抑制自噬晚期階段增強榭皮素誘導的膠質(zhì)瘤細胞凋亡

高丹丹 曹軍 徐遠志 馮盡意 徐繼 周莉 劉定勝 樓美清 畢云科*

(1上海市浦東新區(qū)周浦醫(yī)院腫瘤血液科，上海 201318; 2日照市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，山東 日照 276826; 3上海交通大學附屬第一人民醫(yī)院神經(jīng)外科，上海 200080)

膠質(zhì)瘤是成人中最常見、惡性程度最高的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤[1]，多年來一直是廣大神經(jīng)外科醫(yī)師的研究熱點。雖然采取了包括手術、放化療在內(nèi)的綜合治療，但患者預后仍然不容樂觀[2]。榭皮素(quercetin, Quer)是一種存在于很多中藥中的黃酮類化合物[3]，對很多腫瘤包括膠質(zhì)瘤具有殺傷作用。Quer及其代謝物能夠透過血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)到達中樞神經(jīng)系統(tǒng)，這是膠質(zhì)瘤化療的必要條件[4]。

自噬是依賴于溶酶體的一種代謝過程，與細胞的生存、死亡有很大關系[5-6]。在很多腫瘤中都有自噬的發(fā)生，包括膠質(zhì)瘤，但自噬對腫瘤生存或死亡的影響并不清楚。研究表明，自噬在腫瘤的起始階段起抑制作用，在腫瘤的發(fā)展階段起促進作用[7]。報道顯示榭皮素能夠誘導腫瘤細胞凋亡和自噬的發(fā)生，但在膠質(zhì)瘤方面的研究很少。由于自噬是一多步代謝過程，我們猜測干擾自噬不同階段會對榭皮素的毒性有不同影響。本研究采用藥物及基因敲除的方法分別抑制了自噬的不同階段，檢測了榭皮素作用于膠質(zhì)瘤細胞系的毒性，并對其機制進行了初步探討。

材料與方法

一、材料

人源膠質(zhì)瘤細胞系U87和U251，鼠源膠質(zhì)瘤細胞系C6均來源于日本理化學研究所(Rikagaku Kenkyusho, RIKEN)細胞庫。

二、主要試劑與藥品

細胞培養(yǎng)試劑購自美國Gibco公司，轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；Western Blot試劑購自中國碧云天公司；(short hairpin RNA, shRNA)質(zhì)粒和陰性亂序?qū)φ召|(zhì)粒均購于上海吉瑪制藥技術有限公司。兔源微管相關蛋白輕鏈3(microtubule-associated proteins light chain 3, LC3)抗體，兔源Beclin 1抗體和鼠源β-actin抗體購自美國Santa Cruz公司，兔源capase-3抗體購于美國美國Cell Signaling Technology公司，二抗購于美國Bioworld公司。榭皮素、氯喹和3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine, 3-MA)購自美國Sigma公司。

三、主要實驗方法

1.細胞培養(yǎng)：所有細胞均使用改良杜氏伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco's modified essential medium, DMEM)高糖培養(yǎng)基、10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗在37 ℃的5% CO2細胞孵育箱內(nèi)培養(yǎng)，選取對數(shù)生長期細胞進行實驗。細胞長滿瓶底80%時進行細胞傳代。

2.噻唑藍比色法(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide assay, MTT)：選取對數(shù)期生長的U87和U251細胞，以5 000個/孔種植于96孔板，當細胞融合達70%時給予相應處置。之后每孔加入10 μL MTT，在37 ℃ 孵育4 h，終止培養(yǎng)。棄掉孔內(nèi)液體，避光條件下加入200 μL二甲基亞砜，放置搖床晃動10 min使結晶物充分溶解。用酶標儀于490 nm波長處測定各孔的吸光度，并記錄結果。

3.流式細胞技術：細胞經(jīng)轉(zhuǎn)染和藥物處理后，用胰酶常規(guī)消化，計數(shù)后取1×106/mL個細胞，2 000 r/min、4 ℃離心5 min，棄上清。加入1 mL預冷的磷酸鹽緩沖液 (phosphate buffer solution, PBS)，輕輕吹打細胞使之懸浮。再次2 000 r/min、4 ℃離心5 min，棄上清。將細胞重懸于190 μL磷脂結合蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶 (annexin V-fluorescein isothiocyanate/popidium iodide, Annexin V-FITC/PI)結合液，加入10 μL Annexin V-FITC輕輕混勻，避光4 ℃反應10 min。2 000 r/min、4 ℃離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC結合液，加入5 μL PI，300目濾網(wǎng)過濾，即刻流式細胞儀檢測。

4.Western Blot：細胞經(jīng)藥物處理后加入蛋白裂解液(radio-immunoprecipitation assay, RIPA)。超聲細胞破碎儀處理并離心，收集所有細胞裂解物，通過蛋白定量分析評估蛋白濃度。通過10%～15% 的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS- PAGE)進行分離，將分離的蛋白在恒壓120 V的情況下轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上。將PVDF膜浸在5% 的牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)中封閉過夜。接著將一抗結合PVDF膜于4 ℃孵育過夜，然后附著相應的二抗室溫孵育1 h。按照說明，通過標準增強化學發(fā)光法檢測標記信號。

5.細胞轉(zhuǎn)染：將細胞消化后接種于6孔板，當細胞融合達到40%～70%時準備轉(zhuǎn)染，每個轉(zhuǎn)染樣品制備DNA-Lipofectamine 2 000復合物。因質(zhì)粒中帶綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)熒光基團，轉(zhuǎn)染成功后可在熒光顯微鏡下檢測到熒光。

結 果

一、Quer抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡及自噬發(fā)生

分別用特定濃度的Quer處理U87及U251細胞系24 h、48 h，MTT檢測Quer的毒性。如圖1A所示，Quer可以抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖，呈濃度依賴趨勢；且藥物處理48 h較24 h的毒性作用明顯。為了探討Quer誘導的細胞死亡與凋亡的關系，通過Western Blot檢測了凋亡相關蛋白cleaved Caspase-3的表達。如圖1B所示，隨著Quer濃度的增加，cleaved Caspase-3的表達也越高。

為了研究Quer能否誘導自噬發(fā)生，以及其誘導的凋亡是否與自噬有關，通過透射電鏡(transmission electron microscope, TEM)及Western Blot檢測細胞的自噬水平。如圖1C所示，Quer組的胞漿內(nèi)可見很多雙層膜結構的存在，表明細胞內(nèi)自噬體的形成，而對照組沒有類似發(fā)現(xiàn)。接下來，用不同濃度的Quer分別處理細胞系16 h，Western Blot檢測LC3-II的表達。如圖1D，隨著Quer濃度的增加，LC3-II表達逐漸增加。

二、3-MA降低Quer對膠質(zhì)瘤細胞的毒性作用

3-MA可以通過抑制III型PI3K來抑制早期自噬。為了研究Quer誘導的細胞死亡與自噬的關系，我們觀察聯(lián)合3-MA后Quer對細胞的毒性。首先，MTT檢測3-MA對細胞增殖的影響，如圖2A，3-MA單藥可以抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖，且該抑制作用呈劑量依賴。隨后，我們聯(lián)用了有效濃度的3-MA(1 mM/L)及Quer(50 μM)，發(fā)現(xiàn)聯(lián)合應用比單藥Quer的毒性反而要小(圖2B)，即3-MA降低了Quer對細胞的毒性作用。

三、CQ通過阻斷晚期自噬增強Quer的毒性作用

為了進一步驗證自噬在Quer誘導的細胞凋亡中的作用，我們選用了自噬晚期抑制劑CQ。首先，經(jīng)MTT檢測CQ單藥及聯(lián)合Quer對膠質(zhì)瘤細胞的毒性。圖3A顯示，CQ單藥對膠質(zhì)瘤細胞具有較強殺傷作用。5 μM/L為實驗組中的最小濃度，對膠質(zhì)瘤細胞毒性作用較小。然而，當與50 μM/L Quer聯(lián)合應用時，顯著增強了Quer對細胞的毒性作用(圖3B)。

接下來，通過Western Blot及流式細胞技術檢測細胞凋亡，初步探討聯(lián)合用藥導致細胞死亡的機制。如前，Quer可以增強cleaved Caspase 3的表達，且呈劑量依賴性，表明Quer單藥可以誘導細胞凋亡。Western Blot顯示，與單藥組相比，聯(lián)合組cleaved Caspase-3的表達明顯增多(圖3C)，即CQ聯(lián)合Quer誘導了更多的細胞凋亡。流式結果進一步驗證CQ增強了Quer誘導的細胞凋亡。

TEM結果顯示，單獨應用50 μM/L Quer或5 μM/L CQ處理細胞時，都能誘導細胞產(chǎn)生大量的自噬體，Quer與CQ聯(lián)合用藥則誘導了更多的自噬體累積(圖3E)。累積的自噬體大部分為單層膜結構，這是晚期自噬體的特征。以上結果表明自噬體的大量累積可能是自噬降解過程被CQ阻斷所致，而自噬體的大量積累將誘導細胞凋亡。

四、敲除Beclin 1基因?qū)uer細胞毒性的影響

1.敲除Beclin 1抑制Quer誘導的自噬：鑒于化學性自噬抑制劑的非特異性，我們利用Beclin 1 shRNA敲除了兩種細胞系中的自噬關鍵基因Beclin 1。隨后，50 μM/L Quer分別處理轉(zhuǎn)染了shBeclin 1質(zhì)粒和對照質(zhì)粒的細胞。結果顯示，與vector+Quer組相比，shBeclin 1+Quer組的LC3-II蛋白表達下降明顯(圖4B、C)。以上結果表明沉默Beclin 1能有效抑制Quer誘導的自噬。

2.敲除Beclin 1減弱Quer和CQ的協(xié)同殺傷作用：為了確定Quer和CQ的協(xié)同殺傷作用是否依賴于自噬，我們分單藥及聯(lián)合處理了轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒和shBeclin 1質(zhì)粒的細胞系。如圖4A所示，敲除Beclin 1組的膠質(zhì)瘤細胞經(jīng)聯(lián)合處理后，細胞活性優(yōu)于轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒組，這表明Beclin 1聯(lián)合殺傷中起關鍵作用。為了進一步驗證Beclin 1的關鍵地位，我們進行Western Blot檢測。如圖4C所示，相比于轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒組，敲除Beclin 1組的LC3-II蛋白及Caspase 3蛋白表達明顯降低，表明Beclin 1在聯(lián)合用藥中自噬及凋亡的發(fā)生至關重要。

圖1 Quer對膠質(zhì)瘤細胞系U87和U251的作用

Fig 1 Effect of Quer treatment on glioma cell lines

A: Cell viability was determined by MTT; B: Effect of Quer on caspase 3 protein level in U87 and U251 cells; C: TEM photomicrographs of U87 and U251 cells (Arrows indicated autophagic vacuoles); D: Total cell lysates were blotted with anti-LC3 antibodies.

aP<0.05,bP<0.01,cP<0.001, NS: not significant,vscontrol group. Scale bars=2 μm.

圖2 Quer聯(lián)合3-MA對膠質(zhì)瘤細胞系的作用

Fig 2 Effects of Quer and 3-MA on glioma cell lines

A: Cell viability incubated with different concentrations of 3-MA was measured by MTT; B: U87 and U251 cells were treated with Quer (50 μM), with or without 3-MA (1 mM) for 24 h.

aP<0.05,bP<0.01,cP<0.001, NS: not significant,vscontrol group.

圖3 CQ聯(lián)合Quer對膠質(zhì)瘤細胞系的作用

Fig 3 Effects of Quer and CQ on glioma cell lines

A: Cell viability was measured by MTT; B: Cells were treated with Quer (50 μM), with or without CQ (5 μM) for 24 h; C: Total cell lysates were blotted with anti-caspase 3 antibodies; D: Cell death was assessed by flow cytometry; E: TEM photomicrographs of U87 cells (Arrows indicated AVs).

aP<0.05,bP<0.01,cP<0.001, NS: not significant,vscontrol group. Scale bars=2 μm.

圖4 敲除Beclin 1對Quer聯(lián)合CQ效果的影響

Fig 4 Effect of Beclin 1 knockdown on combination treatment of Quer and CQ

A: Cell viability was evaluated by MTT; B: Effect of Beclin 1 knockdown on Beclin 1 and LC3 protein level expression. Cell lysates were blotted with anti-Beclin 1 and anti-LC3 antibodies; C: Cell lysates were blotted with anti-Beclin 1, anti-LC3, and anti-caspase 3 antibodies.

aP<0.05,bP<0.01,cP<0.001, NS: not significant,vscontrol group.

討 論

我們揭示了榭皮素能夠抑制膠質(zhì)瘤細胞系的增殖并誘導凋亡，且促進自噬的發(fā)生。凋亡和自噬有著密切的聯(lián)系：凋亡可以起始于自噬，自噬也通常能誘導凋亡。比如，自噬體的形成是激活凋亡相關蛋白Caspase 3的一個因素[8]。此外，自噬體的大量累積會產(chǎn)生毒性并且激活凋亡[9]。我們假設聯(lián)用自噬誘導劑與自噬抑制劑導致的凋亡很可能與自噬體的大量累積有關。我們發(fā)現(xiàn)當聯(lián)合3-MA及Quer時，Quer的毒性作用有所減弱，這可能與3-MA抑制了早期自噬，自嗜體不能形成及累積有關；當聯(lián)合CQ與Quer時，Quer的毒性作用明顯增強，這可能與CQ阻斷了自嗜體與溶酶體結合，導致大量自嗜體積累有關。簡單講，大量凋亡的發(fā)生往往伴隨著待降解自噬體的累積，這與我們的假設一致。

Beclin 1是一種自噬關鍵基因。為了進一步探討Quer誘導的自噬與凋亡的關系，我們利用shBeclin 1敲除了膠質(zhì)瘤細胞系中Beclin 1的表達。結果發(fā)現(xiàn)單獨應用Quer或者聯(lián)合應用CQ處理細胞后，凋亡明顯減少。這表明CQ以依賴Beclin 1的方式增強Quer對膠質(zhì)瘤細胞的毒性作用。

總之，我們的研究表明，Quer能夠誘導膠質(zhì)瘤細胞凋亡及自噬的發(fā)生。并且，抑制自噬的早期階段減弱了Quer的細胞毒性，而抑制自噬的晚期階段增強了Quer的細胞毒性。因此，聯(lián)合應用Quer及自噬晚期抑制劑是膠質(zhì)瘤治療的一種新策略。

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