液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定雞肉中喹乙醇?xì)埩魳?biāo)示物3-甲基喹惡啉-2-羧酸

李二粉, 張媚玉, 馬合勤, 張嘉慧, 劉 戎, 曾振靈, 賀利民*

(1. 國家獸藥殘留基準(zhǔn)實驗室(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)), 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院, 廣東 廣州 510642; 2. 佛山市順德區(qū)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心, 廣東 佛山 528333)

喹乙醇屬于人工合成的喹惡啉類藥物,是20世紀(jì)70年代初由德國拜爾公司研究合成的抗菌促生長劑,抗菌譜廣。喹乙醇具有蛋白同化作用,能提高飼料轉(zhuǎn)化率[1]。但鑒于該藥物的安全性問題,歐盟和美國等相關(guān)國家已禁止喹乙醇在食品動物生產(chǎn)中使用[2],我國規(guī)定喹乙醇禁用于家禽和水產(chǎn)動物[3], 2019年5月1日起禁用于食品動物[4]。然而,受經(jīng)濟利益的驅(qū)使,喹乙醇在養(yǎng)殖業(yè)中存在非法使用現(xiàn)象。近期,在山東等地的飼料生產(chǎn)企業(yè)、養(yǎng)殖場發(fā)現(xiàn)非法添加、濫用喹乙醇藥物現(xiàn)象,對動物性食品安全構(gòu)成嚴(yán)重威脅。公眾對食品安全關(guān)注度的提升以及國際貿(mào)易對食品安全管理的嚴(yán)格性,給喹乙醇的殘留分析技術(shù)提出了更高的要求。

喹乙醇在動物體內(nèi)代謝很快,3-甲基喹惡啉-2-羧酸(MQCA)是其主要代謝物,國際食品法典委員會(CAC)認(rèn)定MQCA為喹乙醇的殘留標(biāo)示物[5]。MQCA在動物組織中主要以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在[6],通常的提取液不能將其從動物組織中提取出來,直接采用有機溶劑和酸化提取液提出、再經(jīng)液-液反萃取或固相萃取凈化的文獻有許多[7-12],但這些方法只能夠提取游離形式的少量MQCA。采用酶解[13-16]、酸解[17-19]和堿解[20,21]的水解方式較多,原理都是破壞MQCA與組織的共價結(jié)合,使其游離出來,再提取、凈化。但上述基于3種水解方式的文獻報道均是采用傳統(tǒng)的空白試樣添加評價回收率的方式來構(gòu)建分析方法,無法反映水解方式對喹乙醇給藥制備的陽性雞肉樣品的實際解離效率,導(dǎo)致基于不同水解方法測定MQCA殘留的結(jié)果產(chǎn)生大的偏差。更令人遺憾的是,這些文獻中報道的采用3種方式水解試樣后,絕大多數(shù)采用鹽酸將水解液pH調(diào)至強酸性條件,然后采用MAX混合型陰離子交換固相萃取小柱凈化。此時,MQCA的羧基(-COOH)不能夠離解,不是以負(fù)離子形式存在;相反,MQCA在強酸條件下應(yīng)該主要為喹惡啉正離子形式,因而其無法與MAX上的季銨正離子發(fā)生離子相互作用,結(jié)果MQCA的回收率都非常低。

為此,本研究采用給雞灌服喹乙醇,以制備的陽性雞肉試樣為對象,系統(tǒng)分析比較了基于酶解、酸解和堿解3種方式水解測定MQCA殘留量的結(jié)果。采用優(yōu)化后的最佳堿水解方法水解雞肉試樣,水解液直接采用MAX混合型陰離子交換固相萃取小柱凈化、富集,建立了簡便、靈敏、科學(xué)和可靠的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)測定雞肉組織中MQCA殘留的分析方法,在動物性食品中MQCA殘留的日常監(jiān)督檢測中獲得廣泛的應(yīng)用。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

LC-30A超高效液相色譜分析系統(tǒng)(日本島津公司); API 5500三重四極桿質(zhì)譜儀(美國ABI公司); Thermo D-37520型高速冷凍離心機(美國Thermo Scientific公司); SHA-B型恒溫水浴振蕩器(常州國華電器有限公司); Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司); CNW Poly-Sery MAX混合型陰離子交換固相萃取小柱(3 mL/60 mg, 60 μm,上海安譜公司)。

氫氧化鈉(上海強順化學(xué)試劑有限公司);甲醇和乙腈(色譜純,美國Fisher公司);甲酸(色譜純,德國Sigma-Aldrich公司);正己烷(分析純,廣州化學(xué)試劑廠); MQCA標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥ 99%,中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所); MQCA-d4(純度≥ 99%,加拿大Toronto Research Chemicals公司)。

健康雞購于廣東智威農(nóng)業(yè)科技股份有限公司。

1.2 陽性雞肉樣品的制備

將從市場購得的6只健康雞((1.5±0.1) kg)適應(yīng)性飼養(yǎng)一周,在確定無MQCA殘留的情況下,隨機分為空白組和給藥組。空白組3只正常飼養(yǎng),給藥組3只以40 mg/kg b. w.的劑量,每天給藥1次,連續(xù)給藥3天,分別于末次給藥后12 、24和48 h宰殺,給藥組3只雞分別命名為1號雞、2號雞和3號雞,同時相應(yīng)時間點宰殺空白雞作為對照品,分取雞肉置-20 ℃冷藏,待檢測。

1.3 前處理方法

準(zhǔn)確稱取2 g(±0.01 g)搗碎的雞肉,置于50 mL聚丙烯離心管中,加入6 mL 1 mol/L NaOH溶液,渦旋1 min后置于50 ℃恒溫水浴鍋中,振蕩水解1 h。取出冷卻,于4 ℃ 9 000 r/min離心10 min,取上清液,加入6 mL正己烷除脂,9 000 r/min離心5 min,吸取下層溶液,定容至8 mL,取4 mL過MAX小柱(預(yù)先用3 mL甲醇和3 mL 0.2% (v/v)氨水活化),依次用3 mL水洗,3 mL 2%(v/v)甲酸甲醇洗脫,洗脫液用氮氣吹干。用20%(v/v)甲醇水溶液(含0.1%(v/v)甲酸)溶解殘渣,渦旋1 min,超聲10 min后,于4 ℃ 15 000 r/min離心10 min,上機檢測。

1.4 液相色譜和質(zhì)譜條件

液相色譜條件:反相色譜柱Phenomenex Luna C18(150 mm×2 mm, 5 μm),柱溫35 ℃,流速為0.25 mL/min,流動相A為0.1%(v/v)甲酸乙腈,流動相B為0.1%甲酸水溶液。梯度洗脫程序:0.5 min, 5%A; 0.5～4.0 min, 5%A～70%A; 4.0～7.0 min, 70%A～90%A; 7.0～9.0 min, 90%A～5%A。

質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(ESI),選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)正離子模式,電噴霧電壓(IS)為4 500 V,霧化氣壓力34 kPa,氣簾氣壓力(CUR)為40 kPa,離子源溫度(TEM)為600 ℃, MQCA及其內(nèi)標(biāo)物質(zhì)譜參數(shù)見表1。

* MQCA: 3-methyl quinoline-2-carboxylic acid; quantitative ion.

1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

用甲醇配制20、 100和1000 μg/L的MQCA標(biāo)準(zhǔn)工作液和100 μg/L MQCA-d4 內(nèi)標(biāo)溶液。

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液：空白雞肉試樣按1.3節(jié)處理,獲得空白基質(zhì)提取液,用于稀釋MQCA標(biāo)準(zhǔn)溶液,制備1、2、5、10、50、100 μg/L系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作液(內(nèi)標(biāo)法均加入100 μg/L MQCA-d4內(nèi)標(biāo)溶液100 μL)。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗條件考察

2.1.13種方法水解效率的比較

分別采用酶解[14]、酸解[19]和堿解(文獻[21]方法及本文方法) 4種方式水解1號雞,2號雞和3號雞雞肉樣品(每個樣品6個平行),采用內(nèi)標(biāo)法定量,LC-MS/MS測定結(jié)果見表2。酶解和酸解方法僅檢測到1號和2號雞肉組織中低含量的MQCA殘留,而且相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)較大,3號雞均未檢出MQCA;本工作建立的堿解法則在1、 2和3號雞中都檢出了MQCA殘留,含量分別為282.0、170.4和5.9 μg/kg, 1號雞和2號雞中測得的MQCA含量分別高出酶解法和酸解法近30和20倍。這表明,由于MQCA與組織大量共價結(jié)合,采用文獻的酶解和酸解方法可能沒有全部將MQCA從組織中解離出來。為了證明這點,酶解和酸解溶液不進一步采用固相萃取凈化,將酸解液和酶解液用流動相稀釋后直接上機檢測,表明兩種方法的確均不能夠?qū)QCA從組織中有效解離出來。與堿解法相比,1號雞和2號雞的酸解效率小于15%,酶解法則小于40%。而且兩種方法都不適合在酸性條件下用MAX陰離子交換小柱凈化、富集正離子形式的MQCA。因此,水解不徹底和過柱條件不合理最終導(dǎo)致兩種方法的測定結(jié)果都非常低(1號雞和2號雞)或低濃度不能夠檢出(3號雞);而堿解法可將雞肉組織徹底分解為溶液,以共價結(jié)合存在的MQCA有效釋放出來,堿性水解液直接過MAX小柱凈化,合乎陰離子交換作用原理,策略科學(xué)合理。

2.1.2氫氧化鈉水解條件的優(yōu)化

為了獲得最佳的水解效果,在溫和的50 ℃水解溫度條件下,對氫氧化鈉溶液濃度和水解時間進行了進一步考察優(yōu)化。實驗選擇了0.5、1.0、1.5和2.0 mol/L的NaOH溶液水解雞肉試樣(2號雞),結(jié)果表明,0.5 mol/L NaOH溶液水解不充分,組織不能夠完全分解,測得的MQCA殘留量僅為49.6 μg/kg; 1.0 mol/L NaOH溶液分解組織完全,整個樣品變?yōu)榈S色溶液,MQCA測定值達159.3 μg/kg;繼續(xù)增加NaOH濃度,MQCA測定值沒有多大變化,且堿濃度過高(2.0 mol/L)時水解液過柱時流速變慢。因此,本實驗最后選擇1.0 mol/L NaOH溶液進行水解。

在優(yōu)化的NaOH溶液濃度下,對水解時間進行了考察。實驗表明,水解30 min,組織分解不徹底,結(jié)合態(tài)MQCA未完全解離,MQCA測定值為104.2 μg/kg(2號雞);延長水解時間分別到45 min和60 min,組織均分解完全,無殘渣剩余,MQCA測定值分別為160.5 μg/kg和162.3 μg/kg,結(jié)合態(tài)MQCA解離完全。因此最后選擇60 min為氫氧化鈉水解時間。

2.1.3凈化方法的確定

關(guān)于喹乙醇代謝物MQCA的測定,主要采用上述3種方式水解組織試樣。絕大多數(shù)文獻中[13-19],酶解法通常用鹽酸將水解液pH調(diào)至強酸性條件,然后和酸解法一樣過MAX固相萃取小柱。而強酸性條件下,MQCA是不能夠解離形成負(fù)離子,因而無法與MAX上的季銨正離子發(fā)生有效的離子相互作用,所以MQCA的回收率都非常低,本研究也驗證了這種凈化模式無法獲得高的回收率。雖然Huang等[20,21]報道在高溫下采用氫氧化鈉溶液水解雞肉組織中MQCA,但組織水解后也沒有直接選擇MAX混合型陰離子交換型固相萃取小柱凈化,而是將水解液繼續(xù)用濃鹽酸調(diào)至強酸環(huán)境,再連續(xù)用乙酸乙酯、甲醇以及氯仿等有機溶劑進行液-液分配,反復(fù)萃取、凈化和濃縮。操作麻煩、過程復(fù)雜,藥物損失嚴(yán)重(見表2),且消耗大量有機溶劑,既不經(jīng)濟又不環(huán)保。

本研究采用氫氧化鈉溶液充分水解雞肉組織,使MQCA完全釋放出來,水解液中MQCA羧基處于電離狀態(tài),可以直接與MAX小柱相互作用,獲得有效保留,從而達到理想的富集、凈化效果?？瞻纂u肉基質(zhì)的典型色譜圖見圖1，可以看出前處理效果較好。

表 2 采用4種不同水解方法獲得的雞肉中MQCA結(jié)果比較(n=6)

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2.2 基質(zhì)效應(yīng)

參考Achille等[22]評價MQCA測定過程中基質(zhì)效應(yīng)的計算方法,本研究測定了雞肉組織中MQCA檢測過程中的基質(zhì)效應(yīng)強度。實驗結(jié)果表明,在10 μg/L濃度水平,采用文獻[14]酶解法測定MQCA的基質(zhì)效應(yīng)為-20.5%,具有弱的離子抑制作用;酸解法[19]的基質(zhì)效應(yīng)為24.3%,具有一定的離子增強作用;本研究采用的堿解法將雞肉組織完全消化,經(jīng)正己烷除脂和稀釋,使用MAX有效去除了大量水解產(chǎn)生的氨基酸和脂肪酸小分子,凈化后基質(zhì)效應(yīng)為-18.2%,具有弱的離子抑制作用。因此,為了補償檢測過程中的基質(zhì)效應(yīng),實際樣品檢測中既可以采用基質(zhì)匹配外標(biāo)曲線校正法,也可以采用同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法進行定量。

2.3 線性關(guān)系、檢出限、定量限和回收率結(jié)果

在上述前處理研究的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了基于氫氧化鈉水解法結(jié)合LC-MS/MS測定雞肉組織中MQCA殘留的分析方法,方法學(xué)指標(biāo)見表3和表4。

由表3數(shù)據(jù)可以看出，在1.0～100.0 μg/L范圍內(nèi),MQCA的線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r2)大于0.99。

取空白雞肉樣品,加入低濃度MQCA標(biāo)準(zhǔn)工作液,制得一系列低濃度加標(biāo)樣品,按照1.3節(jié)方法處理樣品,以3倍和10倍信噪比分別計算方法的檢出限和定量限,結(jié)果表明,MQCA的檢出限和定量限分別為0.4 μg/kg和1.0 μg/kg(見表3)。

準(zhǔn)確稱取2 g(±0.01 g)切碎樣品,分別加入MQCA及其內(nèi)標(biāo)的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,制得1.0、5.0、50.0 μg/kg 3個添加水平的加標(biāo)樣品,每個濃度點共做6個平行,按照1.3節(jié)方法處理樣品,共做3個批次,每個批次間隔一天至數(shù)天,計算分析物回收率和RSD(見表4)。結(jié)果表明:采用外標(biāo)法計算,MQCA的平均回收率為71.7%～82.4%;采用內(nèi)標(biāo)法計算,其回收率為96.3%～103.7%, 2種方法的RSD分別為0.9%～4.5%和2.2%～6.0%。MQCA典型選擇反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)量色譜圖見圖1。

圖 1 MQCA和MQCA-d4的典型選擇反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)量色譜圖Fig. 1 Typical selected reactive monitoring ion chromatograms of MQCA and MQCA-d4 For MQCA: a.10 μg/L standard solution; b. blank chicken muscle extracts; c.10 μg/L matrix-matched standard solution. For MQCA-d4: a.10 μg/L internal standard solution; b. blank chicken muscle extracts; c.10 μg/L matrix-matched internal standard solution.

QuantitativemethodLinearrange/(μg/L)LinearequationCorrelationcoefficient(r2)LOD/(μg/kg)LOQ/(μg/kg)Externalstandard1.0-100.0y1=3.72×103x+1.37×1030.99860.41.0Internalstandard1.0-100.0y2=0.53x+6.87×10-30.99950.41.0

y1: peak area of MQCA;y2: peak area ratio of MQCA to MQCA-d4;x: mass concentration of MQCA, μg/L.

表 4 MQCA的加標(biāo)回收率和精密度(n=6)

3 結(jié)論

本工作基于氫氧化鈉溶液水解,混合型強陰離子固相萃取小柱直接凈化,基質(zhì)匹配外標(biāo)曲線校正法和同位素內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量,建立了簡便、靈敏和可靠的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定雞肉組織中3-甲基喹惡啉-2-羧酸殘留分析方法。方法前處理方便、有效、經(jīng)濟環(huán)保,建立的方法可廣泛應(yīng)用于動物性食品中3-甲基喹惡啉-2-羧酸殘留的日常監(jiān)測。

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[1] Chen Z L. Veterinary Pharmacology. 2nd ed. Beijing: China Agricultural Press, 2009: 278

陳杖榴. 獸醫(yī)藥理學(xué). 二版. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社, 2009: 278

[2] Chen Q, Tang S S, Jin X, et al. Food Chem Toxicol, 2009, 47(2): 328

[3] Ministry of Agriculture. No 168 Bulletin of the Ministry of Agriculture of the People’s Republic of China.(2015-11-26)http://www.ixumu.com/download-36101.html

農(nóng)業(yè)部. 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第168號. (2015-11-26)http://www.ixumu.com/download-36101.html

[4] Ministry of Agriculture. No 2638 Bulletin of the Ministry of Agriculture of the People’s Republic of China. (2018-01-12)http://www.moa.gov.cn/govpublic/SYJ/201801/t20180112_6134888.htm

農(nóng)業(yè)部. 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第2638號. (2018-01-12)http://www.moa.gov.cn/govpublic/SYJ/201801/t20180112_6134888.htm

[5] Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives. Evaluation of Certain Veterinary Drug Residues in Food, WHO Technical Report Series, 1995, 851: 19

[6] Sestakova I, Kopanica M. Talanta, 1988, 35(10): 816

[7] Wu Y J, Yu H, Wang Y L, et al. J Chromatogr A, 2007, 1146(1): 1

[8] Lü H L, Wu C M, Cheng L L, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2012, 30(1): 45

呂海鸞, 吳聰明, 程林麗, 等. 色譜, 2012, 30(1): 45

[9] Zheng L, Wu Y J, Li Y, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2012, 30(7): 660

鄭玲, 吳玉杰, 李湧, 等. 色譜, 2012, 30(7): 660

[10] Guo X, Sun Z Z, Qi J Y, et al. Journal of China Agricultural University, 2014, 19(1): 156

郭霞, 孫振中, 戚雋淵, 等. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2014, 19(1): 156

[11] Li Y S, Liu K L, Beier R C, et al. Food Chem, 2014, 160(10): 171

[12] Yi X B, Qiu L Q, Liu S Q, et al. Journal of Instrumental Analysis, 2015, 34(3): 346

易錫斌, 裘立群, 劉世琦, 等. 分析測試學(xué)報, 2015, 34(3): 346

[13] SN/T 0197-2014

[14] GB/T 20746-2006

[15] Zhao D H, Li Z G, Yang J L, et al. Chinese Journal of Analytical Laboratory, 2010, 29(9): 19

趙東豪, 黎智廣, 楊金蘭, 等. 分析試驗室, 2010, 29(9): 19

[16] Liu Z C, Yang F, Yu K J, et al. Food Science, 2012, 33(12): 210

劉正才, 楊方, 余孔捷, 等. 食品科學(xué), 2012, 33(12): 210

[17] Bei Y J, Wang Y, He F, et al. Food Science, 2013, 34(10): 255

貝亦江, 王揚, 何豐, 等. 食品科學(xué), 2013, 34(10): 255

[18] Boison J O, Lee S C, Gedir R G. Anal Chim Acta, 2009, 637(1/2): 128

[19] Zhang X J, Zheng B, Zhang H, et al. J Sep Sci, 2011, 34(4): 469

[20] Huang L L, Xiao A G, Fan S X, et al. J AOAC Int, 2005, 88(2): 472

[21] Huang L L, Wang Y L, Tao Y F, et al. J Chromatogr B, 2008, 874(1/2): 7

[22] Achille C, Giorgio F, Pierangela P, et al. Anal Chem, 2008, 80: 9343