反相液相制備色譜法結(jié)合超臨界流體制備色譜法分離純化海風(fēng)藤中的化合物

辛華夏, 彭子悅, 江大森, 傅 青*, 金 郁, 梁鑫淼,2

(1. 華東理工大學(xué)藥學(xué)院, 上海 200237; 2. 中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所, 遼寧 大連 116023)

海風(fēng)藤(piperkadsura)為胡椒科常綠攀緣藤本植物風(fēng)藤的藤莖,已被廣泛用于風(fēng)濕、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和哮喘的治療,是一種重要的藤類藥物。海風(fēng)藤中的化學(xué)成分十分豐富,主要包括木脂素、新木脂素、揮發(fā)油、生物堿、萜烯和多糖[1-5]。研究表明，海風(fēng)藤中系列新木脂素類化合物具有抗神經(jīng)炎活性[6],因此引起了人們對海風(fēng)藤化學(xué)成分研究的興趣。根據(jù)文獻(xiàn)[7,8]報(bào)道,海風(fēng)藤中化合物的分離基本采用傳統(tǒng)的植物化學(xué)方法,如系統(tǒng)溶劑法、反復(fù)硅膠柱層析法等。在前期工作中,我們發(fā)展了基于反相液相色譜(reversed-phase liquid chromatography, RPLC)和超臨界流體色譜(supercritical fluid chromatography, SFC)的分析方法,用于分離海風(fēng)藤醇提物,SFC作為第二維色譜模式,具有快速、高效的特點(diǎn)[9]。為了更深入地了解海風(fēng)藤的物質(zhì)基礎(chǔ),有必要基于高效的分離技術(shù)發(fā)展相應(yīng)的純化方法,從而快速地在海風(fēng)藤中獲取更多化合物。

近年來,SFC的應(yīng)用越來越廣泛,其在手性拆分上具有巨大優(yōu)勢[10,11],張晶等[12]研究了涂覆型多糖手性固定相在SFC和HPLC上分離手性化合物的差異;李冬艷等[13]考察了改性劑種類和濃度對基于多糖固定相的SFC手性分離的影響。另外,SFC還在制藥領(lǐng)域[14,15]和食品分析領(lǐng)域[16]表現(xiàn)出了應(yīng)用潛力,也成為天然產(chǎn)物分析和制備的有力工具[17-19]。相比于高效液相色譜法(HPLC), SFC可以極大地縮短分析時(shí)間和節(jié)約溶劑用量[20,21]。由于超臨界狀態(tài)的CO2可以通過減壓的方式快速去除,相比于制備HPLC,制備SFC的樣品后處理更加簡單、快速。此外,SFC與RPLC具有良好的分離正交性[22,23],兩者可以組合成二維色譜,為復(fù)雜體系的分離提供更高的峰容量和更好的選擇性。

本文的目的是發(fā)展RPLC和SFC的組合方法,用于海風(fēng)藤中化合物的純化,包括建立海風(fēng)藤提取和前處理方案，考察和優(yōu)化SFC條件，完成海風(fēng)藤樣品的RPLC制備和SFC制備以獲得高純度的化合物。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

ACQUITY UPC2超高效超臨界流體色譜儀(配備二元溶劑輸送泵、自動(dòng)進(jìn)樣裝置、柱管理單元、二極管陣列檢測器和背壓調(diào)節(jié)器)、Waters SFC Prep 80超臨界流體制備色譜(包括二元溶劑輸送泵、自動(dòng)進(jìn)樣裝置、二極管陣列檢測器、自動(dòng)背壓調(diào)節(jié)器、手動(dòng)壓力調(diào)節(jié)器和6個(gè)自動(dòng)餾分收集器,數(shù)據(jù)采集和處理使用SuperChrom軟件)、Alliance高效液相色譜(包括2695四元梯度泵、2489紫外可見檢測器、自動(dòng)進(jìn)樣和柱溫箱,數(shù)據(jù)采集和處理用Waters Empower 3操作軟件控制)、高效液相純化系統(tǒng)(包括2545梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、UV檢測器、2767餾分收集系統(tǒng)和Mass Lynx V4.1色譜工作站)均購于美國Waters公司;BRUKER AVANCE Ⅲ-HD 600核磁儀(氫譜600 MHz、碳譜150 MHz)。

分析色譜柱Unitary C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)、XAmide(150 mm×4.6 mm, 5 μm,酰胺鍵合固定相)和制備色譜柱Unitary C18(250 mm×20 mm, 5 μm)、XAmide (250 mm×20 mm, 5 μm)均購于浙江華譜科技有限公司。

石油醚(分析純,沸程:60～90 ℃)購于上海泰坦科技股份有限公司;甲醇(色譜純)購于山東禹王實(shí)業(yè)有限公司;二氧化碳(食品級,純度≥99.9%)購于上海振興蓋斯公司。實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q系統(tǒng)(美國Billerien公司)純化。海風(fēng)藤飲片樣品購自河北安國中藥材市場。

1.2 樣品制備

將干燥的海風(fēng)藤切碎。稱取1.0 kg藥材,加入10.0 L甲醇,回流提取1 h,過濾,然后在相同條件下重復(fù)提取1 h,合并兩次提取液,濃縮至0.6 L,加入適量水使甲醇的體積分?jǐn)?shù)為60%。葉綠素在該條件下沉淀析出,過濾除去。將濾液濃縮至干,加入10.0 g硅藻土及20.0 mL甲醇,攪拌均勻,風(fēng)干。取干燥后的樣品用500 mL石油醚提取1 h。

1.3 色譜條件

1.3.1RPLC制備條件

色譜柱:Unitary C18柱(250 mm×20 mm, 5 μm);流動(dòng)相:(A)水和(B)甲醇;流速:19.0 mL/min;樣品溶液質(zhì)量濃度:250 g/L(甲醇溶解)。梯度洗脫程序:0～40 min, 55%B～70%B; 40～60 min, 70%B～100%B。進(jìn)樣體積:1.0 mL;檢測波長:235 nm。按照色譜峰順序依次收集保留時(shí)間10 min后的色譜峰,共計(jì)18個(gè)組分(F1～F18),每個(gè)組分減壓蒸餾干燥后供SFC分離制備。

1.3.2SFC分析條件

XAmide色譜柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm);流動(dòng)相:(A)二氧化碳和(B)甲醇;柱溫:30 ℃;流速:3.0 mL/min;梯度洗脫程序:0～10 min, 2%B～10%B;背壓:13.8 MPa;進(jìn)樣體積:1.0 μL;檢測波長:235 nm。

1.3.3SFC制備條件

XAmide色譜柱(250 mm×20 mm, 5 μm);柱溫:30 ℃;流動(dòng)相:(A)二氧化碳和(B)甲醇;流速:60 g/min;背壓:15.0 MPa;進(jìn)樣體積:1.0 mL;檢測波長:235 nm。F3、F8和F12組分的樣品質(zhì)量濃度分別為200、180和150 g/L(甲醇溶解)。梯度洗脫程序:F3, 0～12 min, 3%B～8%B; F8, 0～6 min, 5%B～8%B; F12, 0～12 min, 3%B～8%B。

圖 2 石油醚層中海風(fēng)藤在不同色譜柱上的色譜圖Fig. 2 Chromatograms of the piper kadsura extracted by petroleum ether by the different chromatographic columns Modifier: methanol; backpressure: 13.8 MPa; column temperature: 30 ℃; detection wavelength: 235 nm. For columns BEH, BEH 2-EP and CSH FP (50 mm×2.1 mm, 1.7 μm), gradient elution program: 0-5 min, 1%-5% modifier in CO2; flow rate: 0.8 mL/min; injection volume: 0.2 μL. For column XAmide (150 mm×4.6 mm, 5 μm), gradient elution program: 0-5 min, 3%-8% modifier in CO2; flow rate: 3.0 mL/min; injection volume: 0.5 μL.

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理

海風(fēng)藤的甲醇提取液呈墨綠色,其中含有大量葉綠素,本文采用醇提水沉的方法將其除去。實(shí)驗(yàn)考察了樣品溶液中不同體積分?jǐn)?shù)的甲醇對葉綠素去除效果的影響。結(jié)果表明,當(dāng)甲醇的體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí),葉綠素去除效果明顯,樣品溶液變?yōu)槌蚊鞯某燃t色,液相色譜監(jiān)測顯示沒有損失目標(biāo)成分。為了進(jìn)一步降低樣品復(fù)雜性、富集目標(biāo)成分,將上述樣品濃縮后加入硅藻土進(jìn)行分散,然后采用石油醚提取,使主要的目標(biāo)成分集中在石油醚層。經(jīng)以上前處理步驟,實(shí)驗(yàn)去除了樣品中大量的葉綠素和極性相對較強(qiáng)的雜質(zhì),減少了在制備過程中對色譜柱的污染和對分離的影響,同時(shí)改善了樣品的溶解性。

2.2 反相液相制備色譜

在甲醇和水的流動(dòng)相體系下,石油醚層中海風(fēng)藤在C18色譜柱上有很好的保留,物質(zhì)的分離度和峰形都比較理想。該樣品在甲醇中溶解度良好,可配制最大質(zhì)量濃度為250 g/L的溶液。采用Unitary C18色譜柱(250 mm×20 mm, 5 μm)對樣品進(jìn)行分離,每次的進(jìn)樣量為1.0 mL,流速為19.0 mL/min。石油醚層中海風(fēng)藤的反相制備色譜圖見圖1,顯示樣品在制備水平上分離良好。為了防止組分交叉,實(shí)驗(yàn)按照色譜峰順序依次收集餾分,如圖1所示,從10 min左右的色譜峰開始收集(該流速條件下檢測延遲為2 s,收集時(shí)扣除延遲時(shí)間),共得到18個(gè)組分,依次編號(hào)為F1～F18。

圖 1 石油醚層中海風(fēng)藤的反相制備色譜圖Fig. 1 Preparation-RPLC (prep-RPLC) chromatogram of the piper kadsura extracted by petroleum ether Column: Unitary C18 (250 mm×20 mm, 5 μm); mobile phase: (A) water and (B) methanol; gradient elution program: 0-40 min, 55%B-70%B, 40-60 min, 70%B-100%B; injection volume; 1.0 mL (250 g/L methanol solution); flow rate: 19.0 mL/min; UV detection wavelength: 235 nm.

2.3 超臨界流體色譜條件的優(yōu)化

雖然經(jīng)過了反相制備色譜的高效分離,但是所得到的組分仍很復(fù)雜,為了得到純度較高的化合物,還需要進(jìn)一步純化?；谇捌诠ぷ?本實(shí)驗(yàn)采用SFC進(jìn)行第二次制備。以石油醚層中的海風(fēng)藤為實(shí)驗(yàn)對象,首先對4種常見的色譜柱BEH(雜化硅膠,50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)、BEH 2-EP(雜化硅膠表面鍵合2-乙基吡啶,50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)、CSH-FP(雜化硅膠表面帶電且鍵合氟苯基團(tuán),50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)和XAmide(150 mm×4.6 mm, 5 μm)進(jìn)行篩選(見圖2)。在相同洗脫條件下,采用BEH 2-EP色譜柱時(shí)樣品的保留時(shí)間最短,但分離選擇性和采用BEH色譜柱時(shí)較接近;樣品在CSH FP色譜柱上的保留和BEH色譜柱接近,分離效果比BEH和BEH 2-EP色譜柱好;相比于CSH FP色譜柱,XAmide色譜柱表現(xiàn)出了更好的保留和分離。在制備SFC中,采用較高比例的改性劑有利于樣品溶解和提高制備儀器的穩(wěn)定性,也有利于從分析到制備方法的轉(zhuǎn)換[22]。采用XAmide色譜柱時(shí)改性劑甲醇的體積分?jǐn)?shù)由1%～ 3%變?yōu)?%～8%。因此選擇XAmide色譜柱用于該樣品的SFC純化分離。

除色譜柱的選擇外,還需要考慮改性劑、柱溫和背壓對SFC分離效果的影響。和HPLC不同,在制備SFC中,樣品不能采用初始流動(dòng)相溶解,進(jìn)樣時(shí)可能會(huì)因?yàn)槿芙舛炔町悓?dǎo)致色譜峰變形,甚至在柱頭析出,引起壓力突然增高等問題。樣品在甲醇中溶解度良好,因此本實(shí)驗(yàn)采用甲醇作為改性劑和樣品溶解溶劑。根據(jù)文獻(xiàn)[24,25]報(bào)道,適當(dāng)降低柱溫也有利于實(shí)驗(yàn)從分析到制備方法的轉(zhuǎn)換,因此實(shí)驗(yàn)將柱溫設(shè)定為30 ℃。壓力是SFC的特征實(shí)驗(yàn)參數(shù),在制備SFC上設(shè)置背壓為15.0 MPa,在該背壓條件下組分能得到較好分離,且制備過程穩(wěn)定性較高。

圖 3 組分F1～F18的三維SFC色譜圖Fig. 3 Three-dimensional supercritical fluid chromatographic (SFC) chromatograms of the fractions F1-F18 Column: XAmide (150 mm×4.6 mm, 5 μm); modifier: methanol: gradient elution program: 0-10 min, 2%-10% modifier in CO2; flow rate: 3.0 mL/min; injection volume: 1.0 μL.

采用優(yōu)化后的SFC條件對18個(gè)組分進(jìn)行了分析(見圖3)。如圖3所示,經(jīng)SFC分離后,得到了大量的色譜峰,除了響應(yīng)強(qiáng)度較高的主峰外,響應(yīng)強(qiáng)度較小的色譜峰也被有效富集和檢測。結(jié)果說明SFC與RPLC高度正交,采用制備SFC可獲得高純度的化合物。

2.4 超臨界流體制備色譜

實(shí)驗(yàn)選擇了組成相對簡單且含量較高的組分進(jìn)行SFC制備。組分F12在反相模式下呈現(xiàn)一個(gè)主峰,主峰兩側(cè)有兩個(gè)響應(yīng)強(qiáng)度較小的色譜峰,面積歸一化法顯示主峰純度為93.3%。在制備SFC色譜圖中,除了主峰外,有多個(gè)響應(yīng)強(qiáng)度較小的色譜峰被分離出來(見圖4),說明SFC和RPLC具有良好的正交性,在反相模式下被主峰掩蓋的一些小峰在SFC制備中被分離出來。SFC制備色譜圖上主峰的峰寬為2 min,根據(jù)制備流速(60.0 g/min)和線性洗脫梯度,計(jì)算出每處理150 mg樣品,收集的流分(甲醇)體積約為9.1 mL,和制備HPLC相比,溶劑消耗量大大降低。收集的流分中超臨界二氧化碳通過揮發(fā)除去,甲醇則通過減壓旋蒸除去。經(jīng)檢測,SFC制備色譜圖中主峰的純度提高至99.4%,經(jīng)核磁鑒定并與文獻(xiàn)[26]數(shù)據(jù)對比,確定該化合物為海風(fēng)藤酮(kadsurenone)。

一些在反相模式下分離效果不理想的色譜峰在SFC上可以得到充分分離。在反相模式下,組分F8的保留時(shí)間為27 min,仍有肩峰的存在(見圖4),通過優(yōu)化洗脫條件以改善分離度較難。由制備SFC色譜圖中可以看出,在5 min之內(nèi)已快速完成了對該組分的分離,并得到4個(gè)分離度良好的色譜峰F8-1～F8-4。其中F8-1和F8-2根據(jù)峰面積積分,其色譜純度均大于95.0%,經(jīng)核磁鑒定和與文獻(xiàn)[26]數(shù)據(jù)對比,確定為其分別為南藤素(wallichinine)和玉蘭酯B(denudatin B)。而F8-3和F8-4的不對稱峰形表明它們可能仍是混合物。

主峰和鄰近小峰的分離是最為困難的,以組分F3為例,在反相模式下,組分F3呈現(xiàn)一個(gè)主峰,在主峰相鄰的位置有一些未能分離的小峰。如果采用反相色譜進(jìn)一步純化,會(huì)損失較多的樣品,另外,收集的主峰也難以達(dá)到較高的純度。當(dāng)采用制備SFC時(shí),在12 min內(nèi)可完成主峰和其附近小峰的分離,并且部分小峰之間的分離度和峰形也較好,F3-1、F3-3、F3-4和F3-6的色譜純度均在95.0%以上。但峰F3-3因?yàn)楹枯^低,無法進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,峰F3-1、F3-4和F3-6經(jīng)核磁鑒定和與文獻(xiàn)[27-29]數(shù)據(jù)對比,確定為墻草堿(pellitorine)、2E-葵烯酸N-異丁基酰胺(2E-decenoic acidN-isobutylamide)和巴豆環(huán)氧素(futoxide)。分離得到的各個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)式見圖5。

圖 4 組分F12、F8和F3的RPLC分析色譜圖和SFC制備色譜圖Fig. 4 RPLC analytical and prep-SFC chromatograms of fraction F12, F8 and F3 RPLC conditions: column, Unitary C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm); mobile phase A, water; mobile phase B, methanol; gradient elution program, 0-40 min, 55%B to 70%B, 40-60 min, 70%B to 100%B; injection volume, 10.0 μL; flow rate, 1.0 mL/min; UV detection wavelength, 235 nm. Prep-SFC conditions: column, XAmide (250 mm×20 mm, 5 μm); modifier, methanol; flow rate, 60.0 g/min; back pressure, 15.0 MPa; column temperature, 30 ℃; UV detection wavelength, 235 nm. For F12, gradient elution program: 0-12 min, 3%-8% methanol; injection volume: 1.0 mL of 150 g/L. For F8, gradient elution program: 0-6 min, 5%-8% methanol; injection volume: 1.0 mL of 180 g/L. For F3, gradient elution program: 0-12 min, 3%-8% methanol; injection volume: 1.0 mL of 200 g/L.

圖 5 海風(fēng)藤中分離得到的化合物的結(jié)構(gòu)式Fig. 5 Structural formulas of compounds separated from piper kadsura

3 結(jié)論

本文以石油醚提取層中海風(fēng)藤的醇提物為研究對象,建立了樣品前處理、RPLC制備和SFC制備的系統(tǒng)方法。海風(fēng)藤樣品在SFC模式中有很好的保留和分離,與RPLC進(jìn)行組合后,利用兩者不同的分離選擇性可以實(shí)現(xiàn)主峰的純化,難分離物質(zhì)的分離,特別是微量成分的富集和制備。本文所建立的方法為深入研究海風(fēng)藤化學(xué)成分提供可行性制備方案,同時(shí)拓展了SFC在天然產(chǎn)物分離領(lǐng)域的應(yīng)用范圍。

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