蛋白Bax的表達增加,誘導(dǎo)細胞凋亡,在PP242誘導(dǎo)的HLECs凋亡過程中有Bcl-2家族介導(dǎo)的線粒體通路的參與。然而,在本研究中僅觀察到在HLECs凋亡過程中,PP242使促凋亡蛋白 Bax表達增加,而在此過程中,PP242是否通過影響其他途徑誘導(dǎo)凋亡仍需要更多的研究來證明。

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