miR-144-3p分子在膠質瘤中的表達

姬麗婭 馬妮 王新來 狄政莉 史明 李三中 吳中亮*

(空軍軍醫(yī)大學西京醫(yī)院: 1神經內科; 2神經外科，陜西 西安710032; 3西安市中心醫(yī)院神經內科，陜西 西安710003)

膠質瘤因其惡性增殖、免疫逃逸、超強的侵襲和轉移能力、放化療抵抗和膠質瘤干細胞的自我更新，使得膠質瘤尤其是惡性膠質母細胞瘤的術后生存時間很短，已嚴重危害人類健康。如何針對膠質瘤細胞的以上特點，找出快速有效的治療策略成為治療膠質瘤的關鍵所在。本研究主要觀察miR-144-3p分子在膠質瘤中的表達。

材料與方法

一、材料

1.細胞系：實驗所需人源神經元細胞系HCN-2、U251膠質瘤細胞系、U87MG膠質瘤細胞系均購自ATCC細胞庫，并在論文撰寫人所在實驗室傳代保存。

2.標本收集：本實驗所需膠質瘤組織均來自于西京醫(yī)院神經外科膠質瘤患者，共30例，其中彌散性星形細胞瘤(WHO Ⅰ或Ⅱ級)共10例，間變性星形細胞瘤(WHO Ⅲ級)共10例，原發(fā)性膠質母細胞瘤(WHO Ⅳ級)共10例。正常腦組織樣本均來自西京醫(yī)院神經外科的腦外傷患者切除組織，共30例。所有標本處理均根據西京醫(yī)院的倫理和法律標準，所有參與者均簽署知情同意書。

3.實驗試劑及來源：RPMI-1640(Roswell Park Memorial Institute-1640)，DMEM ( Dulbecco's modified Eagle's medium)，胰蛋白酶，PBS(磷酸緩沖鹽溶液，phosphate buffer saline, PBS)均購置于GIBCO公司；胎牛血清購于杭州四季青；Trizol購于Invitrogen；逆轉錄試劑，實時定量PCR試劑盒購于Takara公司。

4.實驗所用主要儀器及生產公司：PCR擴增儀購置于BioRad公司；組織勻漿器，瓊脂糖凝膠電泳儀購于北京市六一儀器廠；超凈工作臺購于蘇凈集團安泰公司；電子天平購于Mettler-Tollede公司；超純水制備器購于Millipore公司；紫外凝膠成像儀購于Alpha Innotech公司；臺式高速低溫離心機購于Beckman；生物安全柜購于Nuaire公司；恒溫孵箱購于Thermo公司；實時定量PCR儀購于ABI公司；相差顯微鏡購于Olympus BX-51公司。

5.實時定量PCR引物序列：miR-144-3p基因引物序列為5'-TACAGTATAGATGATGTACT-3'。

二、方法

1.細胞培養(yǎng)及miRNA轉染：U87MG和U251細胞系培養(yǎng)：復蘇：將凍存的U87MG或U251細胞系在37 ℃水浴鍋中迅速融化解凍，一邊解凍一邊輕輕晃動凍存管，使其均勻受熱；在無菌的超凈工作臺中，將解凍后的細胞小心轉移至離心管中，加入10 mL經37 ℃水浴鍋預熱的RPMI-1640培養(yǎng)液( Roswell Park Memorial Institute-1640)，小心、充分混勻；將細胞放入臺式離心機中，12 000 r/min，離心5 min；離心完成后，在超凈工作臺中將上清培養(yǎng)液移除，用新鮮RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細胞團塊，小心吹打數次至單細胞懸液，將細胞接種于10 cm培養(yǎng)皿中；將復蘇后的細胞置于5% CO2、37 ℃恒溫孵育箱內培養(yǎng)。細胞傳代：每天觀察細胞生長密度和培養(yǎng)基顏色變化，當細胞鋪滿培養(yǎng)皿底部時，即需要傳代處理，約每3 d傳代一次；當細胞需要傳代時，小心將培養(yǎng)液吸出，加入2～3 mL無菌PBS，輕輕清洗細胞后，移除PBS；在10 cm培養(yǎng)皿中加入1～2 mL左右胰蛋白酶，放置于孵箱中消化約3～5 min，并實時觀察細胞消化情況；在培養(yǎng)皿中加入2～3 mL含血清培養(yǎng)液終止消化，吹打均勻后，將細胞懸液移至15 mL離心管中，12 000 r/min，離心5 min；離心完成后，在超凈工作臺中將上清培養(yǎng)液移除，用新鮮RPMI-1640培養(yǎng)液重懸細胞團塊，小心吹打數次至單細胞懸液，將細胞按1 ∶4比例繼續(xù)接種于10 cm培養(yǎng)皿中。

2.細胞及組織RNA提?。菏杖〈蠹s數量為1×106的膠質瘤細胞，并加入1 mL TRIzol(Invitrogen)對細胞進行消化液裂，室溫靜置約5 min以防止染色質-蛋白復合物形成，靜止后將裂解液移入1.5 mL離心管中；若樣本為腫瘤組織，則取小塊組織(約0.1 g)，加入1 mL TRIzol后，用組織勻漿器進行研磨，待組織完全磨碎后，將裂解液小心吸取移入1.5 mL離心管中；在離心管中加入五分之一體積(200 μL)氯仿，蓋緊蓋子，將離心管置于斡旋震蕩儀上劇烈震動混勻15 s后，室溫靜置2 min；將油相、水相分層的裂解液置于低溫離心機中，轉速12 000 r/min，4 ℃離心15 min；離心后溶液徹底分層，使用無RNA酶的槍頭小心吸取上層水相(無色透明狀)，并轉入干凈無RNA酶的1.5 mL離心管中，加入二分之一體積(500 μL)異丙醇，輕柔上下顛倒，使之充分混勻同時避免劇烈晃動致使染色質斷裂；4 ℃靜置10 min后，置于離心機中，轉速12 000 r/min，4 ℃低溫離心10 min；離心后可見離心管底部膠狀無色沉淀，棄去廢液，加入大約800 μL濃度為70%～75%乙醇進行洗滌，洗滌后進行離心，7 500 r/min，4 ℃低溫離心5 min；棄去廢液，并將離心管倒扣于干凈濾紙上，至乙醇全部控干揮發(fā)后，加入50 μL體積無RNA酶水進行溶解并定量，放于-70 ℃保存。

3.反轉錄PCR：將miRNA反轉錄試劑盒所包含試劑進行冰上融解，上下輕柔顛倒使之混勻，短暫離心后將試劑放置冰上待用；將已進行定量的RNA樣本取出，根據濃度計算所要加入的RNA的體積(反轉質量約為1～5 μg)，反應體系配制為2×Reaction Buffer 10 μL，Primer(引物) 1 μL，逆轉錄酶1 μL，RNA 1～5 μg，RNase Free (無RNA酶)H2O補足20 μL，總量為20 μL混勻配制完成的反應混合液，將PCR管短暫離心后，放于PCR擴增儀中，反應條件如下：37 ℃反應60 min，85 ℃反應5 s滅活處理，所得到的反轉錄產物可使用滅菌雙蒸水稀釋5～10倍后，放于-20 ℃保存。實驗中所使用到移液器吸頭和不同規(guī)格離心管，均需要提前使用濃度0.1%焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate, DEPC)溶液浸沒過夜，并經高壓滅菌、烘干后方可使用。

4.實時定量PCR：將實時定量PCR所需試劑置于冰上融解，上下輕柔顛倒使之混勻，短暫離心后將試劑放置冰上待用；按照說明書要求，冰上配制實時定量PCR反應液，體系如下：SYBR mix 10 μL，ROX 0.4 μL，10 nM miRNA Primer 0.8 μL，10 nM Common Primer 0.8 μL，cDNA 1 μL，RNase Free H2O 7 μL共20 μL混勻配制完成的實時定量PCR反應混合液，按順序加入至PCR反應八聯(lián)管中，短暫離心后，將八聯(lián)管放于實時定量PCR擴增儀中。反應條件為：95 ℃預變性2 min后，進入循環(huán)；循環(huán)內95 ℃變性30 s，60 ℃反應延伸35 s，重復40個循環(huán)。檢測miR-144-3p分子的表達量(Applied Biosystems, Life Technologies, Carlsbad, CA)，U6作為內參對照。

結 果

一、miR-144-3p分子在膠質瘤患者不同組織中的表達差異

30例腦外傷患者切除的部分組織、30例不同病理學分級膠質瘤患者的癌和癌旁組織。將不同樣品提取RNA后，檢測miR-144-3p分子基因的表達水平。檢測結果發(fā)現(xiàn)，miR-144-3p在正常腦組織中表達最高，癌旁組織中的水平高于癌組織。這提示在膠質瘤組織中miR-144-3p的豐度占優(yōu)勢，可能會發(fā)揮更重要的作用(圖1)。結果提示，miR-144-3p分子在不同組織中存在明顯的表達差異。

二、miR-144-3p分子在不同病理學分級膠質瘤中的表達差異

將50例膠質瘤患者的組織標本按照其病理學分級進行了分組，分別為5例WHO Ⅰ級膠質瘤，5例WHO Ⅱ級膠質瘤，10例WHO Ⅲ級膠質瘤和10例WHO Ⅳ級膠質瘤。并在四組之間miR-144-3p的表達量做進一步統(tǒng)計學分析。結果如圖2所示，miR-144-3p在病理學分級較低的Ⅰ或Ⅱ級膠質瘤中高水平表達，而在Ⅲ級膠質瘤中表達豐度較低，在Ⅳ級膠質瘤中表達最弱，這也與之前觀察檢測的結果相一致，miR-144-3p在腫瘤組織中低表達，并隨著惡性程度增加而逐漸降低。

三、miR-144-3p分子在不同人源膠質瘤細胞系中的表達差異

為了進一步驗證我們的結論，我們選取了不同人源膠質瘤細胞系和正常神經元細胞系，對該miRNA簇的不同分子表達水平進行鑒定檢測。miR-144-3p在正常神經元細胞系中表達都遠高于各組神經膠質瘤細胞系(圖3)。這提示，miR-144-3p分子與膠質瘤的進展密切相關，有可能參與調控膠質瘤的發(fā)生與發(fā)展。

四、miR-144-3p的表達量與患者預后相關性

將膠質瘤患者的術后生存期與miR-144-3P表達水平進行了生存分析，結果提示，miR-144-3p的表達水與膠質瘤患者的預后呈正相關(圖4)。這提示miR-144-3P分子可能在膠質瘤的進展中發(fā)揮重要作用。

圖1 miR-144-3p在不同組織中的表達情況

Fig 1 miR-144-3p was differentially expressed in normal tissues and glioma tissues

aP<0.001,vstumor group;bP<0.001,vsadjacent group;cP<0.001,vstumor group.

圖2 miR-144-3p在不同病理學分級膠質瘤中的表達

Fig 2 Expression levels of miR-144-3p in the different grades of glioma

aP<0.001,vsGrade Ⅳ;bP<0.001,vsGrade Ⅲ;cP<0.001,vsGrade Ⅳ;dP<0.05,vsGrade Ⅲ;eP<0.05,vsGrade Ⅳ.

圖3 miR-144-3p在正常神經元和膠質瘤細胞系中的表達

Fig 3 Expressions of miR-144-3p in HCN-2, U251 and U87MG

aP<0.001,vsnormal tissue group;bP<0.001,vsnormal tissue group.

圖4 miR-144-3p分子與膠質瘤患者術后生存期相關性

Fig 4 The levels of miR-144-3p were positively related to the survival days in patients with glioma

aP<0.001,vslow grade group.

討 論

目前，在哺乳動物中現(xiàn)已被發(fā)現(xiàn)證實的miRNAs多達1 000條以上，其中多數為高度保守[1-3]。每一種miRNAs都有幾個到幾十個不同數量的下游靶基因，而同一個基因又往往受到不同的miRNAs的共同調控[1-4]。人類轉錄組中超過三分之一的轉錄本都會在不同時期受到miRNsA的轉錄后修飾。值得注意的是，從初始miRNAs的轉錄，到Drosha酶的切割形成前體miRNAs，再到Dicer酶的水解形成成熟miRNAs，每一個步驟都存在嚴密而精準的調控過程[2-8]。miRNAs和不同靶基因之間存在競爭性的調控關系，在不同組織、不同細胞以及不同狀態(tài)下，由于其基因表達譜的差異，同一種miRNAs主要調控的靶基因不盡相同。正是由于miRNAs表達的精密調控和對靶基因的動態(tài)作用，使得miRNAs作為重要的表觀遺傳學調控因素，在諸如細胞增殖、細胞運動、定向發(fā)育、非對稱性發(fā)育等多種細胞學行為中發(fā)揮調控作用[8-11]。

在本課題的研究中，我們發(fā)現(xiàn)，miR-144-3p與膠質瘤的發(fā)生發(fā)展相關，并隨著其惡性分級的升高，表達逐步降低。在細胞系水平進行的體外實驗也同樣證實這一點。這些結果提示我們，miR-144-3p可能會參與膠質瘤的調控中，并且有可能作為早期診斷的分子預警標志、臨床治療的潛在靶點以及患者預后的參考標志。

在實驗中，我們還發(fā)現(xiàn)miR-144-3p與miR-451a分子簇在染色質定位上彼此相距較近，僅相隔不到100 bp左右，很有可能擁有相同的轉錄調控機制。在基因組中，有的miRNAs位于編碼蛋白的轉錄本內含子中，會跟隨宿主基因的轉錄一同被轉錄，而后在轉錄后剪切的過程中，前體miRNAs被成功剪切出來。而有的miRNAs則位于不同基因之間的區(qū)域，這些miRNAs往往具有獨立的啟動子區(qū)域和調控序列[12-13]。很顯然，miR-144-3p/miR-451a分子簇就屬于后者。我們進一步的一系列實驗均證實，miR-144-3p和miR-451a在不同樣本之間的表達趨勢均存在較好的一致性，且其兩兩之間表達水平也具有相關性。因此，很有可能miR-144-3p/miR-451a擁有共同的初始轉錄本，由于研究時間和深入程度有限，在本課題中未能解決該問題。然而這個問題卻具有很強的臨床意義，miR-144-3p在膠質瘤中表達降低的機制未明，極有可能是上游調控該分子簇的轉錄因子表達變化或者活性改變所致。因此，進一步研究miR-144-3p的轉錄起始位點對于闡明miR-144-3p在膠質瘤中的作用貢獻、調控機制以及進一步的靶向治療顯得同樣重要，這也是該課題下一步的方向之一。

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