柱前衍生-頂空氣相色譜法測(cè)定肉制品中亞硝酸鹽

王會(huì)波 劉盛田

亞硝酸鹽作為肉制品加工中的防腐劑和發(fā)色劑，可保持肉制品的色、香、味，同時(shí)對(duì)肉毒梭狀芽抱桿菌有抑制作用，具一定防腐性[1]，然而食品中殘留的亞硝酸鹽在一定條件下可與人體內(nèi)仲胺、叔胺和氨基化合物反應(yīng)形成強(qiáng)致癌物亞硝胺化合物，從而誘發(fā)消化系統(tǒng)癌變[2]。常用的亞硝酸鹽檢測(cè)方法有離子色譜法、分光光度法、熒光法、比色測(cè)定法、高效液相色法等[3-4]。本研究利用在酸性條件下亞硝酸鹽與環(huán)己基氨基磺酸鈉作用柱前衍生化生成易揮發(fā)的環(huán)己醇亞硝酸酯[5]，建立肉制品中亞硝酸鹽的頂空氣相色譜測(cè)定方法。該方法簡(jiǎn)化了前處理步驟，方法簡(jiǎn)便、線性范圍寬、檢測(cè)限低、適用范圍廣等特點(diǎn)，可用于肉制食品樣品的測(cè)定。

1 材料與方法

1.1儀器 氣相色譜儀(日本島津公司QP2010P，附FID檢測(cè)器)，頂空自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)(DANI HSS86.50型，意大利DANI公司)，Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)，DM-5毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，頂空瓶(20 mL，配帶有聚四氟膜的硅橡膠墊和鋁密封蓋)，頂空瓶瓶口密封器，研磨機(jī)(德國(guó)IKA公司)，恒溫水浴箱(北京長(zhǎng)安科學(xué)儀器公司)，高速離心機(jī)(3k15型，德國(guó)SIGMA公司)。

1.2試劑 亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液(100μg/mL，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院)，硫酸(1%，優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，環(huán)己基氨基磺酸鈉溶液(1%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司)。

1.3方法原理 被測(cè)樣品溶液置于密封的頂空瓶中，在恒定的溫度和硫酸介質(zhì)中，樣品中的亞硝酸鹽與環(huán)己基氨基磺酸鈉反應(yīng)生成環(huán)己醇亞硝酸酯，環(huán)己醇亞硝酸酯在常溫下成氣態(tài)，取液上氣相樣品用帶有FID檢測(cè)器的氣相色譜儀進(jìn)行分析，以保留時(shí)間定性，峰面積定量。

1.4儀器條件

1.4.1色譜條件： 程序升溫:初溫90 ℃，保留5 min，以15 ℃/min速率升至200 ℃，保留2 min；柱流量 1.5 mL/ min; 進(jìn)樣口溫度：200 ℃； 進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣；分流比1∶5；檢測(cè)器溫度：250 ℃。

1.4.2頂空進(jìn)樣器條件： 恒溫爐操作溫度：60 ℃；進(jìn)樣系統(tǒng)操作溫度：100 ℃；傳輸管溫度：80 ℃；樣品加熱平衡時(shí)間：30 min；補(bǔ)壓時(shí)間:20 s；取樣時(shí)間：20 s；進(jìn)樣時(shí)間：20 s。

1.5標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 用1%硫酸溶液稀釋亞硝酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液配制成0.50、1.0、2.0、5.0、10.0、25.0和50.0 μg/mL的工作溶液，然后吸取10.0 mL于頂空瓶中，配置成標(biāo)準(zhǔn)系列。

1.6樣品處理 用四分法取適量或取全部，用食物粉碎機(jī)絞碎攪勻。稱(chēng)取試樣5 g(精確至0.01 g)，以80 mL 1%硫酸洗入100 mL容量瓶中，超聲提取30 min，每5 min振搖1次，保持固相完全分散。于 75 ℃水浴中放置 5 min，取出放置至室溫，加1%硫酸稀釋至刻度。溶液經(jīng)濾紙過(guò)濾后，取部分溶液于10 000 r/min離心15 min,上清液備用。準(zhǔn)確吸取10.0 mL上清液樣品置于頂空瓶中，加入200 μL 1%環(huán)己基氨基磺酸鈉溶液，迅速用壓蓋器將頂空瓶密封，渦旋混合，待分析。

2 結(jié)果

2.1氣相色譜條件的選擇 分別選用DM-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)、RTX-624(30 m×0.32 mm×1.8 μm)、WAX(30 m×0.32 mm×0.25 μm)毛細(xì)管色譜柱進(jìn)行分離比較，經(jīng)試驗(yàn)證明，DM-5柱為最好。環(huán)已醇亞硝酸酯的保留時(shí)間為2.934 min(圖1)。

圖1 環(huán)已醇亞硝酸酯分離色譜圖

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法檢出限 配制亞硝酸鹽濃度依次為0.50、1.0、2.0、5.0、10.0、25.0和50.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列，用外標(biāo)法繪制出濃度-峰面積校正曲線。相關(guān)系數(shù)r=0.999 94，回歸方程Y=583.890X+100.263。本研究選用3倍信噪比為判斷標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算檢測(cè)量為0.2 μg，若取5 g樣品測(cè)定，測(cè)得亞硝酸鹽的最低檢出濃度0.040 mg/kg。當(dāng)樣品含量較高時(shí)，可減少取樣量或者減少進(jìn)樣量。

2.3方法的準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn) 取一根火腿腸為待測(cè)樣品，按照本方法進(jìn)行頂空和色譜分離、測(cè)定，以保留時(shí)間定性，峰面積定量,測(cè)得本底值。同時(shí)在樣品分別加入高、中、低三個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液后，做回收率試驗(yàn)和精密度試驗(yàn)(表1)。

表1 加標(biāo)回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.4本法與國(guó)標(biāo)法比較 用本法與國(guó)標(biāo)法(分光光度法)對(duì)10份不同市售肉制品樣品進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)過(guò)配對(duì)t檢驗(yàn)，t=-0.5600.05，兩種方法差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。

表2 本方法與國(guó)標(biāo)法測(cè)定亞硝酸鹽結(jié)果比較

3 討論

3.1通過(guò)對(duì)環(huán)己基氨基磺酸鈉濃度為1%時(shí)，分別加入100、200、300、400和500 μL進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示當(dāng)環(huán)己基氨基磺酸鈉加入量在200 μL以上時(shí)信號(hào)響應(yīng)不再隨環(huán)己基氨基磺酸鈉的含量增加而升高，實(shí)驗(yàn)時(shí)選擇200 μL。

3.2硫酸主要是給亞硝酸鹽酯化提供酸性環(huán)境，經(jīng)實(shí)驗(yàn)加入0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%硫酸時(shí)對(duì)檢測(cè)器的信號(hào)響應(yīng)值沒(méi)有明顯影響，選擇使用1%硫酸。

3.3一般來(lái)說(shuō)，平衡溫度越高，分析靈敏度越高，但過(guò)高的平衡溫度又會(huì)產(chǎn)生大量的水蒸氣，反而會(huì)降低響應(yīng)值[6]。選擇在10 mL樣品中加入等量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃條件下平衡30 min，在同一色譜條件下分析。結(jié)果表明隨著溫度的升高，響應(yīng)值一直在增大，但溫度過(guò)高，水量也在逐漸增大，會(huì)對(duì)檢測(cè)器有損害，因此在能滿(mǎn)足檢測(cè)限的要求下，選擇盡量低的保溫溫度，最終選擇60 ℃即可滿(mǎn)足要求。

3.4待測(cè)物質(zhì)在氣液兩相達(dá)到平衡狀態(tài)需要一定的時(shí)間，選擇在10 mL樣品中加入等量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在60 ℃條件下設(shè)平衡時(shí)間為10、20、30、40和50 min，在同一色譜條件下分析。結(jié)果表明環(huán)己醇亞硝酸酯的峰面積隨著平衡時(shí)間的延長(zhǎng)先增加然后趨于平緩，30 min后峰面積變化不明顯，故本方法先用30 min為平衡時(shí)間。

3.5頂空瓶中氣液兩相的體積比是影響靈敏度的一個(gè)參數(shù)。樣品液體取得太多，取頂空氣體的針會(huì)插入液面下，吸入樣品液體。樣品液體取得太少，靈敏度會(huì)很低。故選擇氣液體積比為1∶1，即取10 mL樣品進(jìn)行分析較為合適。

4 小結(jié)

建立了柱前衍生-頂空氣相色譜法測(cè)定肉制品中亞硝酸鹽的方法，方法的檢出限、回收率和精密度均能滿(mǎn)足肉制品中亞硝酸鹽分析的要求。結(jié)果證明該方法操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、可靠、靈敏度高，適用于肉制品中亞硝酸鹽的測(cè)定。雖只研究了肉制品中亞硝酸鹽檢測(cè)的適用性，還可利用本方法測(cè)試其他樣品中亞硝酸鹽的測(cè)定，如蔬菜、腌制食品、乳粉、葡萄酒、生活飲用水、尿液及血液等。

參考文獻(xiàn)

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