異氟醚對大鼠海馬組織小窩蛋白家族表達的影響

蔡琳 隋大鳴 付海鈺 査鵬 古小平 鞏固

異氟醚是一種常用的吸入性麻醉劑，能夠阻礙大腦海馬區(qū)功能并導致記憶和認知功能障礙[1]。有大量研究發(fā)現(xiàn)，誘導神經(jīng)細胞凋亡、氧化應激和線粒體功能障礙是異氟醚產(chǎn)生細胞毒性作用的主要因素[2]。小窩是已分化細胞的細胞膜上凹陷，小窩蛋白是小窩的主要成分，包含3個家族成員，即小窩蛋白1(caveolin-1，Cav-1)、Cav-2和Cav-3。Cav-1是細胞“脂筏”的重要標記蛋白，廣泛參與細胞遷移、腫瘤形成、神經(jīng)發(fā)育以及干細胞增殖活動[3]。Cav-2與Cav-1通常表達于非肌肉細胞中，而Cav-3則在肌肉細胞中表達豐富。三者在哺乳動物大腦中均有表達，參與細胞胞吞、膽固醇轉(zhuǎn)運過程，同時也參與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)/酪氨酸激酶受體B(tyrosine receptor kinase B，TrkB)、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)等多種細胞信號轉(zhuǎn)導過程，對細胞正常生命活動具有重要意義[4-6]。小窩蛋白在神經(jīng)細胞發(fā)育及正常功能中發(fā)揮不可或缺的重要作用[7-8]。本研究探索了異氟醚對小窩蛋白表達的影響及小窩蛋白的作用，旨在闡明異氟醚產(chǎn)生神經(jīng)毒性的作用機制。

1 材料和方法

1.1實驗材料HEK293細胞購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，阿糖胞苷購自上海生工，異氟醚購自上海雅培，DMEM培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清、內(nèi)切酶BamHⅠ、SalⅠ、pDC315腺病毒質(zhì)粒、腺病毒包裝質(zhì)粒、Trizol試劑、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Fast SYBRTMGreen Master Mix購自美國Thermo Fisher公司，Cav-1抗體、Cav-2抗體、Cav-3抗體、BDNF抗體、ERK1/2抗體、p-ERK1/2抗體、TrkB抗體、內(nèi)參GAPDH抗體購自美國R&D system公司，聚偏氟乙烯膜、Braford蛋白濃度測定試劑盒、噻唑藍(MTT)試劑盒、ECL試劑盒、二甲基亞砜購自江蘇碧云天生物公司。

1.2動物SPF級SD大鼠共40只，購自北京維通利華公司〔許可證號SCXK(京)2016-0006〕，雌雄各半，7周齡。隨機分為對照組、異氟醚1組(ISO1)、異氟醚2組(ISO2)、異氟醚3組(ISO3)，每組10只。

1.3方法

1.3.1異氟醚處理大鼠模型：大鼠適應性飼養(yǎng)1周，自由飲食，飼養(yǎng)溫度(21±2)℃，濕度30%～70%，12 h/12 h光照周期。調(diào)整麻醉機氣體總流量為2 L/min，對照組吸入40%氧氣2 h，ISO1、ISO2、ISO3組大鼠首先吸入3%(體積分數(shù))異氟醚，待夾尾反射消失后，分別調(diào)整異氟醚濃度為1.2%、1.8%、2.4%(均為體積分數(shù))，維持2 h，麻醉同時吸入40%氧氣。麻醉結(jié)束后待大鼠自然蘇醒。

1.3.2Morris水迷宮實驗：大鼠蘇醒24 h后進行5 d水迷宮實驗。Morris水迷宮裝置直徑1.2 m、高0.5 m，并平均劃分為四個象限，將平臺置于第二象限中央，并低于水面2 cm，水溫維持(22±4)℃。實驗前將大鼠置于水迷宮裝置熟悉環(huán)境，同時剔除不會游泳大鼠。前4 d進行定向航行實驗：將大鼠從4個象限上不同的入水點放入水中，記錄大鼠從水中尋找并爬上平臺的時間即為逃避潛伏期(escape latency)。每只大鼠每天訓練4次，每次間隔0.5 h。第5天進行空間探索實驗：將平臺撤除，將大鼠從第四象限入水點放入水中，記錄大鼠在第二象限(原平臺放置處)停留時間(總時間設定為1 min)，即為空間探索時間。

1.3.3大鼠原代海馬神經(jīng)元分離、培養(yǎng)：具體方法見參考文獻[9]。取8只初生的SD大鼠(孕鼠購自北京維通利華公司)分離兩側(cè)海馬，將組織剪碎置于離心管，加入1.25 g/L胰酶于37℃、5%(體積分數(shù))CO2培養(yǎng)箱消化20 min，然后加入含10%(體積分數(shù))胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，離心(1000 r/min，5 min)洗滌2次。隨后用200目篩網(wǎng)過濾，臺盼藍染色計數(shù)，將細胞水平調(diào)整為5×104個/mL并接種于包被有多聚賴氨酸的培養(yǎng)板上，培養(yǎng)于37℃、5%(體積分數(shù))CO2培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)3～5 d后加入終濃度為3 μg/mL的阿糖胞苷以抑制非神經(jīng)細胞的增殖。此后，海馬神經(jīng)元培養(yǎng)于含10%(體積分數(shù))馬血清的DMEM培養(yǎng)基中，每周換液3次。培養(yǎng)2周后，采集海馬神經(jīng)元備用。將海馬神經(jīng)元隨機分為對照組、異氟醚(ISO)組、對照腺病毒轉(zhuǎn)染(Ad-GFP)+ISO組、Cav-1過表達腺病毒轉(zhuǎn)染(Ad-Cav-1)+ISO組，每組樣本數(shù)10。ISO組細胞于2.4%異氟醚環(huán)境中暴露2 h，Ad-GFP+ISO組和Ad-Cav-1+ISO組細胞分別轉(zhuǎn)染腺病毒Ad-GFP和Ad-Cav-1后于2.4%異氟醚環(huán)境中暴露2 h，對照組細胞則添加等體積溶媒處理并置正常環(huán)境中培養(yǎng)。

1.3.4腺病毒過表達載體構(gòu)建與轉(zhuǎn)染：擴增Cav-1基因全長，內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ雙酶切后插入pDC315腺病毒質(zhì)粒載體(重組pDC315-Cav-1質(zhì)粒)。在脂質(zhì)體的輔助作用下，pDC315-Cav-1重組質(zhì)粒與腺病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染工具細胞HEK293。轉(zhuǎn)染48 h后反復凍融收集腺病毒Ad-Cav-1，擴增并測序，鑒定重組腺病毒。海馬神經(jīng)元細胞異氟醚處理前48 h，將海馬神經(jīng)元細胞按照1×105/孔接種于六孔細胞培養(yǎng)板上轉(zhuǎn)染腺病毒Ad-GFP或者Ad-Cav-1，轉(zhuǎn)染復數(shù)均為150 MOI。轉(zhuǎn)染24 h后，熒光顯微鏡觀察細胞轉(zhuǎn)染效率，同時利用Western blot檢測Cav-1的相對表達量。

1.3.5熒光實時定量PCR(qRT-PCR)分析：利用Trizol試劑提取大鼠海馬組織(異氟醚處理后第5天取大鼠海馬組織)或海馬神經(jīng)元細胞總RNA(異氟醚處理后24 h收集細胞)，cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈用作擴增模板。擴增體系：總體積20 μL，上、下游引物各0.5 μL，F(xiàn)ast SYBRTMGreen Master Mix 10 μL，模板 2 μL，ddH2O 7 μL。擴增條件：95℃ 2 min；94℃ 20 s，60℃ 20 s，40 個循環(huán)，溶解曲線溫度 65～95℃。使用β-actin作為定量內(nèi)參，根據(jù)PCR反應得出的循環(huán)閾值(cycle threshold value，Ct)，由2-ΔΔCt公式計算目的基因相對表達量。本實驗使用基因擴增引物有：Cav-1：上游引物5′-AGTGCATCAGCCGTGTCTAT-3′，下游引物5′-TCACGGCTGTGATAGCAACTT-3′；Cav-2：上游引物5′ -TTGGCCTTCATTGCGGGTAT-3′，下游引物5′-AGAGGAGAAGATGCGCCCTA-3′；Cav-3，上游引物5 ′-AGATCTGGAGGCACGGATCA-3′，下游引物5′-ACGCCATCGAAGCTGTAAGT-3′；β-actin，上游引物5′-GGCTCTATCCTGGCCTCACT-3′，下游引物5′ -GGTGTAAAACGCAGCTCAGTAA-3′。

1.3.6Western blot分析：異氟醚處理后第5天取大鼠海馬組織，體外細胞經(jīng)異氟醚處理后24 h收集海馬神經(jīng)元。將分離的大鼠海馬組織和海馬神經(jīng)元細胞勻漿添加RIPA裂解液〔50 mmol/L Tris(pH 7.4)、150 mmol/L氯化鈉、1%(質(zhì)量濃度)Triton X-100、1%(質(zhì)量濃度)去氧膽酸鈉、0.1%(質(zhì)量濃度)SDS、0.1 g/L PMSF〕提取總蛋白，利用Braford法測定蛋白濃度。取40 μg蛋白上樣，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白。電泳結(jié)束后將蛋白通過濕法轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜(PVDF)上，將PVDF膜用5%(質(zhì)量濃度)脫脂奶粉在室溫下封閉2 h。TPBS漂洗3次，添加第一抗體在4℃中封閉過夜。第一抗體有Cav-1抗體(1∶800)、Cav-2抗體(1∶800)、Cav-3抗體(1∶800)、BDNF抗體(1∶1000)、ERK1/2抗體(1∶1000)、p-ERK1/2抗體(1∶1000)、TrkB抗體(1∶1000)、內(nèi)參GAPDH抗體(1∶1000)。T-PBS漂洗3次，添加辣根過氧化物酶標記的兔抗小鼠第二抗體(1∶5000)于37℃孵育2 h，ECL試劑盒顯影，利用Image J軟件檢測相對表達量。

1.3.7細胞存活檢測：噻唑藍法(MTT)檢測神經(jīng)細胞存活。將細胞按1×105個/孔接種于24孔細胞培養(yǎng)板，加入10%(體積分數(shù))胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，隨后腺病毒Ad-Cav-1轉(zhuǎn)染并經(jīng)2.4%異氟醚處理后，分別于第1、2、3、4、5天進行MTT檢測。每孔加入20 μL MTT(5 mg/mL)后培養(yǎng) 4 h。去掉上清，每孔150 μL加入二甲基亞砜(DMSO)?；靹蚝笥妹笜藘x于490 nm波長下測定吸光度值。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計，符合正態(tài)性分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1Morris水迷宮實驗麻醉蘇醒后第2、3天，ISO1、ISO2和ISO3組大鼠逃避潛伏期顯著長于對照組(P<0.05)；第4天，ISO2和ISO3組大鼠逃避潛伏期明顯長于對照組和ISO1組(P<0.05)；第1、5天，4組大鼠逃避潛伏期無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。各組大鼠空間探索時間無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。結(jié)果見表1。

2.2大鼠海馬區(qū)CavmRNA表達4組大鼠海馬區(qū)Cav-1、Cav-2、Cav-3 mRNA表達水平比較均有統(tǒng)計學差異(FCav-1=104.252，F(xiàn)Cav-2=46.638，F(xiàn)Cav-3=9.264，均P<0.01)，且兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1。

表1 各組大鼠麻醉蘇醒后不同時間逃避潛伏期和空間探索時間比較(±s，s)

注：ISO1、ISO2、ISO3組：分別用異氟醚1.2%、1.8%、2.4%干預，圖1～5同；與對照組比較，aP<0.05；與ISO1組比較，bP<0.05；與ISO2組比較，cP<0.05

注：Cav：小窩蛋白，圖2、3、6、7同；與對照組比較，aP<0.05；與ISO1組比較，bP<0.05；與ISO2組比較，cP<0.05 圖 1 熒光實時定量PCR檢測各組大鼠海馬區(qū)Cav mRNA相對表達量

2.3各組大鼠海馬區(qū)Cav蛋白表達4組大鼠海馬區(qū)Cav-1、Cav-2、Cav-3 蛋白表達水平比較均有統(tǒng)計學差異(FCav-1=111.279，F(xiàn)Cav-2=45.608，F(xiàn)Cav-3=69.854，均P<0.01)，且兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2、3。

注：GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶，圖4、6同 圖 2 Western blot檢測各組大鼠海馬區(qū)Cav蛋白印跡條帶圖

注：與對照組比較，aP<0.05；與ISO1組比較，bP<0.05；與ISO2組比較，cP<0.05 圖 3 Western blot檢測各組大鼠海馬區(qū)Cav蛋白相對表達量

2.4各組大鼠海馬區(qū)BDNF、p-ERK1/2和TrkB表達各組大鼠海馬BDNF、TrkB和p-ERK1/2蛋白表達水平比較均有統(tǒng)計學差異(FBDNF=20.593，F(xiàn)TrkB=38.544，F(xiàn)p-ERK1/2=26.763，均P<0.01)；與對照組比較，ISO1、ISO2和ISO3組大鼠BDNF、TrkB和p-ERK1/2蛋白表達降低(P<0.05)。而各組大鼠ERK1/2蛋白水平比較無統(tǒng)計學差異(F=1.052，P=0.305)。見圖4、5。

注：BDNF：腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，TrkB：酪氨酸激酶受體B，ERK1/2：細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2，p-ERK1/2：磷酸化細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2；圖5同 圖 4 Western blot檢測大鼠海馬區(qū)BDNF、TrkB、ERK1/2和p-ERK1/2印跡條帶圖

注：與對照組比較，aP<0.05；與ISO1組比較，bP<0.05；與ISO2組比較，cP<0.05 圖 5 Western blot檢測大鼠海馬區(qū)BDNF、TrkB、ERK1/2和p-ERK1/2蛋白相對表達水平

2.5過表達Cav-1拮抗異氟醚誘導的細胞活性抑制與對照組比較，異氟醚處理能夠明顯降低海馬神經(jīng)元的存活，并抑制細胞Cav-1的表達(F=229.593，P<0.01)。與ISO組及Ad-GFP組比較，Ad-Cav-1組細胞Cav-1的表達增加，細胞存活率升高(F2 d=6.798，F(xiàn)3 d=40.231，F(xiàn)4 d=88.646，F(xiàn)5 d=82.765，均P<0.01)。見圖6～8。

注：ISO：異氟醚組，Ad-GFP+ISO：對照腺病毒轉(zhuǎn)染+異氟醚組，Ad-Cav-1+ISO：Cav-1過表達腺病毒轉(zhuǎn)染+異氟醚組；圖7、8同 圖 6 Western blot大鼠海馬神經(jīng)元Cav-1蛋白印跡條帶圖

注：與對照組比較，aP<0.05；與Ad-GFP+ISO組比較，bP<0.05 圖 7 Western blot檢測大鼠海馬神經(jīng)元Cav-1相對表達量

注：與對照組比較，aP<0.05；與Ad-GFP+ISO比較，bP<0.05 圖 8 大鼠海馬神經(jīng)元活性檢測(MMT法)

3 討論

異氟醚是臨床上廣泛使用的吸入性全身麻醉劑，但研究發(fā)現(xiàn)異氟醚對大腦海馬神經(jīng)元以及學習和記憶功能具有損害作用。因此闡明其作用機制對于制定相關臨床規(guī)范、減輕其副作用具有重要意義。Morris水迷宮是觀察動物模型學習和記憶功能損傷的常用經(jīng)典實驗裝置[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，盡管麻醉蘇醒后第1天各組大鼠平均逃避潛伏期無統(tǒng)計學差異，但從第2天起，各異氟醚處理組大鼠的逃避潛伏期明顯長于對照組，隨著蘇醒后時間的增加，至第5天各組大鼠平均逃避潛伏期比較差異無統(tǒng)計學意義，且各組大鼠的空間探索時間也無統(tǒng)計學差異，表明在1.2%至2.4%濃度下異氟醚對大鼠學習記憶能力的影響具有時效性；同時，在蘇醒后第4天，低劑量異醚處理大鼠的平均逃避潛伏期與對照組相當，而明顯短于另外兩處理組，提示較低劑量的異氟醚對大鼠的影響也相對較小，大鼠學習能力恢復較快。

Zhou等[11]研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠空間記憶能力與海馬區(qū)Cav-1的表達水平相關。海馬神經(jīng)元突觸可塑性影響動物的空間學習能力[12]，而Cav-1參與了海馬神經(jīng)元突觸可塑性調(diào)節(jié)[13]。本實驗在大鼠蘇醒后24 h檢測大鼠海馬組織Cav-1、Cav-2和Cav-3 mRNA和蛋白的表達，盡管在此時間點檢測大鼠學習記憶能力尚無統(tǒng)計學差異，然而細胞基因表達的變化通常對外界刺激反應較快。本實驗即發(fā)現(xiàn)，在大鼠蘇醒后24 h時間點，Cav-1、Cav-2和Cav-3 mRNA和蛋白水平均下調(diào)，表明異氟醚可作用于海馬區(qū)組織，誘導小窩蛋白家族表達變化。既往研究發(fā)現(xiàn)異氟醚可作用于海馬區(qū)神經(jīng)元并影響突觸可塑性[14]，因此異氟醚的神經(jīng)毒性作用可能與小窩蛋白有關。另有研究發(fā)現(xiàn)異氟醚能夠促進新生大鼠海馬組織p38和JNK的磷酸化而抑制ERK1/2磷酸化并誘導海馬神經(jīng)元凋亡[15-16]。本研究結(jié)果顯示，與小窩蛋白家族表達變化相對應，異氟醚處理后大鼠海馬區(qū)BDNF和TrkB的表達明顯降低，信號蛋白ERK1/2蛋白表達總量未受到異氟醚影響，然而其活化蛋白p-ERK1/2表達水平明顯降低，表明異氟醚具有抑制神經(jīng)細胞或膠質(zhì)細胞中ERK1/2信號的傳導。小窩蛋白是細胞信號傳導的重要介質(zhì)，異氟醚是否通過小窩蛋白家族影響ERK1/2信號在海馬神經(jīng)元中的傳導，尚需要進一步研究證實。

本研究體外實驗結(jié)果顯示，2.4%濃度異氟醚處理顯著降低大鼠神經(jīng)元的存活，同時下調(diào)Cav-1蛋白表達水平，進一步驗證了異氟醚對神經(jīng)元的細胞毒性作用。由于大鼠體內(nèi)Cav-1的下調(diào)幅度大于Cav-2和Cav-3蛋白(2.4%濃度)，因此本課題組利用Cav-1過表達腺病毒載體感染神經(jīng)元細胞，驗證Cav-1在大鼠海馬神經(jīng)元中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Cav-1高表達的海馬神經(jīng)元細胞存活率高于對照轉(zhuǎn)染細胞，證明Cav-1可拮抗異氟醚對神經(jīng)元的毒性作用。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，異氟醚可影響大鼠學習記憶能力并降低海馬區(qū)小窩蛋白的表達，過表達Cav-1可拮抗異氟醚的體外毒性作用。

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