烏藥醇提取物抗慢性酒精性肝損傷量效關(guān)系研究

汪洋鵬 劉磊 張光霽 何志剛 樓招歡?

烏藥為樟科植物烏藥的干燥塊根。為現(xiàn)行《中國(guó)藥典》收載的品種，含有揮發(fā)油、異喹啉生物堿及呋喃倍半萜及其內(nèi)酯三大類，具有行氣止痛，溫腎散寒等功效［1］。近年研究發(fā)現(xiàn)，烏藥能有效降低CCL4、乙硫氨酸所致肝損傷動(dòng)物血清轉(zhuǎn)氨酶水平，保護(hù)肝臟免受脂肪浸潤(rùn)［2］。烏藥不同提取物能顯著降低酒精性肝損傷模型大鼠血清TC、TG、ALT、AST含量，改善肝組織病理學(xué)改變，其中以烏藥醇提取的作用相對(duì)較優(yōu)［3-4］。2016年10月至12月作者通過實(shí)驗(yàn)研究，觀察不同劑量烏藥乙醇提取物對(duì)慢性酒精性肝損傷模型動(dòng)物血生化指標(biāo)及炎癥因子水平的干預(yù)作用，為進(jìn)一步研究烏藥抗酒精性肝損傷作用及機(jī)制提供劑量參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物 體 重18～20g的 雄 性ICR小 鼠， 購(gòu)自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：NO.1610100014，許可證號(hào)：SCXK（浙）2014-0001。在室溫（23±2）℃，相對(duì)濕度 50%～70%飼養(yǎng)環(huán)境飼養(yǎng)，自由飲水飲食。

1.2 藥物與試劑 烏藥醇提取物制備：取烏藥飲片（浙江中醫(yī)藥大學(xué)中藥飲片廠），加入10 BV量70%（v/v）乙醇，回流提取2次，提取液合并，減壓回收并濃縮至適當(dāng)體積，用蒸餾水配制成烏藥濃度為4g/kg、2g/kg、1g/kg、0.5g/kg、0.2g/kg、0.1g/kg，分裝后放置冰箱內(nèi)保存，獲得不同劑量的烏藥醇提取物；陽性對(duì)照-易善復(fù)：易善復(fù)膠囊溶于蒸餾水中，用超聲波乳化，制成2.05mg/ml的乳劑。造模試劑：紅星二鍋頭酒（酒精度52%，北京紅星股份有限公司）用時(shí)與純水按一定體積比例稀釋至所需灌胃濃度。ALT（16052001）、AST（16091901）、TC（15100801）、TG（16030301）、HDL-C（16031401）試劑盒購(gòu)自寧波美康生物科技股份有限公司；IL-6（220661232）、IL-1β（2201B61232）ELISA試劑盒購(gòu)自聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。

1.3 儀器 Powerwave340酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-TEK公司；TBA-40FR全自動(dòng)生化儀，日本東芝醫(yī)療系統(tǒng)株式會(huì)社；XHF-D高速分散器，寧波新芝生物科技股份有限公司；Heraeus Biofuge Stra冷凍離心機(jī)，德國(guó)Heraeus；wh-861渦懸混合器，太倉(cāng)市科教器材廠；DS-671電子計(jì)重秤，上海寺岡電子有限公司。

1.4 方法 （1）模型復(fù)制及給藥：取ICR小鼠，按體重隨機(jī)分為9組，即正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、易善復(fù)對(duì)照組（205.2mg/kg）、烏藥醇提取物4g/kg組、烏藥醇提取物2g/kg組、烏藥醇提取物1g/kg組、烏藥醇提取物0.5g/kg組、烏藥醇提取物0.2g/kg組、烏藥醇提取物0.1g/kg組，每組各8只。所有小鼠均給予基礎(chǔ)飼料，自由飲水飲食。除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠于每天上午8：00灌胃，按0.1ml/10g體重量給予不同濃度白酒，在2周內(nèi)白酒濃度，按30%～45%遞增，連續(xù)灌胃4周復(fù)制慢性酒精性肝損傷模型。從造模第l天起，除正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌服蒸餾水外，其余各給藥組分別灌胃相應(yīng)的藥物，1次/d，連續(xù)6周。（2）指標(biāo)檢測(cè)：①一般行為學(xué)觀察：觀察毛發(fā)、飲食狀況、運(yùn)動(dòng)情況，體重測(cè)定1次/3d。②血液生化學(xué)指標(biāo)及氧化指標(biāo)的影響：于造模2、4、6周采血，3500 r/min離心10min，分離血清，全自動(dòng)生化儀測(cè)定血清 ALT、AST、TC、TG、HDL-C水平。③血清炎癥因子水平檢測(cè)：于造模 4、6 周采血，離心制備血清，ELISA 法測(cè)定血清中IL-1β、IL-6水平。④肝臟指數(shù)檢查：實(shí)驗(yàn)期末，解剖小鼠后，快速分離肝臟，血漬用冰生理鹽水洗凈，濾紙吸干血漬，稱量肝臟質(zhì)量，計(jì)算肝指數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)ALI模型小鼠體重及肝指數(shù)的影響 與正常組比較，隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，ALI小鼠體重呈逐漸下降趨勢(shì)，其中第2、4、6周差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與模型比較，烏藥各組小鼠體重有上升趨勢(shì)，其中烏藥1g/kg組第6周差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；其余各組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與正常組比，ALI小鼠肝臟指數(shù)顯著增大（P＜0.05）；與模型組比，不同劑量烏藥組小鼠肝臟指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖 1。

圖1 不同劑量的烏藥醇提取物對(duì)ALI小鼠體重（A）以及肝臟指數(shù)（B）的影響。

2.2 對(duì)模型小鼠肝功能指標(biāo)的影響 與正常組比較，自第2周起，ALI小鼠血清ALT、AST活性隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，自造模第4周起，不同劑量烏藥醇提物均能有效降低模型小鼠ALT、AST活性，其中ALT以2g/kg、1g/kg、 0.2g/kg的烏藥組作用較為顯著（P＜0.05），0.5g/kg、0.2g/kg、0.1g/kg在6周后降低AST活性明顯（見圖 2）。

圖2 不同劑量的烏藥醇提取物對(duì)ALI小鼠肝功能指標(biāo)的影響

2.3 對(duì)模型小鼠血脂水平的影響 與正常對(duì)照組比較，ALI小鼠血清TC、HDL-C隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低趨勢(shì)。TG水平在2、4周中有上升趨勢(shì)，在第6周后有所下降，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組比較，不同劑量烏藥組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見圖3）。

圖3 不同劑量的烏藥醇提物對(duì)ALI小鼠血脂水平的影響

2.4 對(duì)模型小鼠血清炎癥因子水平的影響 在造模第4、6周，ALI小鼠與正常組小鼠相比血清IL-6、IL-1β水平均升高（P＜0.01）；用藥組與模型組比，在第4、6周，不同劑量烏藥均能降低ALI小鼠血清IL-6水平（P＜0.01），其中，以1g/kg、0.1g/kg劑量組在第4周作用相對(duì)顯著。以2g/kg、0.5g/kg、0.2g/kg、0.1g/kg烏藥醇提物能降低IL-1β水平（P＜0.01），其中，以第6周0.5g/kg烏藥醇提物最為明顯。4g/kg、1g/kg烏藥醇提物對(duì)IL-1β水平有上升作用（見圖4）。

圖4 不同劑量烏藥醇提物對(duì)ALI小鼠血清炎癥因子水平的影響

3 討論

在以往的研究過程中可知酒精性肝損傷中存在脂代謝紊亂和轉(zhuǎn)氨酶活性改變，血清ALT、AST活性及TG、HDL-C水平是急慢性酒精性肝損傷的敏感觀察指標(biāo)［5-6］。慢性酒精性肝損傷中，ALT、AST等動(dòng)態(tài)指標(biāo)水平的高低直接反映肝損傷的程度，為診斷和用藥提供方便。在本實(shí)驗(yàn)中，模型小鼠血清在2、4、6周后血清ALT、AST都呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，給予不同劑量烏藥醇提物干預(yù)4周后，能不同程度降低ALT、AST水平，其中以1g/kg、0.5g/kg、0.2g/kg烏藥組降低ALT、AST水平較為明顯。模型小鼠血清TC、HDL-C水平在造模第2周后下降；血清TG水平呈現(xiàn)先升后降變化，提示模型小鼠存在脂質(zhì)代謝紊亂現(xiàn)象。在實(shí)驗(yàn)后期，0.5g/kg、0.2g/kg、0.1g/kg烏藥醇提物組顯示拮抗HLD-C下降作用，提示這三個(gè)劑量烏藥醇提取物對(duì)酒精性肝損傷的后期有調(diào)節(jié)作用。

過量酒精攝入產(chǎn)生的腸源性內(nèi)毒素可活化NF-κB炎癥信號(hào)通路，誘導(dǎo)TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥介質(zhì)產(chǎn)生，促進(jìn)酒精性肝損傷的發(fā)生和進(jìn)展［7-8］。在本實(shí)驗(yàn)中，模型小鼠的IL-1β、IL-6水平在第4周后，呈遞增的趨勢(shì)；與模型組比較，不同劑量烏藥組均能降低IL-6水平，其中1g/kg組在4、6周較為明顯，0.1g/kg組在4周時(shí)較為顯著。2g/kg、0.5g/kg、0.2g/kg、0.1g/kg烏藥醇提物組能降低IL-1β水平，其中以0.5g/kg烏藥醇提物組最為顯著。

綜上所述，烏藥醇提取物具有抗慢性肝損傷的作用，但不同劑量烏藥醇提物對(duì)慢性肝損傷的側(cè)重點(diǎn)、強(qiáng)度和時(shí)間上有所側(cè)重。深入系統(tǒng)的成分結(jié)合藥效，有助于進(jìn)一步研究烏藥對(duì)酒精性肝損傷的作用與藥效成分，促進(jìn)臨床藥品的研發(fā)。

［1］ 中國(guó)藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2015版. 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,北京. 2015:138.

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［3］ 陳卓亮, 王軍偉, 譚明明,等. 烏藥不同提取部位對(duì)大鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用研究. 浙江中醫(yī)雜志, 2014, 49(7):538-539.

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